CC BY
48
УДК 664.952 + 593.9
Т.Н. Пивненко, Н.Н. Ковалев, Г.Н. Ким, Ю.М. Позднякова, А.Д. Перцева
ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК ИЗ ГОЛОТУРИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ОБРАБОТКИ
Обоснована технология получения из внутренностей голотурий масляного экстракта, содержащего в качестве биологически активных веществ каротиноиды и тритерпеновые гликозиды. Обоснованы режимы ультразвуковой обработки сырья: мощность ультразвукового воздействия, температура, продолжительность процесса. Показана зависимость экстракции биологически активных веществ от параметров процесса. Согласно разработанному методу после гомогенизирования свежих или замороженных внутренностей на них воздействовали ультразвуком с частотой 20-50 Гц, мощностью 250-300 Вт в течение 5-10 минут. Ультразвуковая обработка экстрактов проводилась с помощью прибора IKASONIC U 50. Полученные препараты, обладающие антиоксидантными и иммунозащитными свойствами, предложены в качестве БАД к пище, дополнительного источника каротиноидов, тритерпеновых гликозидов, витамина Е и полиненасыщенных жирных кислот.
Ключевые слова: голотурии, каротиноиды, тритерпеновые гликозиды, ультразвуковая обработка, БАД к пище.
T.N. Pivnenko, N.N. Kovalev, G.N. Kim, Y.M. Pozdnyakova, A.D. Pertzeva
SUBSTANTIATION OF THE TECHNOLOGY OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUPPLEMENTS WITH SEA CUCUMBERS USING ULTRASONIC TREATMENT
The technology of receiving the oily extract from holothurian internals is founded. The extract contains carotenoids and triterpen glycosides as biologically active agents. Modes of ultrasonic processing of raw materials such as power of ultrasonic effect, temperature, process duration are justified. The dependence of extraction of biologically active agents on the process parameters is shown. According to the developed method after homogenizing fresh or frozen interiors have been treated with ultrasound at 20-50 Hz, 250-300 W for 5-10 minutes. The apparatus IKASONIC U 50 has been used for ultrasonic processing of extracts. The received preparations having antioxidant and immunoprotective properties are offered as a dietary supplement, an additional source of carote-noids, triterpen glycosides, vitamin E and polyunsaturated fatty acids.
Key words: holothurians, carotenoids, triterpen glycosides, ultrasonic treatment, dietary supplement.
DOI: 10.17217/2079-0333-2016-38-36-43
Введение
Голотурии, или морские огурцы (класс Holothuroidea), - класс беспозвоночных животных типа иглокожих. Виды, употребляемые в пищу, - промысловые съедобные голотурии из родов Holothuria, Stichopus, Cucumaria. Наиболее распространены кукумария японская и трепанг дальневосточный. Биологически активные свойства голотурий кукумарии японской Cucumaria japonica и трепанга дальневосточного Apostichopus japonicus исследованы довольно широко. Основные функциональные компоненты: витамины, минеральные элементы, цереброзиды, пептиды, лектины, гликозаминогликаны и хондроитин сульфаты, а также присущие только этим животным компоненты, такие как сульфатированные полисахариды, 12-метилтетрадеканоиковая кислота (12-МТА). Особенный интерес исследователей вызывают тритерпеновые гликозиды -соединения, обладающие широким спектром действия: антимикробным, антиоксидантным, ан-тиангиогенным, противовоспалительным, иммуномодулирующим и противоопухолевым [1]. Показано, что антиоксидантными свойствами обладают как продукты, так и экстракты из трепанга [2, 3]. Эти свойства продуктов из голотурий связывают с присутствием тритерпеновых
гликозидов (ТГ), фенольных веществ, пигментов, пептидов [4, 5]. Эффективность лекарственных средств и добавок зависит от технологии обработки, обеспечивающей сохранение нативной структуры компонентов.
Исследованы иммунозащитные свойства препаратов из трепанга, имеются данные по оценке механизмов лечебного действия комплексных экстрактов из трепанга как биостимулятора жизнестойкости макроорганизма при инфекционных процессах. Комплексная характеристика антимикробного действия экстрактов из трепанга по отношению к разным группам микроорганизмов показала их эффективность в условиях прямого контакта с возбудителем. Установлено тормозящее действие комплексных экстрактов на гиперчувствительность немедленного типа и стимулирующее - на гиперчувствительность замедленного типа в процессе развития аллергии. Определены пути биостимуляции защитных сил организма путем введения комплексных экстрактов из трепанга в пищевые продукты и обозначены перспективы их использования в качестве пищевых добавок [3, 6, 7].
Существующие методы получения БАД предусматривают, прежде всего, использование экстракции органическими растворителями, а в пищевой промышленности - этанолом. Недостатками таких технологий являются применение растворителей, остатки которых могут обнаруживаться в конечном продукте, многостадийность и длительность процесса. Применение спирта усложняет технологию и требует соблюдения специальных требований к работе с органическими растворителями. Применение других гидрофобных экстрагентов, таких как жиры рыбного или растительного происхождения, позволяет получить конечные продукты с очень низким содержанием целевых компонентов (каротиноидов и тритерпеновых гликозидов). В последние годы появилось много сообщений об эффективном использовании ультразвука для экстракции биологически активных веществ растительного и животного происхождения (алкалоиды, флавоноиды, сапонины, полисахариды, белки, эссенциальные липиды) [8]. Эффективность ультразвуковой обработки подтверждается увеличением выхода целевых компонентов благодаря дополнительным механическим эффектам акустической кавитации и более глубокому проникновению в сырье экстрагента. Преимуществом использования масляных экстрактов БАВ гидрофобной природы из водно-биологического сырья является повышение их усвояемости в организме, соединение полезных свойств натуральных продуктов из сырья растительного и водного происхождения. Применение таких продуктов позволит получить качественно новый эффект за счет сбалансированного укрепляющего и предохраняющего воздействия компонентов пищевого продукта.
Цель представленной работы - обоснование способов получения масляных экстрактов из внутренних органов голотурий, обладающих биологически активными свойствами, сочетающих антиоксидантную и иммунномодулирующую направленность за счет содержания каротиноидов и тритерпеновых гликозидов.
Материалы и методы
Объектами исследования служили внутренности голотурий - кукумарии и трепанга - в свежем или замороженном виде.
Для получения экстракта использовали методы, защищенные патентом ЯИ 2562592 [9]. В качестве экстрагента использовали дезодорированное подсолнечное масло.
По первому методу после гомогенизирования свежих или замороженных внутренностей на них воздействовали ультразвуком с частотой 20-50 Гц, мощностью 250-300 Вт в течение 5-10 мин. Ультразвуковая (УЗ) обработка экстрактов проводилась с помощью прибора IKASONIC и 50 с частотой 20-50 Гц, мощностью 250-300 Вт. Затем гомогенат подкисляли до рН 4,0-5,5, выдерживали 90 мин, нейтрализовали, перемешивали с растительным маслом в соотношении 1 : 5, выдерживали при 55-60°С в течение 3 ч и отделяли масляный экстракт.
Второй способ предусматривал аналогичную обработку сырья до стадии экстракции. Затем гомогенат сушили до влажности 12%, перемешивали с растительным маслом в соотношении 1 : 3, выдерживали 6-10 ч при 55-60°С, масляный экстракт отделяли.
Количество жира, белка и воды определяли по стандартным методам, описанным в ГОСТ 7636-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки, Методы анализа».
Количественное определение каротиноидов проводили на спектрофотометре «иУ-2100» (Shimadzu, Япония). Концентрацию каротиноидов рассчитывали по формуле:
С (мг/100 г сырой ткани) = (А450 ■ V • 100) / 250 • т,
где А450 - оптическая плотность исследуемого раствора при 450 нм; V - объем экстрагента, мл; т - масса навески сырой ткани, г; 250 - средний удельный коэффициент поглощения каротиноидов, мл см мг \
Содержание тритерпеновых гликозидов определяли с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии [10].
Для исследования биологической активности использовали неинбредных мышей массой 14-16 г, находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Мышам из двух опытных групп (8 особей в группе) в течение 21 дня вводили перорально масляный экстракт из голотурий в дозах 50 и 0,5 мкл на мышь. Контрольной группе вводили физраствор. По истечении этого срока отбирали и исследовали внутрибрюшинную жидкость, содержащую нейтрофилы. Для определения антиоксидантной активности использовали плазму крови мышей вышеуказанных групп. Общую антиоксидантную активность плазмы крови (АОА) определяли по величине торможения пере-кисного окисления липидов в модельной системе, содержащей желточные липопротеиды [11].
Результаты и обсуждение
Использование УЗ обработки животного сырья обеспечивает не только измельчение компонентов, но и активацию химических процессов, увеличение реакционной способности веществ, ускорение процессов растворения, а также позволяет разрушать меж- и внутримолекулярные связи бел-ково-липидных комплексов, что способствует наиболее полному переходу каротиноидов в раствор. Кроме того УЗ обработка позволяет получать стабильные водно-жировые эмульсии, что также важно для создания пищевых продуктов и биологически активных добавок. Процесс растворения в таких условиях является достаточно быстрым и не требует большого расхода реагентов. Однако ме-хано-химическая обработка сопровождается изменением условий реакционной среды, что не всегда благоприятно сказывается на лабильных веществах, к которым относятся каротиноиды. Поэтому важно было выявить рациональные условия УЗ обработки для каждого вида сырья.
Полученные масляные экстракты из внутренностей голотурий представляли собой ярко-желтую или оранжевую жидкость, содержащую сложную смесь, включающую каротиноиды (15-26 мг/ 100 мл) и тритерпеновые гликозиды (1,3-2,0 мг/мл). Для обоснования условий экстракции использовали изменения количества каротиноидов при различных условиях обработки. При тех же условиях тритерпеновые гликозиды оставались стабильными. В табл. 1 показаны результаты, обосновывающие параметры УЗ обработки (на примере трепанга) при получении масляных экстрактов из внутренностей голотурий. Для внутренностей кукумарии результаты были аналогичными.
Таблица 1
Влияние мощности и времени УЗ воздействия на температуру гомогената и экстракцию каротиноидов из мороженых внутренностей трепанга
Мощность, Вт/см Время воздействия, мин Температура гомогената, °С Концентрация, мг/100 мл
0 10 37 7
200 3 35 7
5 40 10
10 44 14
250 3 42 15
5 45 17
10 48 17
15 52 17
300 3 58 15
5 61 18
10 72 10
15 80 8
350 10 86 5
15 91 2
Показано, что мощность УЗ воздействия влияет на температуру обрабатываемого сырья. Как известно, увеличение температуры более 60°С неблагоприятно для сохранения нативной структуры каротиноидов и усиливает окислительные процессы в жирах. Поэтому при исследовании влияния УЗ воздействия на температуру обрабатываемого сырья подбирали мощность и продолжительность, не вызывающие повышения температуры выше указанного значения. В условиях мощности 250-300 Вт/см в течение 10-5 мин значение температуры не превышало заданных значений, и концентрация экстрагируемых каротиноидов была наиболее высока. Снижение мощности приводило к уменьшению концентрации каротиноидов, а ее увеличение вызывало их частичное разрушение. Снижение времени воздействия до 5 мин и менее приводило к уменьшению концентрации каротиноидов, а увеличение более чем на 10 мин вызывало их разрушение. Обоснование температурно-временных параметров экстракции и соотношения сырье : экстра-гент представлено на рис. 1 и 2, соответственно. Исследования касались каротиноидов как наиболее лабильных БАВ данного сырья.
Рис. 1. Зависимость экстракции каротиноидов из мороженых внутренностей голотурий от времени экстракции при мощности УЗ воздействия 259 Вт/см
Рис. 2. Зависимость экстракции каротиноидов из мороженых внутренностей голотурий от соотношения сырье: экстрагент при температуре 50°С
При экстрагировании свежих или мороженых внутренностей, благодаря присутствию естественной влаги, образовывалось три фазы: осадок, водно-масляная эмульсия и непосредственно масляный экстракт. Для того чтобы при фильтровании не происходило смешивания водно -масляной фазы и экстракта перед фильтрацией проводили декантацию, при которой наблюдали частичную потерю объема экстракта. При соотношении сырье : экстрагент 1 : 1 концентрация каротиноидов была наибольшей. Однако при отделении экстракта от осадка наблюдали значительную потерю объема экстракта, поскольку большая часть используемого масла оставалась в водно-масляной фазе и осадке. При соотношении 1 : 3 потери были наименьшими, а снижение концентрации компенсировалось увеличением суммарного выхода.
На рис. 3 представлена зависимость экстракции каротиноидов из мороженых внутренностей голотурий от времени экстракции обработанного УЗ сырья.
Рис. 3. Зависимость экстракции каротиноидов из мороженых внутренностей голотурий, обработанных УЗ, от времени (соотношение 1 : 3, температура 50°С)
Как следует из данных рис. 3, оптимальное время экстрагирования - 3 ч, увеличение времени экстрагирования не имеет технологического смысла.
При использовании сухих внутренностей проводили сублимирование гомогената после УЗ обработки в вышеуказанных условиях. Далее внутренности экстрагировали растительным маслом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 3 при температуре 55-60°C в течение 3-10 ч. При этом образуется две фазы: осадок и экстракт, который легко отделяется фильтрованием. После этого проводили вторичную экстракцию, используя новую порцию сухих внутренностей и полученный первичный экстракт в качестве экстрагента при соотношении сырье : экстрагент 1 : 5 - 1 : 10 при температуре 55-60°C, в течение 3-10 ч. Обоснование таких параметров вытекает из результатов, приведенных на рис. 4-6.
Температура, °С Рис. 4. Зависимость экстракции каротиноидов из сухих внутренностей голотурий от температуры
Рис. 5. Зависимость экстракции каротиноидов из сухих внутренностей голотурий от времени первичной экстракции (соотношение 1 : 3, температура 60°C)
б
Рис. 6. Зависимость экстракции каротиноидов из сухих внутренностей голотурии от соотношения сырье : экстрагент: а - первичная экстракция; б - вторичная экстракция
Показано, что рационально проводить экстрагирование при температуре экстрагирования 50-60°С, увеличение температуры неблагоприятно для сохранения нативной структуры каротиноидов.
Как следует из данных рис. 4, оптимальное время экстрагирования 6-10 ч, увеличение времени экстрагирования не имеет технологического смысла, снижение времени не обеспечивает максимальной концентрации.
Как следует из данных рис. 5, оптимальные соотношения сырье : экстрагент при использовании сушеных внутренностей при первичной экстракции 1 : 3 и 1 : 5, при вторичной - 1 : 5 и 1 : 7. Увеличение соотношения приводит к некоторому снижению концентрации каротиноидов, однако увеличивает суммарный выход продукта.
Таким образом, разработанная технология позволяет получать из внутренностей голотурий масляные экстракты, содержащие каротиноиды и тритерпеновые гликозиды, проявляющие ан-тиоксидантные и иммунозащитные свойства. Полученный согласно разработанному способу масляный экстракт был исследован в отношении его антиоксидантного действия (табл. 2).
Таблица 2
Исследование влияния масляного экстракта из внутренностей трепанга на антиокислительную активность плазмы крови мышей
Исследуемая группа Доза ОАО, %
Контроль - 15,2±0,5
Масляный экстракт из голотурий 0,5 мкл/мышь 26,5±3,6
Масляный экстракт из голотурий 50 мкл/мышь 32,0+3,1
Полученные результаты свидетельствуют о том, что масляный экстракт из голотурий тормозит перекисное окисление липидов в модельной системе, содержащей желточные липопротеиды, то есть обладает антиокислительными свойствами.
а
Для оценки иммунотропной активности каротиноидов масляных экстрактов внутренностей голотурий использовали НСТ-тест (тест восстановления нитросинего тетразолия), который отражает бактерицидную активность фагоцитов, то есть способность уничтожать микробные клетки. Принцип теста состоит в том, что при активации фагоцитирующих клеток происходит восстановление растворимого бесцветного тетразолия нитросинего в диформазан, который распределяется в цитоплазме или на поверхности фагоцитов в виде гранул, окрашенных в темно-синий цвет. Этот тест отражает степень активации кислородозависимых механизмов бактерицидной активности фагоцитирующих клеток. По информативности НСТ-тест превосходит все другие цитохимические методы оценки активности фагоцитирующих клеток [12].
При исследовании бактерицидной активности нейтрофилов перитонеальной полости мышей установлено, что полученные препараты стимулируют данную активность. Фиксируемая оптическая плотность контрольного образца (без введения препарата) составила 93,4 ±1,2 единиц, после введения в пробу препарата 50 мкл и 0,5 мкл оптическая плотность составила 107,8 ±3,9 и 104,1±1,5 единиц, соответственно.
На основе проведенных исследований разработана и утверждена нормативная документация, позволяющая выпускать данные препараты в виде БАД к пище «Бальзам из трепанга масляный». Содержащиеся в БАД витамин Е и полиненасыщенные жирные кислоты (из подсолнечного масла) помимо хорошо известных положительных эффектов обеспечивают более полное усвоение БАД трепанга и предохраняют их от окисления. БАД к пище рекомендовано выпускать во флаконах с массой содержимого 100 г, а также и в виде капсул с массой содержимого 1,0 г (табл. 3).
Таблица 3
Содержание биологически активных веществ в БАД к пище «Бальзам из трепанга масляный»
Суточная доза БАД Содержание каротиноидов, мг % от рекомендуемого суточного потребления Содержание ПНЖК, г % от рекомендуемого суточного потребления Содержание витамина Е, мг % от рекомендуемого суточного потребления
10 г жидкости 0,75 15 4 36 7 67
12 капсул 0,9 18 4,8 43 10 95
Жидкий масляный экстракт рекомендуется употреблять взрослым с приемом пищи по 5 г (1 ч. ложка) два раза в день, в этом количестве содержится 0,75 мг каротиноидов, что составляет 15% от рекомендуемого суточного потребления (5 мг/сутки для бета-каротина). В этом количестве также содержится 4 г ПНЖК, что составляет 36% от рекомендуемого суточного потребления и 7 мг витамина Е, что составляет 67% от рекомендуемого суточного потребления. Капсулы с массой содержимого 1,0 г рекомендуется принимать с приемом пищи по 4 шт. три раза в день, в них содержится 1,5 мг каротиноидов, что составляет 10% от рекомендуемого суточного потребления каротиноидов. Тритерпеновые гликозиды не указаны в этой таблице, так как эти вещества не регламентированы нормативными документами, такими как методические рекомендации «Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ» МР 2.3.1.1915-04. Тем не менее они обозначены в технических условиях на БАД к пище «Бальзам из трепанга масляный» как дополнительные компоненты. Полученные препараты прошли экспертизу органов Роспотреб-надзора, по показателям безопасности они соответствуют необходимым требованиям.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что исследованная и обоснованная технология экстракции биологически активных веществ из голотурий с помощью ультразвукового воздействия позволяет перевести их в жирорастворимое состояние для обеспечения наиболее полного усвоения. Выбранные режимы обеспечивают получение препаратов с высокой концентрацией функциональных компонентов, обеспечивающей не менее 15% от рекомендуемого суточного потребления. Это позволяет рекомендовать их в качестве БАД к пище.
Литература
1. Ковалев Н.Н., Пивненко Т.Н., Ким Г.Н. Анализ рынка биологически активной продукции из промысловых голотурий (Echinodermata.Holothuroidea): сырье и технологии // Рыбное хозяйство. - 2016. - № 2. - С. 112-116.
2. Zhong Y., Khan М.А., Shanidi F. Compositional characteristics and antioxidant properties of fresh and processed sea cucumber (Cucumaria frondosa) // Journal of agricultural and food chemistry. -V. 55. - № 4. - 2007. - P. 1188-1192
3. Mulyndin V.A., Kovalev V.V. Effect extraction of internal organs of holothurian Cucumariaja-ponica on the indices nonspecific resistance // Rus. J. marine biol. - 2001. - V. 27 (6) - P. 406-408.
4. Sun P., Yi Y.H., Li L., Tang H.F. Recourse, chemical structure and characteristics of triterpene glycosides from sea cucumber (order Aspidochiritida) // Chinese journal of natural medicines. - 2007. -V. 5(6). - P. 463-469.
5. Huizeng F. Sea cucumber: Ginseng of sea // Zhongguo Mar. Med. - 2001. - № 82. - P. 37-44.
6. Любавская Т.А. Антимикробные и иммуномодулирующие свойства комплексных экстрактов из трепанга японского: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 1996. - 29 с.
7. Эффективность биологически активных добавок из голотурий и совершенствование технологии их получения / В.Н. Акулин, К.Г. Павель, Т.Н. Слуцкая, Г.Н. Тимчишина, Е.В. Якуш // Изв. ТИНРО. - 2012. - Т. 170. - С. 291-298.
8. Wu J., Lin L., Chau F. Ultrasound-assisted extraction of Ginseng saponins from Ginseng roots and cultured Ginseng cells // Ultrasonics Sonochem. - 2001. - № 8. - Р. 347-352.
9. Способ получения масляного экстракта из голотурий, обладающего биологически активными свойствами (варианты): пат. 2562592 Рос. Федерация. № 2562592; заявл. 23.10.2013; опубл. 27.04.2015, Бюл. № 12.
10. Чумак А.Д., Павель К.Г., Тимчишина Г.Н. Определение тритерпеновых гликозидов в голотуриях // Известия ТИНРО-центра. - 1995. - Т. 118. - С. 36-40
11.Бородин Е.А., Арчаков А.И. Стабилизация и реактивация цитохрома Р-450 фосфатидил-холином при перекисном окислении липидов // Биол. мембраны. - 1987. - № 7. - С. 719-728.
12. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунология в клинической практике. - М.: Наука, 1990. - 224 с.
Информация об авторах Information about authors
Пивненко Татьяна Николаевна - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйст-венный университет; 690087, Россия, Владивосток; доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии»; tnpivnenko@mail.ru
Pivnenko Tatyana Nikolaevna - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Doctor of Biological Sciences, Professor, Chief Researcher of Research Center «Marine Biotechnologies»; tnpivnenko@mail.ru
Ковалев Николай Николаевич - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйствен-ный университет; 90087, Россия, Владивосток; доктор биологических наук, главный научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии»; kovalevnn61@yandex.ru
Kovalev Nicolay Nicolaevich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Chief Researcher of Research Center «Marine Biotechnologies»; kovalevnn61@yandex.ru
Ким Георгий Николаевич - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет; 90087, Россия, Владивосток; доктор технических наук, ректор ФГБОУ ВО «Дальрыбвтуз»; festfu@mail.ru
Kim Georgiy Nikolaevich - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Doctor of Technical Sciences, Professor, Rector of Far Eastern State Technical Fisheries University; festfu@mail.ru
Позднякова Юлия Михайловна - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйст-венный университет; 90087, Россия, Владивосток; кандидат технических наук, директор НИЦ «Морские биотехнологии»; pozdnyakova.julia@yandex.ru
Pozdnyakova Yuliya Mikhailovna - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Candidate of Technical Sciences, Director of Research Center «Marine Biotechnologies»; pozdnyakova.julia@yandex.ru
Перцева Анна Дмитриевна - Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет; 90087, Россия, Владивосток; научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии»; 50@mail.ru
Pertzeva Anna Dmitrievna - Far Eastern State Technical Fisheries University; 690087, Russia, Vladivostok; Researcher of Research Center «Marine Biotechnologies»; 50@mail.ru
