CC BY
128
УДК 582.998.1:543.422.3:54.062
О СОДЕРЖАНИИ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В СОЦВЕТИЯХ БАРХАТЦЕВ РАСПРОСТЁРТЫХ
ABOUT THE CONTENT OF TANNINS IN INFLORESCENCES OF TAGETES PATULA L.
Н.М. Червонная, О.А. Андреева, И.И. Харченко N.M. Chervonnaya, O.A. Andreeva, I.I. Harchenko
Пятигорский медико-фармацевтический институт — филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России Россия, 357532, г. Пятигорск, проспект Калинина, 11
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, a branch of the Volgograd State Medical University
Russia, 357532, Pyatigorsk, Kalinin Av., 11
E-mail: nadezhda.chervonnaya@yandex.ru
Аннотация. Методом ВЭЖХ установлено наличие танина, галловой кислоты и ЭГКГаллата в соцветиях бархатцев распростёртых. С помощью качественных реакций выявлена локализация этих веществ в обёртках соцветий. Количественное содержание дубильных веществ в водном и 40%-ном спиртовом извлечениях определяли перманганатометрически (метод 1) и спектрофотометрически (метод 2). Расчёты показывают, что в водном извлечении их содержание составляет 0.45+0.02% (метод 1) и 0.18+0.01% в пересчёте на галловую кислоту (метод 2), а в 40%-ном спиртовом извлечении - 0.7+0.03% и 0.32+0.01% соответственно.
Resume. By using HPLC we have established the presence of tannin, gallic acid, and epigallocatechin gallate in Tagetes patula L. inflorescences. With the use of qualitative responses we have revealed the localization of these substances in spathes. Qualitative content of tannins in water and 40% alcohol extracts was determined by using permanganatometry (method 1) and spectrophotometry (method 2). The calculations showed that their content in water extract amounted to 0.45+0.02% (method 1) and 0.18+0.01% in terms of gallic acid (method 2), and the content in 40% alcohol extract amounted to 0.7+0.03% and 0.32 ±0.01% respectively.
Ключевые слова: бархатцы распростертые, дубильные вещества, количественное определение, пер-манганатометрический метод, спуктрофотометрический метод.
Keywords: Tagetes patula L (Asteracae), tannins, quantitative determination, permanganatometry, spectrophotometry.
Введение
Бархатцы распростёртые -Tagetes patula L. (Asteracae) - декоративные растения, широко распространённые на Северном Кавказе, отвары из цветков которых издавна применяются в народной медицине при лечении некоторых заболеваний [Василенко, 1990]. Изучение биологической активности различных субстанций, выделенных из соцветий, показало их способность стимулировать и нормализовать процессы желчеобразования и желчевыделения [Терехов, 2006], влиять на систему глутатиона, и, следовательно, восстанавливать антиоксидантные и детоксикацион-ные процессы в клетках желудка [Папаяни, 2012]. Перечисленные виды биологической активности, в первую очередь, связывают с флавоноидами и фенолокислотами, которые присутствуют в изученных объектах [Терехов, 2006; Папаяни, 2012]. Определённый вклад в фармакологическую активность этих субстанций, безусловно, могут вносить и другие вещества, входящие в их состав.
Цель
Целью данного исследования явилось изучение количественного содержания дубильных веществ в соцветиях бархатцев распростёртых.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования нами использованы соцветия бархатцев распростертых, собранные в сентябре 2015 года в ботаническом саду.
Наличие в сырье дубильных веществ определяли методом ВЭЖХ.
С этой целью использовали высокоэффективный жидкостный хроматограф фирмы " GIL-STON", модель 305, ФРАНЦИЯ; инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA. Неподвижной фазой явилась металлическая колонка размером 4.6x250 мм KROMASIL C18, размер частиц 5 микрон, а подвижной - система: метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400:600:5. Скорость подачи элюента 0.8 мл\мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора "GILSTON" UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм. Для компьютерной обработки результатов была применена программа Мультихром для" Windows".
Соцветия Tagetes patula (10 г) трижды экстрагировали 40%-ным спиртом этиловым на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 45 минут. Объединённые извлечения упаривали под вакуумом досуха и сушили до постоянной массы. Навеску полученного сухого экстракта (г) вновь нагревали с 20 мл 70%-ного спирта этилового в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа, после чего полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 25 мл и доводили спиртом этиловым 70 % до метки. Параллельно готовили серию 0.05 % растворов сравнения в 70% спирте этиловом: танина, галловой кислоты, эпикатехина, катехина, эпигаллокатехингаллата. По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали в приведенных выше условиях. Данные анализа представлены на рисунке 1 и в таблице 1.
Место локализации дубильных веществ в соцветиях определяли с помощью качественных реакций. Анализу подвергали 40% спиртовые извлечения, полученные экстракцией обёртки и цветков по вышеописанной методике. Результаты приведены в таблице 2.
Количественное определение суммы дубильных веществ проводили в водном и 40%-ном спиртовом извлечениях из обёрток соцветий бархатцев двумя способами - перманганатометрическим [Иванов, Денисенко, 2014] и спектрофотометрическим, описанным в работе [Патент РФ № 243928].
Перманганатометрический метод (метод 1). Точную навеску (около 2г) измельчённого сырья (обёртки соцветий бархатцев) просеивали через сито диаметром 3 мм, помещали в коническую колбу объёмом 500 мл, заливали 250 мл экстрагента (водой или 40%-ным спиртом этиловым) и кипятили с обратным холодильником на кипящей водяной бане 30 минут при периодическом помешивании. Содержимое колбы охлаждали до комнатной температуры, а жидкую фазу процеживали в коническую колбу вместимостью 250 мл и доводили соответствующим растворителем до метки. Далее 25 мл полученного раствора переносили в коническую колбу объёмом 1 л, прибавляли 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании раствором перманганата калия (0.02 моль/л) до золотисто-жёлтого цвета. Параллельно проводили контрольный опыт. Содержание дубильных веществ в процентах рассчитывали по формуле:
Х _(V1-V0)*0.004157*250*100*100
1_ mHaB*25*(100-W) (
где:
V1 - объём раствора перманганата калия (0.02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения, в миллилитрах;
V0 - объём раствора перманганата калия (0.02 моль/л), израсходованного на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах; 0.004157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора перманганата калия (0.02 моль/л) в пересчёте на танин, в граммах;
Шнав - масса навески сырья, г;
W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах; 250 - общий объём извлечения в миллилитрах.
Далее проводили осаждение дубильных веществ реактивом осаждения (1% раствор желатина в 10% растворе натрия хлорида). Образовавшийся осадок отфильтровывали, 25 мл фильтрата титровали раствором перманганата калия по вышеописанной методике. Расчет оставшихся в растворе окислившихся веществ проводили по формуле (2),:
v _(72-70)*0.004157*250*100*100
Х2_-;-:--(2),
mH3B*25*(100-W)
где:
V2 - объём раствора калия перманганата (0.02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения после осаждения
Концентрацию дубильных веществ (Х3) определяли по формуле (3):
Xß=Xi —Х2
Результаты представлены в таблице 3.
Спектрофотометрический метод (метод 2). Определение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре «Аквилон» СФ-103. Около 2 г (точная навеска) измельчённого сырья - обёрток соцветий бархатцев распростёртых, просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещали в колбу вместимостью 500 мл, заливали 250 мл нагретым до кипения экстрагентом
(водой или 40% спиртом этиловым) и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут при периодическом перемешивании. Охлаждали до комнатной температуры, доводили водой до 250 мл, процеживали через вату (первые 50 мл фильтрата отбрасывали). Затем 1 мл извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили водой до метки (раствор 1). Измеряли оптическую плотность раствора 1 при длине волны 277 нм. В качестве растворов сравнения использовали воду или 40% спирт этиловый, соответственно. Далее проводили осаждение дубильных веществ. Для этого 30 мл извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 7 мл реактива осаждения, взбалтывали 60 минут, отстаивали, фильтровали. 1 мл полученного фильтрата переносили в колбу объёмом 50 мл, доводили до метки соответствующим растворителем (раствор 2). Измеряли оптическую плотность раствора 2 при длине волны 277 нм. В качестве растворов сравнения использовали соответственно воду или 40%-ный спирт этиловый.
Суммарное содержание дубильных веществ в растворе 1 в пересчёте на галловую кислоту рассчитывали по формуле:
0*250*50*100 , ,
Х4=--(4),
тнав*7а*508*(100-^)
где:
Х4 - содержание суммы дубильных веществ в пересчёте на галловую кислоту, %;
Б- оптическая плотность раствора 1;
Шнав - масса навески сырья, г;
Уа - объём аликвотной пробы, мл; 250 - общий объём извлечения, мл; 508 - удельный показатель поглощения галловой кислоты (оптическая плотность 1% раствора галловой кислоты 1 мг/мл); 50 - объём колбы, мл; Щ - влажность сырья, %,
Содержание дубильных веществ, после добавления реактива осаждения, в пересчёте на галловую кислоту (Х5), в обертках соцветий бархатцев распростёртых определяли как разницу между содержанием дубильных веществ в растворах 1 и 2.
Х = (01-02)*250*50*100 5=тнав*7а*508*(100-^)
где:
Х5 - содержание осаждаемых дубильных веществ в пересчёте на галловую кислоту, %;
Б1- оптическая плотность раствора 1;
Б2 - оптическая плотность раствора 2.
Результаты и их обсуждение
Известно, что дубильные вещества редко накапливаются в соцветиях. Основное место их локализации - корни, корневища, древесина, плоды, листья. Однако танины обнаружены в соцветиях некоторых растений, в том числе и в бархатцах, относящихся к семейству Айегасае. В календуле лекарственной и ромашке аптечной их количество варьирует в пределах 0.25-1.87% [Патент РФ №2522227]. Методом ВЭЖХ, нами установлено наличие этих веществ также и в соцветиях бархатцев распростертых (рисунок 1, таблица 1), причём среди них преобладают гидролизуемые дубильные вещества.
Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ 4096-водио-сииртового извлечения из соцветий бархатцев распростертых Fig. 1. The HPLC chromatogram of a 40% aqueous-alcoholic extract of blossoms of Tagetes patula L
Таблица 1 Table. 1
Результаты исследования дубильных веществ соцветий бархатцев распростертых методом ВЭЖХ The results of the study of tannins blossoms of Tagetes patula L. open by HPLC
№ п/п Идентифицированное вещество Время удерживания (мин)
1. Танин 3.293
2. Галловая кислота 3.885
3. Эпигаллокатехингаллат 4.322
С помощью качественных реакций установлено (таблица 2), что дубильные вещества практически отсутствуют в цветках, в основном они сосредоточены в обёртках соцветий.
Таблица 2 Table. 2
Результаты качественных реакций на наличие дубильных веществ соцветий бархатцев распростертых The results of the qualitative reactions for the presence of tannins blossoms of Tagetes patula L.
Реакция Аналитический эффект
Обёртка соцветия Цветки соцветия
1%-ный раствор желатина на 10%-ном растворе натрия хлорида Белый осадок Появление белой мути
1%-ный раствор хинина сульфата Белый аморфный осадок Очень слабый осадок
Раствор железо-аммонийных квасцов Чёрно-зелёное окрашивание раствора Окрашивание отсутствует
Результаты количественного определения дубильных веществ в обёртках соцветий Tagetes patula L., полученные методами 1 и 2 приведены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3 Table. 3
Перманганатометрическое определение содержания дубильных веществ (в пересчете на танин) в обёртках соцветий Tagetes patula L. Permanentresidence out the determination of tannins (in terms of tannin) to the wrappers inflorescences of Tagetes patula L.
Исследуемый объект № Содержание дубильных веществ, % Метрологические характеристики
Водное извлечение 1 0.457 Хср-0.450 Sx=0.0086 ДХ=0.0222 Х±ДХ=0.45±0.0222 Еотн,%=4.9
2 0.483
3 0.452
4 0.439
5 0.463
6 0.421
40% извлечение 1 0.685 Хср-0.70 Sx=0.0134 ДХ=0.0344 Х+ДХ=0.7+0.0344 Еотн,%=4.93
2 0.713
3 0.727
4 0.673
5 0.741
6 0.657
Таблица 4 Table. 4
Спектрофотометрическое определение содержания дубильных веществ (в пересчете галловую кислоту) в обертках соцветий дубильных веществ Spectrophotometry determination of tannins content(in terms of Gallic acid) in the wrappers of inflorescences tannins
Исследуемый объект № Содержание дубильных веществ, % Метрологические характеристики
1 0.185 Хср-0.18 Sx=0.0035 ДХ=0.0091 Х±ДХ=0.18±0.0091 Еотн,%=4.97
2 0.179
Водное извлечение 3 0.189
4 0.191
5 0.167
6 0.183
1 0.319 Хср-0.32 Sx=0.0057 ДХ=0.0147 Х±ДХ=0.32±0.0147 Еотн,%=4.6з
2 0.297
40% извлечение 3 0.313
4 0.327
5 0.317
6 0.339
Более высокие результаты количественного содержания дубильных веществ в исследуемом сырье, полученные методом 1, можно объяснить тем, что перманганатометрический метод позволяет определить сумму дубильных, веществ осаждаемых желатином, а второй - спектрофотомет-рический в большей степени отражает количественное содержание гидролизуемых дубильных веществ, которые в данном сырье являются доминирующими. Однако оба метода показали, что спирт этиловый 40% является лучшим экстрагентом дубильных веществ, чем вода.
Выводы
1. Методом ВЭЖХ установлено наличие в соцветиях бархатцев распростертых танина, галловой кислоты, эпигаллокатехингаллата.
2. Дубильные вещества сосредоточены в основном в обёртках соцветий Tagetes patula L. (Asteracae).
3. Спирт этиловый 40% позволяет выделить дубильных веществ из оберток соцветий бархатцев распростертых в полтора раза больше, чем вода.
4. В обертках соцветий Tagetes patula L. количественное содержание дубильных веществ, осаждаемых желатином, в пересчете на танин составило 0.70±0.01% (по данным перманганато-метрического метода), а в пересчете на галловую кислоту - о.32±0.01% ( по данным спектрофото-метрического метода).
5. Результаты количественного содержания дубильных веществ, полученные пермангана-тометрическим и спектрофотометрическим методами вполне согласуются с данными литературы о содержании танинов из соцветий некоторых других видов Asteracae.
Список литературы References
Василенко Ю.К. 1990. Гепатозащитные свойства препаратов из бархатцев распростертых. Хим.-фарм. журнал. 24 (1): 53-56.
Vasilenko Y.K. 1990. Gepatozaschitnie svoystva preparatov iz Tagetes patula [Gepatozashchitny properties of medicines from barkhatets open]. Him.-farm. journal. 24 (1): 53-56. (in Russian)
Иванов В.В., Денисенко О.Н. 2014. Количественное определение дубильных веществ в траве горца сахалинского, интродуцированного в условиях кавказских минеральных вод, различными аналитическими методами. Современные проблемы науки и образования, 6. Электронный журнал. URL: www.science-education.ru/120-16511
Ivanov V.V., Denisenko O.N. 2014. Kolichestvennoe opredelenie dubil'nykh veshchestv v trave gortsa sakha-linskogo, introdutsirovannogo v usloviyakh kavkazskikh mineral'nykh vod, razlichnymi analiticheskimi metodami [Quantitative definition of tannins in a grass of the mountaineer Sakhalin, introduced in the conditions of Caucasus Mineralnye Vody region, various analytical methods]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya, 6. Elektronnyy zhurnal.URL: www.science-education.ru/120-16511. (in Russian)
Марахова А.И., Федоровский Н.Н., Самылина И.А., Сорокина А.А., Баурин П.А. 2014. Способ раздельного выделения дубильных веществ и флавоноидов из лекарственного растительного сырья. Патент РФ №2522227.
Marahova A.I., Fedorovskii N.N., Samylina I.A., Sorokina A.A., Baurin P.A. 2014 Sposob razdel'nogo vydele-niya dubil'nykh veshchestv I flavonoidov iz lekarstvennogo rastitel'nogo syr'ya [Way of separate release of tannins and flavonoids from medicinal vegetable raw materials]. Patent RF №2522227. (in Russian)
Папаяни О.И., Доркина Е.Г., Терехов А.Ю., Сергеева Е.О., Духанина И.В., Тираспольская С.Г. 2012. Изучение химического состава и влияния экстракта из цветков бархатцев распростёртых на про/антиоксидантное равновесие в желудке крыс при вольтареновой гастропатии. Современные проблемы науки и образоания.(1)
Papayani O.I., Dorkina E.G., Terekhov A.U., Sergeeva E.O., Duhanina I.V., Tiraspol'skaya S.G. 2012. Izuchenie himicheskogo sostava I vliyaniya extracta iz Tagetes patula na pro/antioxydantnoe ravnovesie v zjeludke krys pri vol'tarenovoy gastropatii [Studying of the chemical composition and influence of extract from flowers of the barkhatets spread on about / antioxidant balance in a stomach of rats at a voltarenovy gastropatiya]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya (1). (in Russian)
Самылина И.А. Гринько Е. Н., Абоянц Р. К. 2010. Способ определения дубильных веществ в растительном сырье. Патент РФ № 243928. Электронный документ. URL http://www.findpatent.ru/patent/243/2439568.html5.
Samylina I.A. Grin'ko E. N., Aboyants R. K. 2010. Sposob opredeleniya dubil'nykh veshchestv v rastitel'nom syr'e [Way of definition of tannins in vegetable raw materials]. Patent RF № 243928. Elektronnyy dokument. URL :http://www.findpatent.ru/patent/243/2439568.html. (in Russian)
Терехов А.Ю. 2006. Изучение защитного действия биологически активных веществ из цветков Tagetes patula L. при экспериментальных токсических поражениях печени. Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - Пятигорск, 2006, 24.
Terekhov A.U. 2006. Izuchenie zaschitnogo deystviya biologicheski aktivnikh veschestv iz tzvetkov Tagetes patula L. pri eksperimental'nikh toxicheskikh porazjeniyakh pecheni [Studying of protective effect of biologically active agents from flowers of Tagetes patula L. at experimental toxic damages of a liver]. Abstract. Dis. ... cand. Pharm. Sciences. Pyatigorck, 24. (in Russian)
