CC BY
94
Низкомолекулярные соединения
УДК 547.972
НОВЫЙ ГЛИКОЗИД ИЗОФЛАВОНА ИЗ TRIFOLIUM PRATENSE L.
© А.А. Дренин , Э.Х. Ботиров, Ю.П. Туров
Сургутский государственный университет, ул. Энергетиков, 22,
Сургут, 628412 (Россия) e-mail: bioecologist@yandex.ru
Статья посвящена фитохимическому исследованию состава изофлавоноидов клевера лугового (Trifolium pratense L.). из этого растения впервые выделен циклополиол (+)-пинитол, известные изофлавоны формононетин, прунетин, гени-стеин, прунетин-4'-О-Р-Э-глюкопиранозид, три моногалактозида изофлавонов - формононетин-7-О-Р-Э-галакто-пиранозид, инермин-З-О-Р-Э-галактопиранозид, генистеин-7-О-Р-Э-галактопиранозид, а также новое соединение - пру-нетин-4'-О-а-Э-глюкопиранозид. Структура выделенных соединений установлена методами УФ-, иК-, 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и спектроскопии кругового дихроизма. Приводятся данные по биологической активности (+)-пинитола.
Ключевые слова: Trifolium pratense L. - клевер луговой, изофлавоноиды, прунетин-4'-О-а-Э-глюкопиранозид, (+)-пинитол.
Введение
Клевер луговой (Trifolium pratense L.) распространен практически на всей территории России. Растет по лугам, опушкам леса, полянам [1]. Широко применяется в народной медицине: обладает отхаркивающим, смягчающим, мочегонным, потогонным, противовоспалительным и антисептическим действием. Настой из цветочных головок и листьев принимают при малокровии, простудных заболеваниях, кашле, простудных и ревматических болях; в дерматологии траву клевера рекомендуется использовать как внутрь в виде настоя при аллергических заболеваниях, васкулитах, витилиго, так и наружно в виде примочек, припарок при фу-рункулезах и экземах [2, З].
На основе экстрактов клевера лугового создан ряд биологически активных добавок, обладающих широким спектром фармакологического действия [3]. В частности, отечественные БАД «Атероклефит» компании «Эвалар» и «Кардиин» (Нутрифарм), а также их американский аналог «Red Clover Plus» (Nutri-Caer) применяют для профилактики и вспомогательного лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы. БАД «Клевер» используют как иммуномодулирующее, антиоксидантное, антианемическое, ранозаживляющее, отхаркивающее, антиаллергическое, бактерицидное, сосудорасширяющее, спазмолитическое, диуретическое, потогонное, успокаивающее средство.
Многочисленные исследования клевера свидетельствуют о наличии в нем изофлавоноидов биоханина А, формононетина, даидзеина, прунетина, генистеина, пратензеина, псевдобаптигенина, каликозина, гликози-дов ононина, сиссотрина, трифолина, изотрифолина, эфирных и жирных масел, витамина С, каротина и других соединений [1-3].
В рамках данной работы проводилось исследование химического состава изофлавоноидов клевера лугового, произрастающего на территории Ханты-Мансийского автономного округа. Ранее фенольные соединения клевера указанной территории не изучались.
Методика исследования
Сбор надземной части клевера проводили на территории Сургутского района в окрестностях д. Сайгати-на в июле 2006 г., подземная часть растения была собрана на той же территории в конце сентября.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Воздушно-сухие навески измельченной подземной (0,5 кг) и надземной (1,0 кг) части пятикратно экстрагировали 85% этиловым спиртом при комнатной температуре. Экстракты сгущали упариванием в вакууме и обрабатывали последовательно гексаном, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Полученные фракции хроматографировали на колонках с силикагелем в градиенте этанола в хлороформе.
из хлороформной фракции подземной части был получен флавоноид (I) (88,З мг). из этилацетатной фракции были элюированы вещества II (250 мг) и III (500 мг). из хлороформной фракции экстракта надземной части было выделено соединение IV (70 мг), из этилацетатной - изофлавон V (45 мг), гликозиды изофлавоноидов VI (350 мг), VII (25 мг) и VIII (35 мг). из бутанольной фракции надземной части получили вещество IX (600 мг).
Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-А-УФ с закрепленным слоем силикагеля. Для ТСХ применяли следующие системы растворителей: 1) хлороформ - этилацетат (9 : 1); 2) хлороформ - этанол (9 : 1); 3) хлороформ - этилацетат - этанол (6 : 1 : 3); 4) этилацетат - этанол - вода (6 : 3 : 1); 5) н-бутанол - этанол - вода (5 : 3 : 2). Пятна флавоноидов на пластинках просматривали в ультрафиолете в хроматографическом облучателе УФС-254/365 при 254 и 365 нм, а также обнаруживали проявлением 3% спиртовым раствором ванилина в смеси с концентрированной соляной кислотой в соотношении 4 : 1. Моносахариды обнаруживали опрыскиванием хроматограмм серной кислотой с последующим нагреванием при 100-110 °С в течение 20 мин.
Температуры плавления выделенных индивидуальных веществ определяли капиллярным методом в серной кислоте.
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре СФ-2000. иК-спектры снимали на иК-Фурье-спектро-метре Perkin Elmer Spectrum 100 методом НПВО на приставке ITR-Miracle (однократное нарушенное полное внутреннее отражение). Разрешение - 4,00 см-1, аподизация - «strong». Спектры кругового дихроизма снимали в этаноле на спектрополяриметре Jasco J-20.
Масс-спектры ацилированных производных флавоноидов и их гликозидов снимали на хромато-масс-спектрометре Perkin Elmer Clarus 500 ms. Масс-спектрометр: энергия ионизации - 70 эВ, диапазон развертки - 40-400 Да, скорость развертки - 3 скана/сек. Хроматограф: ГЖХ, колонка SE-54 (L=30 м, d=0,25 см); режим программируемой температуры термостата: изотермическая выдержка при 800С, затем нагрев со скоростью 10°/мин до 270 °С. Температура испарителя - 270 °С. Газ-носитель - гелий (расход - 0,5 мл/мин).
1Н-ЯМР- и 1ЗС-ЯМР-спектры снимали в диметилсульфоксиде (DMSO-d6) и дейтерированном пиридине (Pyd-d5) на приборе Bruker AVACE AV300 с рабочей частотой 300 МГц (1Н-ЯМР) и 75 МГц (1ЗС-ЯМР).
идентификация TMS-эфиров моносахаридов, полученных в результате гидролиза гликозидов, проводилась на газо-жидкостном хроматографе «Кристалл 2000-М», на колонке (L=15 м, d=0.32 см) с неподвижной фазой SE-54; режим программируемой температуры термостата: изотермическая выдержка при 70 °С, затем нагрев до 200 °С со скоростью 4°/мин. Детектор - пламенно-ионизационный (t=280 °С), температура испарителя - 250 °С. Газ-носитель - гелий (расход - 3 мл/мин).
Результаты и обсуждение
из надземной и подземной частей клевера лугового были выделены четыре известных изофлавона: фор-мононетин (I), прунетин (IV), генистеин (V) и прунетин-4'-0-Р-0-глюкопиранозид (VI), а также три новых галактозида изофлавоноидов: формононетин-7-0-Р-0-галактопиранозид (II), инермин-З-О-Р-О-галактопи-ранозид (III) и генистеин-7-0-P-D-галактопиранозид (VIII). Установление структуры этих соединений было описано ранее [4, 5].
УФ-спектр соединения VII состава С22Н22010 с т.пл. 259-260 °С характерен для производных изофлавона
и имеет максимумы поглощения при Х” 263, 292, 335 нм. При снятии УФ-спектра с добавлением ацетата
натрия не наблюдалось батохромного сдвига полосы II, что свидетельствует об отсутствии свободной фенольной гидроксильной группы в положении С-7 [6]. Батохромный сдвиг полосы II на 10 нм наблюдался при снятии спектра с добавлением хлорида алюминия, что обусловлено наличием фенольного гидроксила при С-5 [6, 7].
В иК-спектре вещества VII имеются полосы колебаний гидроксильных групп (3317 см-1), карбонила у-пирона (1645 см-1), ароматических углерод-углеродных связей (1600 см-1) и С-О-связей гликозидов (1015 см-1).
При кислотном гидролизе были получены агликон и моносахарид. Агликон сравниванием с заведомым образцом (ТСХ, ГЖХ ацетил-производных, метод смешанной пробы) идентифицирован как прунетин. Моносахарид в присутствии свидетеля идентифицирован как D-глюкоза (ГЖХ ТМС-эфиров).
В результате ацетилирования изофлавона уксусным ангидридом в пиридине было получено пентааце-тильное производное УПа, в масс-спектре которого наблюдаются пики ионов со следующими значениями т^: 368 (М, 2%), 284 (100), 255 (10), 166 (50), 138 (40), 118 (30) и др. Пики ионов с т^ 166 и 118, образующиеся в результате ретродиенового распада, характерны для производных изофлавонов, содержащих гидроксильную группу в кольце В, а также гидроксильную и метоксильную группы в кольце А.
В спектре 13С-ЯМР (ДМСО^6) гликозида VII
проявляются сигналы атомов углерода агликона и сахарной части (табл. 1). Сигнал аномерного протона глюкозы в спектре :Н-ЯМР проявляется в виде дублета при 5,36 м.д. с J=4,5 Гц. Такое значение константы спин-спинового взаимодействия сигнала аномерного протона, а также парамагнитный сдвиг сигналов протонов углеводной части на 1,5 м.д. по сравнению с Р-формой свидетельствуют в пользу а-пиранозной конфигурации глюкозы [8, 9]. Значения химсдвигов сигналов остальных протонов сахарной части лежат в области 4,58-5,18 м.д.
Таким образом, вещество VII имеет структуру прунетин-4'-О-а-Э-глюкопиранозида.
Таблица 1. Данные :Н- и 13С-ЯМР-спектров
прунетин-4’-О-а-Э-глюкопиранозида
Атом С 5с (м.д.) 5Н Р, Гц)
Агликон
2 153,6 8,46 с
3 121,4
4 180,3
5 157,7
6 98,6 6,41 ус
7 164,9
8 92,6 6,66 ус
9 157,5
10 105,3
1' 122,5
276' 130,1 7,50 д (8,1)
3'/5' 116,1 7,09 д (8,1)
4' 162,1
ОСН3 56,2 3,86 с
ОН (С-5) 12,92 с
Глюкоза
1" 100,3 5,36 д (4,5)
2" 73,1 4,58-5,18
3" 76,5 4,58-5,18
4" 69,6 4,58-5,18
5" 77,0 4,58-5,18
6" 60,2 4,58-5,18
Прунетин-4'-О-а-Э-глюкопиранозид в литературе не описан и является новым соединением.
Вещество IX С7Н14Об ([а]]з (этанол) +65,63°) не дает поглощения в УФ- и видимой области, а в его ИК-спектре присутствуют полосы колебаний гидроксильных групп (3600-3250 см1), алифатических С-С связей (2300-2950 см-1) и С-О связей (1175 см-1)
Ацетилированием вещества IX хлористым ацетилом было получено его пентаацетильное производное 1Ха. В масс-спектре соединения 1Ха наблюдаются пики ионов с т^ 404 (М+, 3%), 345 (2), 285 (2), 243 (8), 182 (35), 150 (50), 109 (15), 87 (45), что соответствует структуре метоксиинозитола.
В спектре ЯМР-13С (ДМСО^6) присутствуют сигналы шести атомов углерода циклогексанового кольца, связанных с кислородной функцией (70,1-83,8 м.д.) и сигнал углерода метоксильной группы со значением химсдвига 59,7 м.д.
В ЯМР-1Н-спектре проявляются сигналы пяти атомов водорода >СН-ОR групп циклогексанового кольца в области 4,34-4,73 м.д. и сигналы протонов метоксильной группы при 3,62 м.д. Сигнал протона при С-6 проявляется в виде триплета в более сильном поле при 3,00 м.д. (табл. 2). Парамагнитный сдвиг сигнала Н-6 по сравнению с таковым циклогексана обусловлен наличием метоксильной группы
Таблица 2. Данные :Н- и 13С-ЯМР-спектров соединения IX
Атом С 5с (м.д.) 5Н № Гц)
1 70,9 4,47 д (6,6)
2 72,4 4,52 д (4,8)
3 70,1 4,72 д (2,1)
4 72,6 4,63 д (2,1)
5 71,9 4,35 д (5,7)
6 83,8 3,00 т (9,3, 9,3)
ОСН3 59,7 3,62 с
8
при ипсо-атоме углерода, а сигналов остальных пяти атомов водорода цикла - наличием пяти спиртовых гидроксильных групп [10].
Детальный анализ данных 'Н-ЯМР-спектра, сопоставление значений химсдвигов сигналов протонов и значений констант спин-спинового взаимодействия позволили идентифицировать соединение IX как (Ж, 2S, 3s, 4S, 5S, 6г)-6-метоксициклогексан-1,2,3,4,5-пентаол (пинитол).
OCH3
У представителей семейства Бобовые довольно часто обнаруживают пинитол в больших количествах, однако из клевера лугового это соединение выделено впервые.
Пинитол запатентован в США в качестве гипогликемического и антидиабетического средства [11]. Содержание этого вещества в надземной части клевера лугового в период сбора (июль) составило 0,9%.
Выводы
1. Из корней клевера лугового выделены два моногалактозида изофлавоноидов (формононетин-7-O-P-D-галактопиранозид и инермин-3-О-Р-Э-галактопиранозид), а также формононетин (7-гидрокси-4'-метокси-изофлавон).
2. Из надземной части клевера получен новый гликозид прунетин-4'-О-а-Э-глюкопиранозид, а также ге-нистеин-7-О-Р-Э-галактопиранозид, формононетин, прунетин, генистеин и прунетин-4'-О-Р-Э-глюкопиранозид.
3. Из надземной части клевера лугового впервые выделен циклополиол (+)-пинитол. Таким образом, обнаружен новый перспективный источник этого биологически активного соединения.
4. Структура выделенных соединений установлена на основании данных химических превращений (аце-тилирование, гидролиз), а также методами УФ-, ИК-, :Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и спектроскопии кругового дихроизма.
Список литературы
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Hy-drangeaceae - Haloragaceae / отв. ред. В. П. Соколов. Л., 1987. С. 137-142.
2. Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. М., 2005. С. 887.
3. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия / Под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. СПб., 2004.
С. 728.
4. Дренин А.А., Ботиров Э.Х., Петруляк Е.В. Два новых моногалактозида изофлавоноидов из корней Trifolium pratense L. // Химия природных соединений. 2008. Т. 44. №1. С. 21-23.
5. Дренин А.А., Ботиров Э.Х., Петруляк Е.В. Новый моногалактозид генистеина из надземной части Trifolium pratense L. // Химия природных соединений. 2008. Т. 44. №2. С. 141-143.
6. Markham K.R. Techniques of Flavonoid Identification. London, 1982. P. 113.
7. Литвиненко В.И., Максютина Н.П. Спектральное исследование флавоноидов. Обнаружение свободных фенольных оксигрупп в различных положениях // Химия природных соединений. 1965. Т. 4. №3. С. 420-425.
8. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The Systematic Identification of Flavonoids. New York, 1970. 354 p.
9. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды). М., 1977. С. 87-93.
10. Плиев Т.Н. Молекулярная спектроскопия: в 5-ти т. Владикавказ, 2004. Т. 3. C. 573-600.
11. Misra L.N., Siddiqi S.A. Dhaincha (Sesbania bispinosa) leaves: A good source for antidiabetic (+)-pinitol // Current Science. 2008. V. 87. №11. P. 1507.
Поступило в редакцию 5 марта 2009 г.
