CC BY
69
УДК 574.2
Колсанова Р.Р., Калинникова Т.Б., Белова Е.Б., Гайнутдинов Т.М., Гайнутдинов М.Х.
Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан
E-mail: tbkalinnikova@gmail.com
О РОЛИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ СИНАПСОВ В ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ПОЧВЕННЫХ НЕМАТОД CAENORHABDITIS ELEGANS И CAENORHABDITIS BRIGGSAE
В экспериментах с почвенными нематодами близкородственных видов C.elegans и C.briggsae показано, что устойчивость холинергических синапсов к гипертермии коррелирует с различиями теплоустойчивости поведения нематод. Повышение теплоустойчивости функций холинергических синапсов может быть причиной адаптивных изменений термотолерантности организмов нематод рода Caenorhabditis в ходе их эволюции.
Ключевые слова: Caenorhabditis elegans, Caenorhabditis briggsae, ацетилхолин, ацетилхо-линэстераза, алдикарб, холинергические синапсы, теплоустойчивость поведения, эволюция термотолерантности.
В связи с сильным влиянием современного глобального потепления климата Земли на численность и географическое распространение многих видов животных [1]-[2] большое значение имеет вопрос о закономерностях и механизмах эволюции термотолерантности пойкилотер-мных животных, температура тела которых из-за отсутствия системы терморегуляции изменяется вслед за изменением температуры среды. Поэтому организмы пойкилотермных животных настроены в ходе их эволюции на температурные параметры их экологических ниш, и превышение физиологического оптимума температур оказывает сильное негативное влияние на все функции организма (поведение, размножение, развитие и др.) [3]-[5]. Самой чувствительной мишенью негативного влияния температуры на организм Ме1а7оа является нервная система из-за нарушения процессов синаптической трансмиссии тепловым стрессом, подпороговым для повреждения нейронов [6]-[8]. В то же время, из-за высокой чувствительности к температуре большинства нейронов при чрезвычайной сложности организации нервной системы остается открытым вопрос о том, какие типы синапсов являются мишенью действия гипертермии на поведение. Ацетилхолин (АХ) является основным возбуждающим нейротрансмиттером, необходимым для регуляции всех основных функций организмов человека и животных [9]—[11]. Поэтому возможно, что холинергические синапсы являются мишенью действия высокой температуры на поведение беспозвоночных, и теплоустойчивость функций этих синапсов изменяется в ходе эволюции термотолерантности. Целью
работы явилась проверка этой гипотезы в экспериментах с почвенными нематодами близкородственных видов Caenorhabditis elegans и Caenorhabditis briggsae, обитающих в контрастных температурных нишах [12]—[13].
Методы
Эксперименты проводили в сентябре-декабре с молодыми половозрелыми нематодами линии C.elegans дикого типа N2 Bristol и линии C.briggsae дикого типа AF16, выращенными при температуре 23°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания нематод (СВН) [13] при кормлении E.coli OP50. Исследование влияния высокой температуры и ингибитора ацетилхоли-нэстеразы (АХ-эстеразы) алдикарба на поведение C.elegans и C.briggsae проводили с нематодами, инкубированными индивидуально в 1 мл NG буфера (0,3% NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM калийфосфатного буфера (pH 6,0)) [13] при температурах: 23, 30, 33 и 36°C. Это влияние на плавание нематод, индуцированное механическим стимулом (встряхивание пробирки с червем), проявлялось в нарушениях координации мышц тела, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании, отсутствии способности к непрерывному плаванию в течение 10 секунд после стимула (плавание с остановками) и полной потере способности к плаванию. Изменения поведения регистрировались с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05. В работе использовали реактивы фирмы Sigma. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение ВЕСТНИК ОГУ №9 (170)/сентябрь '2014 135
В исследованиях механизмов функций хо-линергических синапсов C.elegans используется фармакологический (токсикологический) анализ, включающий в себя измерения чувствительности локомоции к действию ингибитора АХ-эстеразы алдикарба и агониста никотиновых рецепторов АХ левамизола [10]—[11]. У червей с мутациями генов, регулирующих секрецию АХ, снижена или повышена чувствительность к повышению концентрации АХ ингибированием АХ-эстеразы, которое в результате гиперактивации н-холинорецепторов вызывает обратимые нарушения локомоции или ее полное прекращение [10]—[11]. Сходное действие на локомоцию C.elegans оказывает гиперактивация н-холинорецепторов их агонистами никотином и левами-золом, чувствительность к которым изменяется мутациями генов н-холинорецепторов [11]. Этот анализ был использован нами для проверки предположения о том, что умеренное и экстремальное повышение температуры среды изменяет функциональное состояние холинергических синапсов C.elegans и C.briggsae.
В экспериментах с C.elegans чувствительность поведения к нарушениям, индуцированным алдикарбом, не изменяется при повышении температуры с 23 до 30°С и возрастает при 33°С (рис. 1). Повышение температуры с 33 до 36°С вызывает не только тепловые нарушения поведения C.elegans, но и качественное изменение реакции нематод на повышение концентрации АХ ингибитором АХ-эстеразы алдикарбом (рис. 2). Если в диапазоне температур 23-33°С алдикарб нарушает локомоцию C.elegans, то при температуре 36°С он, напротив, ослабляет нарушения поведения, индуцированные экстремальной высокой температурой (рис. 2). При 36°С проявляется парадоксальное взаимодействие эффектов экстремальной высокой температуры и алдикар-ба: гипертермия защищает поведение от токсического действия алдикарба, а алдикарб, в свою очередь, оказывает протекторное действие на поведение, нарушенное гипертермией.
Реакция поведения C.elegans на ингибиро-вание АХ-эстеразы алдикарбом может измениться в результате как ингибирования секреции АХ холинергическими нейронами, так и снижения чувствительности н-холинорецепторов к повышению концентрации АХ [10]. Ране нами было показано, что повышение температуры до 36°С не только сохраняет, но и увели-
чивает чувствительность поведения С.е^аш к агонисту н-холинорецепторов левамизолу [8]. Следовательно, гипертермия нарушает функции холинергических синапсов C.elegans инги-бированием секреции АХ холинергическими нейронами, а не блокированием н-холинорецеп-торов. Двумя возможными причинами ингиби-рования секреции АХ при гипертермии могут быть прямое действие высокой температуры на холинергические нейроны или стимуляция секреции серотонина серотонинергическими нейронами, так как экзогенный серотонин ингиби-рует секрецию АХ [11] и снижает устойчивость поведения C.elegans к температуре 36°С [14].
В связи с тем, что организмы почвенных нематод в ходе эволюции настроены на температурные параметры их экологических ниш, были проведены эксперименты, в которых сравнивалась зависимость реакции поведения на ингибирование АХ-эстеразы алдикарбом от экстремального повышения температуры до 36°С у организмов двух близкородственных видов - C.elegans и C.briggsae. Различия чувствительности к алдикарбу между C.elegans и C.briggsae не выявляются в диапазоне температур 23-33°С (рис. 1), но при температуре 36°С имеют качественный характер (рис. 2, 3). При температуре 36°С изменяется знак эффекта алдикарба на поведение C.elegans при сохранении его негативного влияния на поведение C.briggsae (рис. 2, 3). Следовательно, тепловой стресс, эффективный для ингибирования секреции АХ у C.elegans, оказывает слабое влияние на эту секрецию у C.briggsae.
Результаты наших экспериментов позволяют сделать вывод о том, что тепловые нарушения функций холинергических синапсов являются одной из причин нарушения поведения C.elegans тепловым стрессом. Во-первых, известно, что ингибиторы АХ-эстеразы используются не только как пестициды, но и как лекарственные средства при патологических состояниях человека с дефицитом АХ [15]. Результаты наших экспериментов показывают, что гипертермия вызывает в организме C.elegans состояние с дефицитом АХ, поскольку повышение концентрации АХ ингибированием АХ-эстеразы не только не токсично, но и повышает теплоустойчивость поведения (рис. 2). Во-вторых, температура 36°С, нарушающая функции холинергических синапсов у C.elegans, является подпороговой
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
C.elegans
***
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
C.Ъriggsae
***
---
23а: 30а:
Температура
33 а:
23К
30К Температура
33 а:
По оси ординат доля червей с нормальным поведением после 30-минутной экспозиции к 32 дМ алдикарба. По оси абсцисс температура среды. В каждом варианте использовано 30 нематод. В среде без алдикарба при температуре 23, 30 и 33°С как у С.е^ат, так и у С.Ъп^се сохранялось нормальное поведение у 100% червей. Звездочками отмечена достоверность разницы между контролем (инкубация при 23°С) и опытом (инкубация при 30 или 33°С): * -р < 0.01; *** -р < 0.001
Рисунок 1. Зависимость чувствительности поведения С.е1щат и С.Ъщ^ае к алдикарбу от температуры среды
%
% 100
80 60 40 20 0
Температура 33 [С
Л
100 80 60 40 20 0
Температура 36 а:
т
0
16 32 64 0 16 32 64
Алдикарб (мкМ) Алдикарб (мкМ)
По оси ординат доля нематод с нормальным поведением после 30-минутной экспозиции к температурам 33 или 36°С в среде с алдикарбом или без алдикарба. По оси абсцисс концентрация алдикарба (дМ). В каждом варианте использовано 30 нематод. Звездочками отмечена достоверность разницы между контролем (инкубация в среде без алдикарба) и опытом (инкубация в среде с алдикарбом): *** -р < 0.001.
Рисунок 2. Чувствительность поведения С.е^ат к действию высокой температуры и алдикарба
%
Температура 33 ЯЛ
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Температура 36 ЯЛ
I I
16
Алдикарб (мкМ)
32
16 32
Алдикарб (мкМ)
По оси ординат доля нематод с нормальным поведением после 30-минутной экспозиции к температурам 33 или 36°С в среде с алдикарбом или без алдикарба. По оси абсцисс концентрация алдикарба (дМ). В каждом варианте использовано 30 нематод. Звездочками отмечена достоверность разницы между контролем (инкубация в среде без алдикарба) и опытом (инкубация в среде с алдикарбом): *** -р < 0.001.
Рисунок 3. Чувствительность поведения С.Ъщ^ае к действию высокой температуры и алдикарба
для сильного их нарушения у СЬщ^ав (рис. 3). Высокая, по сравнению с С.е\е%аж, термостабильность холинергических синапсов С Ьщ^рае может быть причиной высокой, по сравнению с Се^ат, устойчивости поведения к температуре 36°С у этой нематоды (рис. 2, 3) [5].
В связи с тем, что линии С.elegans и СЬп^ае выделены из популяций, обитающих в контрастных температурных нишах (умеренные широты и тропики соответственно) [5], [12]-[13], очевидно, что высокая теплоустойчивость холинергических синапсов и, как следствие, поведения у C.briggsae является результатом эволюции термотолерантности почвенных нематод рода СаепоАаЬёШз.
Известно, что как и у большинства других пойкилотермных Ме1а7оа [3]-[4] эволюция термотолерантности Caenorhabditis включает в себя однонаправленные изменения верхнего предела температур для размножения и устой-
чивости поведения к экстремальному повышению температуры среды [5]. Поэтому у линии C.briggsae AF16, выделенной из популяции, обитающей в Индии, по сравнению с линией C.elegans N2, выделенной из популяции, обитающей на Британских островах, повышены как устойчивость поведения к кратковременному действию экстремальной высокой температуры (рис. 2, 3), так и верхний предел температур для размножения [5]. Если теплоустойчивость фертильности и устойчивость поведения к экстремальному тепловому стрессу являются у СаепоАаЬё^ сопряженными признаками, то отбор на повышение теплоустойчивости фер-тильности в условиях умеренного превышения физиологического оптимума температуры может повышать теплоустойчивость холинергических синапсов и, как следствие, теплоустойчивость локомоции.
26.05.2014
Список литературы:
1. Hoffmann, A.A. Climate change and evolutionary adaptation / A.A. Hoffmann, C.M. Sgro // Nature. - 2011. - V. 470. - P. 479-485.
2. Invertebrates, ecosystem services and climate change / C.M. Prather [etc.] // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. - 2013. -V. 88. - P. 327-348.
3. Шмидт-Ниельсен, К. Физиология животных. Приспособление и среда. В 2 т. / К. Шмидт-Ниельсен. - М.: Мир, 1982. -Т. 1. - 414 с.
4. Андроников, В.Б. Терморезистентность гамет и температурные условия размножения пойкилотермных животных / В.Б. Андроников // Успехи соврем. биол. - 1999. - Т. 119. - С. 548-556.
5. Термотолерантность организмов почвенных нематод Caenorhabditis briggsae линии AF16 и Caenorhabditis elegans линии N2 в эксперименте / Т.Б. Калинникова [и др.] // Экология. - 2011. - №5. - С. 398-400.
6. Natural Variation in the Thermotolerance of Neural Function and Behavior due to a cGMP-Dependent Protein Kinase / K. Dawson-Scully [etc.] // PLoS ONE. - 2007. - P. 773.
7. Robertson, R.M. Temperature and neuronal circuit function: compensation, tuning and tolerance / R.M. Robertson, T.G. Money // Curr. Opin Neurobiol. - 2012. - V. 22. - P. 724-734.
8. Kalinnikova, T.B. Heat stress: causes, treatment and prevention / T.B. Kalinnikova, R.R. Kolsanova, M.Kh. Gainutdinov . -Eds Josipovic S., Ludwig E. N.Y.: Nova Science Publishers, 2012. - P. 113-140.
9. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function / E.X. Albuquerque [etc.] // Physiol. Rev. - 2009. -V. 89. - P. 73-120.
10. Presynaptic UNC-31 (CAPS) is required to activate the G alpha(s) pathway of the Caenorhabditis elegans synaptic signaling network / N.K. Charlie [etc.] // Genetics. - 2006. - V. 172. - P. 943-961.
11. A homolog of FHM2 is involved in modulation of excitatory neurotransmission by serotonin in C.elegans / E.G. Govorunova [etc.] // PLoS ONE. - 2010. - V. 5. - e10368.
12. Comparison of a new wild-type Caenorhabditis briggsae with laboratory strains of C.briggsae and C.elegans / A. Fodor [etc.] // Nematologica. - 1983. - V. 29. - P. 203-217.
13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans / S. Brenner // Genetics. - 1974. - V. 77. - P. 71-94.
14. О роли гена рецептора серотонина SER-4 в теплоустойчивости поведения Caenorhabditis elegans / Т.Б. Калинникова [и др.] // Генетика. - 2013. - Т. 49. - С. 415-419.
15. Tabet, N. Acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease: anti-inflammatories in acetylcholine closing! / N. Tabet // Age and Ageing. - 2006. - V. 35. - P. 336-338.
Сведения об авторах:
Колсанова Руфина Рифкатовна, научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан,
e-mail: rufina-r@bk.ru
Калинникова Татьяна Борисовна, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан,
кандидат биологических наук, e-mail: tbkalinnikova@gmail.com Белова Евгения Борисовна, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан,
e-mail: dzhesi@yandex.ru
Гайнутдинов Тимур Маратович, научный сотрудник лаборатории экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан,
кандидат биологических наук, e-mail: gt.tashkent@rambler.ru Гайнутдинов Марат Хамитович, заведующий лабораторией экспериментальной экологии Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, доктор биологических наук, профессор, e-mail: mgainutdinov@gmail.com 420087, г. Казань, ул. Даурская, 28, тел. (843) 2985610
