CC BY
42
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 577.152.3
О МЕХАНИЗМЕ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERRATIA MARCESCENS КАТИОНАМИ МАГНИЯ
Ю.Д. Романова, В.П. Губская, И.А Нуретдинов, А.А. Сусарова, М.Н. Филимонова
Аннотация
С помощью кругового дихроизма показано изменение вторичной структуры суммарной и транспортной РНК под действием Mg2+, что сочеталось с изменением активности эндонуклеазы по отношению к этим полинуклеотидам. Установлен универсальный механизм регуляции активности эндонуклеазы под действием Mg2+, согласно которому Mg2+, образуя комплексы с фосфатными группами полинуклеотида, вызывает изменение конформации субстрата, на что фермент отвечает изменением активности.
Кинетический анализ выявил идентичность значений константы Михаэлиса - Мен-тен Km гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК как в присутствии Mg2+, так и в его отсутствие, из чего следует, что ни конформация субстрата, ни величина заряда сахаро-фосфатного остова полинуклеотидов не влияют на прочность связывания фермента с субстратом. Напротив, наличие в среде Mg2+ отражалось на скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, а также проявлении специфичности в отношении исследованных субстратов. Гидролиз высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК при соотношении Mg2+ : фосфатНК 40 : 1 характеризовался близкими значениями каталитической константы Kcat. В отсутствие Mg2+ Kcat гидролиза тРНК была меньше Kcat гидролиза суммарной РНК, высокомолекулярной ДНК, а также тРНК в присутствии Mg2+, соответственно почти в 20, 100 и 1000 раз. Таким образом, впервые установлена субстратная специфичность эндонуклеазы и показано участие Mg2+ в этом процессе.
Ключевые слова: эндонуклеаза Serratia marcescens, круговой дихроизм, катионы магния, механизм гидролиза, константа Михаэлиса - Ментен, каталитическая константа.
Введение
Внеклеточная нуклеаза бактерий Serratia marcescens (далее используется сокращение Sma nuc - эндонуклеаза бактерий S. marcescens) является одним из наиболее изученных ферментов в ряду бактериальных нуклеаз.
Определены многие физико-химические и биохимические свойства нук-леазы, установлены структура и механизм действия [1-14]. При этом механизмы регуляции активности эндонуклеазы не изучены, хотя известно, каким образом Mg активирует эндонуклеазу при гидролизе ДНК [6]. В частности, установлено, что катионы магния, образуя комплексы с фосфатными группами ДНК, вызывают изменение конформации полинуклеотида, на что эндонуклеаза отвечает изменением ферментативной активности. Такая последовательность действий представляет основные этапы механизма регуляции ДНКазной ак-
тивности катионами магния. Поскольку известно, что Mg2+ способен также связываться с РНК и изменять ее конформацию [15, 16], а эндонуклеаза не проявляет специфичности к углеводному остатку субстратов [8-10], можно было предположить следующее. Во-первых, регуляция РНКазной активности Mg2+ протекает так же, как регуляция ДНКазной активности. Во-вторых, механизм регуляции Mg является универсальным в отношении любого из субстратов. При этом известно, что эндонуклеаза проявляет чувствительность к вторичной структуре субстрата [6].
Так как ДНК и РНК различаются вторичной структурой, высказанное предположение могло быть ошибочным. Отсутствие ясности в данном вопросе послужило предпосылкой к исследованию механизма регуляции активности эндо-нуклеазы катионами магния, что стало целью настоящей работы. Для достижения цели определяли изменение конформации субстратов: высокополимерной ДНК, суммарной и транспортной РНК - и нуклеазной активности под действием Mg , кинетические параметры гидролиза субстратов в отсутствие и в присутствии катионов Mg, а также оптимальное соотношение Mg2+ : фосфат РНК, ранее никем не установленное и необходимое для решения перечисленных задач.
Материалы и методы
В работе использовали препараты высокополимерной ДНК ("Sigma", США), суммарной РНК ("US Biochemical Corporation", США), тРНК из дрожжей ("ICN", США). Нуклеаза S. marcescens была представлена изоформой Sm2, выделенной и охарактеризованной ранее [3, 17].
Определение нуклеазной активности методом кислоторастворимых фракций проводили при поиске оптимального содержания Mg2+. Реакционная смесь включала 1.31 нМ эндонуклеазу, 0.01% РНК, 50 мМ Трис-НС1 буфер, рН 8.5, и MgSO4, концентрация которого указана в подписи к рисункам. Инкубацию проводили при температуре 37 °С. Время инкубации подбирали так, чтобы в кислоторастворимые продукты превращалось менее 75% субстрата. Реакцию прекращали добавлением охлажденной 4%-ной HC1O4. Осадок удаляли центрифугированием и определяли А260 надосадочной жидкости. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое вызывало увеличение А260 в 1 мл раствора на 1 опт. ед. за 1 ч инкубации при 37 °С. Активность в отсутствие магния принимали за 100%.
При проведении кинетического анализа гидролиза субстратов нуклеаз-ную активность определяли по гиперхромному эффекту, используя двухлуче-вой спектрофотометр À-35 ("Perkin Elmer", США), оснащенный термостати-руемой ячейкой и компьютерным интерфейсом с соответствующими программами. Реакционная смесь, объемом 500 мкл, содержала 0.03, 0.06 или 0.18 мМ ДНК или РНК, 50 мМ Трис-НС1 буфер, рН 8.5, и MgSO4 в соответствующей концентрации. Гидролиз субстрата инициировали добавлением к реакционной смеси 5 мкл 17.9 мкМ раствора нуклеазы, после чего регистрировали изменение поглощения смеси в кювете с длиной оптического пути 2 мм при 260 нм в течение 10 мин. Константу Михаэлиса - Ментен Km и каталитическую константу Kcat определяли стандартным методом в координатах Лайнуивера - Берка.
Круговой дихроизм (КД) проводили при комнатной температуре на приборе Jasco-J 500 A ("Japan Spectroscopic Co.", LTD, Япония). Определяли спектры 0.05%-ных растворов ДНК, суммарной и тРНК в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.5, в отсутствие и в присутствии Mg2+, концентрация которого дана в подписях к рисункам.
Концентрацию ДНК или РНК в усредненных нуклеотидах рассчитывали, исходя из молярного коэффициента поглощения нуклеотидного звена при 260 нм, равного 6500-7500 М-1-см-1 (рН 12) [6].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием общепринятых математических средств для доверительного интервала 95%.
Результаты и обсуждение
Результаты определения оптимального содержания Mg2+ для проявления РНКазной активности представлены на рис. 1. Как видно из рисунка, добавление Mg до концентрации 0.58 мМ, что соответствовало соотношению Mg2+ : фосфатРНК, равному 2 : 1, вызывало увеличение РНКазной активности почти в 3.5 раза. Дальнейшее увеличение содержания Mg в 5 раз вызывало дополнительное возрастание активности почти в 1,3 раза, после чего, несмотря на последующее увеличение содержания Mg2+ в 2 и 4 раза, рост активности прекращался. Наблюдаемое небольшое изменение активности было недостоверным и находилось в пределах ошибки опыта.
Таким образом, оптимальным для РНКазной активности эндонуклеазы было содержание Mg2+ 2.9-11.6 мМ, что отличалось от ранее опубликованных значений [8,10] и в то же время совпадало с результатами определения оптимального содержания Mg2+ для проявления ДНКазной активности [6]. Содержание Mg2+ 2.9-11.6 мМ соответствовало соотношению Mg2+ : фосфатРНК 10-40 : 1, что совпадало с оптимальным для активности изоформ Sm1 и Sm2 соотношением концентраций Mg2+ : фосфатДНК, установленным ранее [6].
Аналогично с РНКазной активностью происходило изменение спектров КД РНК под действием Mg2+, регистрируемых для подтверждения изменения кон-формации полинуклеотида в результате связывания Mg2+. Спектры представлены на рис. 2, из которого видно, что и в отсутствие, и в присутствии Mg РНК находится в А-конформации. В частности, в отсутствие Mg2+ в спектре КД наблюдалось наличие интенсивной положительной полосы с центром при 265 нм и небольшой отрицательной полосы в области 248-227 нм.
По мере добавления Mg2+ интенсивность полосы при 265 нм возрастала. Так, в присутствии 0.83 мМ Mg2+ (линия 2), что соответствовало соотношению Mg2+ : фосфатРНК 0.58 : 1, дихроичное поглощение возрастало почти в 1.1. Десятикратное увеличение содержания Mg2+ (линия 3), вызывало дополнительный рост дихроичного поглощения примерно в 1,04 раза. При увеличении содержания Mg до 24.9 мМ (линия J), что соответствовало соотношению Mg2+ : фосфатРНК 17.1 : 1, дихроичное поглощение возрастало еще в 1.01 раза, и затем рост прекращался, несмотря на увеличение содержания Mg2+. Такие изменения в спектре КД в совокупности со смещением полосы на 2 нм в коротковолновую область служили доказательством изменения вторичной структуры РНК за счет взаимодействия с катионами магния [18].
[Мд], мМ
Рис. 1. РНКазная активность эндонуклеазы в присутствии 0, 0.58, 2.9, 5.8, 11.6 мМ MgSO4. Здесь и далее дано среднее значение ± стандартная ошибка
Рис. 2. Спектры кругового дихроизма РНК в отсутствие (1) и в присутствии 0.83 (2), 8.3 (3), 16.6 (4), 24.9 (5), 33.2 (6) мМ Mg2+
Табл. 1
Изменение разностного дихроичного поглощения положительной полосы в спектре КД РНК (1) и РНКазной активности эндонуклеазы (2) при различном содержании в среде Mg2+
1 2
Mg2+, мМ Mg2+ : фосфатрнк Дб265, % Mg2+, мМ Mg2+ : фосфатрнк Активность, %
0 0 100 0 0 100
0.83 0.58 : 1 106.1 0.58 2 :1 366.3 ± 21.5
8.3 5.8 110.2 2.9 10 : 1 462.9 ± 8.4
16.6 11.6 110.2 5.8 20 : 1 482.4 ± 22.4
24.9 17.1 111.2 11.6 40 : 1 489.9 ± 25.6
33.2 23.2 111.2
Рис. 3. Спектры кругового дихроизма тРНК в отсутствие (1) и в присутствии 7.8 (2), 23.3 (3), 38.3 (4), 45.6 (5) мМ
Изменение вторичной структуры РНК под действием Mg2+ коррелировало с изменением РНКазной активности эндонуклеазы (табл. 1), что подтверждало наше предположение об идентичности механизмов регуляции РНКазной и ДНКазной активностей катионами магния.
Спектры КД тРНК представлены на рис. 3. Несмотря на различия суммарной РНК и тРНК по степени спирализации и полимерности молекул, спектры КД этих препаратов имели много общего. Так, наличие интенсивной положительной полосы разностного дихроичного поглощения при 263 нм и небольшой отрицательной полосы в области 225-240 нм свидетельствовало о А-конформа-ции тРНК [19] независимо от наличия Mg2+. Добавление Mg2+ к раствору РНК до соотношения Mg2+ : фосфатРНК 4 : 1 (линия 2) вызывало увеличение разностного дихроичного поглощения положительной полосы в 1.1 раза. Однако дальнейшее возрастание содержания Mg2+ в 3-6 раз (линии 3-5) вызывало бессистемное изменение разностного дихроичного поглощения при 263 нм в 1.0061.03 раза, что, по-видимому, обусловлено ошибкой измерения. Полученные результаты служили дополнительным подтверждением идентичности механизмов регуляции РНКазной и ДНКазной активностей катионами магния, показывали, что ни степень полимерности, ни степень спирализации субстрата не оказывали существенного влияния на исследуемый механизм, и свидетельствовали об универсальности механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния по отношению к любому субстрату.
Рис. 4. Спектры кругового дихроизма ДНК в отсутствие (1) и в присутствии 0.7 (2), 15.6 (3), 23.3 (4), 45.6 (5) мМ Mg2+
Универсальность механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния привела к предположению идентичности кинетики гидролиза ДНК, суммарной и транспортной РНК. Для подтверждения этого предположения определяли кинетические параметры гидролиза в присутствии 40-кратного избытка Mg2+. Кроме того, для выяснения роли Mg2+ в интимном механизме взаимодействия фермента с субстратом провели сравнительный анализ кинетических параметров гидролиза ДНК, суммарной и транспортной РНК в отсутствие и в присутствии Mg2+. Предварительно для подтверждения конформацион-ных изменений ДНК под действием Mg2+ определили спектры КД в отсутствие и в присутствии 40-кратного избытка Mg .
Как видно из рис. 4, и в отсутствие, и в присутствии Mg2+ ДНК находится в В-конформации. В частности, в отсутствие Mg в спектре КД наблюдалось наличие интенсивной положительной полосы с центром при 275 нм и не менее интенсивной отрицательной полосы в области 223-257 нм.
По мере добавления Mg интенсивность положительной полосы уменьшалась. При соотношении Mg : фосфатДНК 8 : 1 дихроичное поглощение уменьшалось примерно в 1.1 (линия 3). Дальнейший рост содержания Mg2+ не вызывал существенных изменений в спектре КД ДНК.
Табл. 2
Кинетические параметры гидролиза РНК, ДНК и тРНК в присутствии (1) и в отсутствие (2) Mg2+
Субстрат 1 2
Кт, мг/мл Ксаг, с-1/1 мМ 8та пис Кт, мг/мл Ксаг, с-1/1 мМ 8та пис
РНК 0.032 86.2 0.038 1.4
ДНК 0.027 143.6 0.043 6.7
тРНК 0.035 126.7 0.048 0.07
Полученные данные согласуются с результатами, представленными в литературе. Ранее было показано изменение вторичной структуры ДНК при добавлении ионов магния, о чем свидетельствовало уменьшение дихроичного поглощения полосы с центром более 260 нм [6, 19, 20]. При этом конформация ДНК оставалась в пределах В-формы, хотя происходили изменения угла поворота между соседними основаниями и расстояния пар оснований от оси спирали.
Результаты кинетического анализа гидролиза высокополимерной ДНК, суммарной и транспортной РНК представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, Кт, характеризующая сродство фермента к субстрату, имела близкие значения при гидролизе ДНК, суммарной и транспортной РНК, а также не зависела от присутствия в среде Mg . Установленный факт привел к следующим заключениям. Во-первых, для образования комплекса эндонуклеазы с субстратом присутствие Mg2+ не является необходимым условием. Во-вторых, конформация, полимерность и степень спирализации субстрата не оказывают существенного влияния на образование комплекса эндонуклеазы с субстратом. В-третьих, тип углеводного остатка в составе нуклеотидного звена не имеет принципиального значения для образования комплекса эндонуклеазы с субстратом.
Из табл. 2 также видно, что отсутствие в среде Mg2+ существенно снижало скорость диссоциации фермент-субстратного комплекса с образованием продукта. Причем уменьшение скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса зависело от типа гидролизуемого субстрата и было наибольшим (в 1810 раз) в случае тРНК и наименьшим (в 21 раз) в случае ДНК. Известно, что от двух других субстратов ДНК отличается и вторичной структурой, и степенью полимерности. По степени полимерности, хотя ДНК и превосходит два других препарата, однако ближе к суммарной, чем к транспортной РНК. По степени спирализации ДНК, напротив, ближе к тРНК, чем к суммарной РНК. Таким образом, при исследовании роли Mg2+ в интимном механизме взаимодействия фермента с субстратом дополнительно было установлено следующее: 1) хотя в отсутствие Mg диссоциация фермент-субстратного комплекса с образованием продукта и происходила, однако скорость протекания данного этапа ферментативного процесса была намного меньше, чем в присутствии Mg ; 2) в отсутствие Mg эндонуклеаза проявляла субстратную специфичность, демонстрируя предпочтение к гидролизу субстрата в В-конформации (от двух других субстратов он также отличался полимерностью полинуклеотид-ной цепочки); 3) для продуктивной диссоциации фермент субстратного комплекса степень спирализации субстрата, очевидно, не имела большого значения.
Работа поддержана грантами НИОКР АН РТ (07-7.3-272) и Минобразования науки (Е 006-6.0-14 и Е 02-6.0-269), за что авторы выражают особую благодарность.
Summary
J.D. Romanova, V.P. Gubskaya, I.A. Nuretdinov, A.A. Susarova, M.N. Filimonova. About Mechanism of Regulation of Serratia marcescens Endonuclease's Activity with Magnesium Cations.
Circular dichroism demonstrated variation in the secondary structure of RNA and tRNA upon action of Mg2+ that correlated with changes of the nuclease activity towards the polynucleotides. The mechanism of the endonuclease's activity regulation upon action of Mg2+ was found and concluded to be universal. In accordance with the mechanism Mg2+ cations binding phosphates of the polynucleotides induce changes in conformation of the substrate that is responded by changes of the enzyme activity.
Kinetic analysis revealed the identity of Km values for hydrolysis of highly polymerized DNA, RNA and tRNA in the presence or in the absence of Mg2+ that displayed neither the substrate conformation nor the charge of sugar-phosphate backbone influenced on the strength of enzyme binding the substrate. Controversially Mg2+ influenced on the rate of productive dissociation of the enzyme-substrate complex as well as the enzyme specificity towards the substrates. At Mg2+ : phosphate ratio 40 : 1 kcat values characterizing hydrolysis of DNA, RNA and tRNA was found to be similar. In the absence of Mg2+ kcat value characterizing hydrolysis of tRNA was respectively 20, 100 or 1000 fold less than the values characterizing hydrolysis of RNA and DNA in the absence of Mg2+, or tRNA in the presence of Mg2+.
Thus the substrate specificity of the nuclease and a role of Mg2+ in that was demonstrated on the first time.
Key words: Serratia marcescens endonuclease, circular dichroism, magnesium cations, hydrolysis mechanism, Michaelis constant, catalytic constant.
Список литературы
1. Biedermann K., Jepsen P., Riise E., Svendsen I. Purification and characterization of Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli // Carlsberg Res. Commun. -1989. - V. 54, No 1. - P. 17-27.
2. Miller M.D., Tanner J., Alpaugh M., BenedikM.J., Krause K.L. 2.1 Ao structure of Ser-ratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA // Nat. Struct. Biol. - 1994. - V. 1, No 7. - P. 461-468.
3. Педерсен Ю., Филимонова М., Роепсторф П., Бидерман К. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens природного и рекомбинантного штаммов. Сравнительная характеристика плазменно-десорбционной масс-спектрометрией // Биохимия. - 1995. -Т. 60, Вып. 3. - С. 450-461.
4. Педерсен Ю., Андерсен Ж., Роепсторф П., Филимонова М., Бидерман К. Характеристика изоформ нуклеазы Serratia marcescens электроспрей-масс-спектрометрией // Биохимия. - 1995. - Т. 60, Вып. 3. - С. 462-469.
5. ФилимоноваМ.Н., Гарусов А.В., Сметанина Т.А., АндрееваМ.А., Богомольная Л.М., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности // Биохимия. - 1996. - Т. 61, Вып. 10. - С. 1800-1806.
6. Филимонова М.Н., Губская В.П., Нуретдинов ИА., Бенедик М.Дж, Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg2+ в механизме гидролиза // Биохимия. - 1997. - Т. 62, Вып. 9. - С. 1148-1154.
7. Филимонова М.Н., БенедикМ.Дж., Уразов Н.Г., Лещинская И.Б. Полидисперсия нуклеазы Serratia marcescens при оптимуме рН // Прикл. биохимия и микробиол. -1999. - Т. 35, № 1. - С. 20-24.
8. Nestle M., Roberts W.J. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties of the enzyme // J. Biol. Chem. - 1969. - V. 244, No 19. -P. 5213-5218.
9. Eaves G.N., Jeffries C.D. Isolation and properties of an exocellular nuclease of Serratia marcescens // J. Bacteriol. - 1963. - V. 85, No 2. - P. 273-278.
10. Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С., Таняшин В.И., Третьяк Т.М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата Serratia marcescens // Биохимия. - 1974. - Т. 39, Вып. 1. - С. 116-122.
11. Filimonova M.N., Krause K.L., Benedik M.J. Kinetic studies of the Serratia marcescens exstracellular nuclease isoforms // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1994. - V. 33, No 6. -P. 1229-1236.
12. ФилимоноваМ.Н., Балабан Н.П., ШариповаМ.Р., Лещинская И.Б. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента // Биохимия. - 1980. - Т. 45, Вып. 11. - С. 2096-20103.
13. Филимонова М.Н., Баратова Н.П., Воспельникова Н.Д., Желтова А.О., Лещинская И.Б. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента // Биохимия. -1981. - Т. 46, Вып. 9. - С. 1660-1666.
14. Филимонова М.Н., Бенедик М.Дж. Нуклеаза Serratia marcescens. Отношение концентраций фермента и субстрата для проявления максимальной активности // Биохимия. - 1995. - Т. 60, Вып. 9. - С. 1449-1500.
15. Romer R., Hach R. tRNA conformation and magnesium binding. A study of yeast phen-ylalanine-specific tRNA by a fluorescent indicator and differential melting curves // Eur. J. Biochem. - 1975. - V. 55, No 1. - P. 271-284.
16. Серебров В.Ю., Василенко К.С., Холод Н.С., Киселев Л.Л. Ионы Mg2+ по-разному влияют на физические свойства тРНК1'11'5 и транскрипта ее гена // Мол. биол. - 1997. -Т. 31, № 5. - С. 894-900.
17. Филимонова М.Н., Дементьев А.А., Лещинская И.Б., Бакулина Г.Ю., Шляпников С.В. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens // Биохимия. - 1991. - Т. 56, Вып. 3. - С. 508-520.
18. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О., Корнилова С.В., Сорокин В.А., Шкорба-тов А.Г. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. - Киев: Наук. думка, 1991. - 270 с.
19. Иванов В.И., Минченкова Л.Е. А-форма ДНК: в поисках биологической роли // Мол. биол. - 1994. - Т. 28, № 6. - С. 1258-1271.
20. Chan A., Kilkuskie R., Hanlon S. Correlation between the duplex winding angle and the circular dichroism spectrum of calf thymus DNA // Biochem. - 1979. - V. 18, No 1. -P. 84-91.
Поступила в редакцию 27.12.07
Романова Юлия Джафаровна - аспирант кафедры биохимии Казанского государственного университета.
Губская Валентина Петровна - кандидат химических наук, научный сотрудник Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.
Нуретдинов Ильдус Аглямович - доктор химических наук, профессор, член-корреспондент АН РТ, главный научный сотрудник Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.
Сусарова Александра Николаевна - студент кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
Филимонова Мария Николаевна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: Maria.Filimonova@ksu.ru
