CC BY
94
УДК 579.222
НОВІ ШТАМИ-ПРОДУЦЕНТИ БУТАНОЛУ.
ІІ. ФЕРМЕНТАЦІЯ ЛІГНОЦЕЛЮЛОЗНОЇ
СИРОВИНИ
ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України», Київ
E-mail: Shulga5@i.ua
Отримано 07.02.2014
Мета роботи — дослідження родової та видової спорідненості вітчизняних штамів-продуцентів, здійснення порівняльного за продуктивністю скринінгу штамів-продуцентів бутанолу, проведення ферментації з використанням цукрів, які входять до складу відновлювальної лігноцелюлозної сировини, та визначення умов підвищення виходу бутанолу. Об’єктами дослідження були штами Clostridium acetobutylicum ІМВ В-7407 (IFBG СбН), IFBG C4B та IFBG C7P із «Колекції штамів мікроорганізмів і ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біотехнології» Інституту харчової біотехнології та геноміки НАН України. Вивчено вплив середовища на синтез бутанолу та визначено параметри культивування. Показано, що штами-продуценти бутанолу із зазначеної колекції більш продуктивні на середовищі ТГД порівняно з існуючими в інших колекціях і в подальшому їх можна використовувати для вдосконалення технології одержання бутанолу.
Ключові слова: біобутанол, лігноцелюлоза, штами-продуценти.
О. О. Тігунова С. М. Шульга
Виробництво рідких органічних продуктів і палива, передусім етанолу та бутанолу, з відновлювальної сировини (біомаси) в останні роки розвивається швидкими темпами [1-4]. Промислове виробництво розчинників відбувається з використанням запатентованих клостридіальних штамів-продуцентів [5-8]. Історично майже всі штами клостри-дій, що продукували розчинники, віднесено до C. acetobutylicum. Лише у декількох штамів C. acetobutylicum було детально вивчено біохімічні, генетичні та фізіологічні властивості й виявлено характерні відмінності між ними [9-11]. Найбільш універсальним і точним способом ідентифікації різних мікроорганізмів є аналіз нуклеотидної послідовності генів, що кодують рибосомальну РНК [10].
Найважливішим фактором одержання не тільки біобутанолу, але й виробництва біопалив загалом є використання дешевих субстратів. Одним із таких субстратів є рослинна біомаса. Для створення ефективної промислової (комерційної) технології виробництва біобутанолу з максимальним накопиченням кінцевого продукту потрібно мати високопродуктивні штами, знайти оптимальні умови культивування і використовувати дешеві субстрати з відновлювальної сировини. Окрім цих чинників накопичення бутанолу можна також збільшити, змінивши метаболічні шляхи синтезу.
Метою роботи було визначення родової та видової спорідненості вітчизняних шта-мів-продуцентів, здійснення порівняльного за продуктивністю скринінгу штамів-про-дуцентів бутанолу, проведення ферментації з використанням цукрів, які входять до складу відновлювальної лігноцелюлозної сировини, та визначення умов підвищення виходу бутанолу.
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були штами ІМВ В-7407 (ІЕБО С6Н), ІЕБО С4В та ІЕБО С7Р із «Колекції штамів мікроорганізмів і ліній рослин для харчової та сільськогосподарської біо-технології» (далі — Колекція) Інституту харчової біотехнології та геноміки НАН України.
Як активаційне середовище використовували середовище Виноградського і скибки картоплі, натерті крейдою, як ферментаційне середовище — мелясу [1]. Для вивчення продуктивності штамів на різних джерелах вуглецю застосовували середовище Р2 [12].
Для визначення біоконверсії лігноцелю-лозної сировини культурами використовували середовище Омелянського такого складу (в г на 1 л водогінної води): МН4С1 — 1,0; К2НР04 — 0,5; СаС03 — 1,0; фільтрувальний папір — 10,0. Стерилізацію проводили протягом 30 хв (тиск 0,5 атм).
Чистоту культур визначали, використовуючи середовище МАВ [1].
«Живі» препарати забарвлювали розчином Люголя, а для вітального забарвлення використовували метиленовий синій. Мікроскопію проводили за допомогою мікроскопа Laboval (Німеччина). Знімки робили фотоапаратом Canon PowerShot A640 (Японія).
Культивування продуцента бутанолу здійснювали за методикою [1]. Вплив терміну ферментації на синтез бутанолу культурами вивчали за максимальним накопиченням бутанолу та визначенням інших продуктів бродіння в інтервалі від 1 до 9 діб. Після цього клітини осаджували за допомогою ультрацентрифуги Labofuge 400R (Німеччина), супернатант переганяли й визначали продукти бродіння.
Для виявлення масляної кислоти в куль-туральній рідині використовували реакцію утворення маслянокислого заліза [1]. Його кількість вираховували за допомогою фотоколориметра КФК-5 (к = 540 нм, вихідне середовище слугувало стандартом). У куль-туральній рідині виявляли етанол, бутанол та ацетон за допомогою методики [1].
З метою визначення природної стійкості до антибіотиків штамів-продуцентів бутано-лу відбирали антибіотики з основних груп: макроліди — азитроміцин, еритроміцин; аміноглікозиди — гентаміцин; нітрофура-ни — ніфуроксазид; ароматичні полікетидні антибіотики — тетрациклін; сульфаніламіди — гросептол, бісептол, сульфадиметоксин. Бактерії висівали на середовище, яке містило 20 мкг/мл відповідних антибіотиків [13]. Для визначення продукції рибофлавіну у молоці використовували коров’яче молоко 2,8%-ї жирності. Бактерії для виділення ДНК культивували на збагаченому м’ясо-пептонному бульйоні за температури 37 “С протягом доби (склад середовища: м’ясопеп-тонний бульйон — 0,1 л; глюкоза — 0,1 г; дріжджовий екстракт — 0,5 г).
Виділення ДНК проводили згідно з [14]. Для ефективнішого лізису клітин додавали 1%-й розчин лізоциму (10 мг/мл). Електрофоретичне розділення виділеної ДНК здійснювали в трис-ацетатній буферній системі. Склад трис-ацетатного буфера (50х) на 1 л: трис-НСІ — 242 г, крижана оцтова кислота — 57 мл, 0,5 М ЕДТА — 100 мл.
Полімеразну ланцюгову реакцію проводили на ампліфікаторі Mastercycler personal 5332 (Eppendorf) у пробірках з ультратон-кими стінками. Реакційна суміш складалася з однократного ПЛР-буфера із сульфатом амонію, 0,2 мкМ відповідних праймерів (до
фрагмента 16S РНК з 27-го по 907-й нуклеотид), 200 мкМ кожного з дезоксинуклео-тидтрифосфатів, 0,5 од. Taq-полімерази, 2,0 мМ хлориду магнію, 10-50 нг проби ДНК. Загальний об’єм реакційної суміші дорівнював 20 мкл. Умови ампліфікації: початкова денатурація: 94 “С — 3 хв; 95 “С — 30 с, 57 “С — 45 с, 72 “С — 30 с; кількість циклів — 32. Кінцева елонгація: 72 “С — 5 хв.
Електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації здійснювали в трис-ацетатній буферній системі. Фрагмент виділяли з агарозного гелю за допомогою набору Macherey-Nagel NucleoSpin Extract згідно з інструкцією фірми-виробника.
Послідовності секвенували на автоматичному секвенаторі ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Результуючий контиг секвенування одержували, порівнюючи пряму та зворотно-комплементарну послідовності з використанням програми CLC Main Workbench (CLC bio). Аналіз сиквенсу проводили за допомогою програмного забезпечення MEGA5, включаючи алгоритм CRUSTAL V.
Статистичну обробку здійснювали із застосуванням програми Microsoft Excel. Досліди виконували в трьох повторах. Різницю між двома середніми величинами вважали вірогідною за Р < 0,05.
Результати та обговорення
Для порівняльного скринінгу C. aceto-butylicum IFBG C6H серед споріднених штамів було визначено послідовність нуклеоти-дів із 16S рРНК.
З метою визначення родової спорідненості штамів виділили та секвенували фрагмент послідовності (рис. 1). На основі цих даних здійснено порівняльний аналіз визначеної нуклеотидної послідовності генів 16S
Рис. 1. Електрофореграма фрагмента 16S РНК C. acetobutylicum IFBG C6H
РНК із послідовностями бази даних ОепБапк. Результати аналізу показали, що гомологія
з існуючими штамами (С. acetobutylicum 824, C. acetobutylicum 512, C. acetobutylicum Б8М 1731, C. saccharoperbutylacetonicum N 1-4, C. saccharolyticum К 10) перевищує 90%.
Видову спорідненість штамів із Колекції визначали, застосовуючи фенотиповий прийом — синтез штамами рибофлавіну в молочному середовищі (рис. 2).
Рис. 2. Сквашування молока штамами C. butylicum IFBG C7P та C. acetobutylicum
IFBG C6H (Р та Н на фото, відповідно)
Культури ІЕБО С6Н та ІЕБО С7Р сквашували молоко після 56 та 48 год культивування, відповідно. Обидві культури упродовж 10 діб культивування за температури
4 °С не змінювали забарвлення середовища (рис. 2), що свідчило про низьку концентрацію рибофлавіну. Порівнюючи результати з даними літератури [10], можна зробити висновок про спорідненість штамів з культурою С. вассНагорггЬиіуІасгіопісит.
Окрім синтезу рибофлавіну в молочному середовищі, застосовували й інший феноти-повий прийом — визначення рівня продукції бутанолу на середовищі ТГД (рис. 3).
Обидві культури — С. ЬиіуІісит ІЕБО С7Р та С. асгіоЬиіуІісит ІЕБО С6Н — на середовищі ТГД продукували бутанол у концентрації 1 г/л та 1,5 г/л, відповідно. Порівнюючи результати з даними літератури [10], дійшли висновку, що штами ІЕБО С7Р та ІЕБО С6Н більш продуктивні на середовищі ТГД, ніж усі види роду С. асгіоЬиіуІісит.
Було також проведено видову ідентифікацію штамів-продуцентів бутанолу з Колекції за такою фенотиповою ознакою, як стійкість бактерій до антибіотиків. Дані про резистентність мікроорганізмів до антибіотиків є важливими для їх генетичного аналізу та, зокрема, у разі отримання мутантів. В експе-
риментах з генної інженерії часто використовують рекомбінантні ДНК, які містять маркерні гени резистентності до антибіотиків, хоча для виділення резистентних мутантів можна застосовувати і пряму селекцію [13]. Для виявлення природної стійкості шта-мів-продуцентів бутанолу з Колекції було досліджено їхню чутливість до антибіотиків (табл. 1).
Із наведених даних випливає, що обидва штами-продуценти є чутливими до гентамі-цину, штам ІЕБО С7Р — до еритроміцину та тетрацикліну, а ІЕБО С6Н — до бісепто-лу. Результати дослідження підтверджують належність культур до різних видів однієї родини. У подальшому для культивування С. асгіоЬиіуІісит ІЕБО С6Н використовували середовища з тетрацикліном, а для культивування С. ЬиіуІісит ІЕБО С7Р — з бісептолом.
Для визначення впливу різних джерел вуглецю на синтез бутанолу було досліджено процес зброджування компонентів біомаси — цукрів, які входять до складу геміцелюлоз [5].
Таблиця 1. Чутливість штамів-продуцентів бутанолу до антибіотиків
Антибіотик C. acetobutyli-cum IFBG C6H C. butylicum IFBG C7P
Гросептол - -
Азитроміцин - -
Тетрациклін - +
Бісептол + -
Сульфадиметоксин - -
Ніфуроксазид - -
Гентаміцин + +
Еритроміцин - +
Примітка: «-»
— культура не чутлива,
— культура чутлива.
C. butylicum IFBG C7P C. acetobutylicum IFBG C6H
Бутанол «Ацетон "Етанол
Рис. 3. Синтез розчинників культурами C. butylicum IFBG C7P та C. acetobutylicum IFBG C6H на середовищі ТГД
(Тут і далі: * — P < 0,05; за контроль приймали найнижчий рівень синтезу)
Культури ІРБО С6Н та ІРБО С7Р культивували на синтетичних середовищах, які містили як одне із джерел вуглецю ксилозу, арабінозу, манозу та целюлозу.
Штами зброджували всі цукри, які входять до складу геміцелюлоз (рис. 4). Максимальний вихід бутанолу (1,9 г/л) для штаму ІРБО С6Н фіксували у разі використання ксилози, а для штаму ІРБО С7Р (1,3 г/л) -целюлози. Отже, штами-продуценти бутанолу
3 Колекції зброджували всі види цукрів, які входять до складу лігноцелюлозної сировини, хоча й з різною ефективністю.
Для продуктивного культивування мікроорганізмів мають значення склад середовища і технологічні умови, які забезпечуватимуть високу продуктивність накопичення біомаси і вміст необхідних метаболітів, у даному разі — бутанолу.
4 ■■ :
Я і '
ев 1
Ю І
0,5
я
с
III L i
Ксилоза Арабіноза Маноза Целюлоза
Джерело вуглецю
■ IFBG C6Н ■ IFBG 07Р
Рис. 4. Вплив джерела вуглецю на синтез бутанолу культурами IFBG C6Н та IFBG C7Р
Досліджували також вплив підготовки ензиматичного середовища для синтезу бу-танолу та оптимізації параметрів культивування. Одним із чинників, що впливають на ріст мікроорганізмів та їхню фізіологічну активність, є температура культивування. Вивчено процес накопичення бутанолу для штамів IFBG C6Н та IFBG C7Р зі зміною температури культивування. Показано, що підвищення температури з 28 до 36 “С сприяло збільшенню накопичення бутанолу для обох штамів, тимчасом як підвищення температури до 38 “С зменшувало вміст розчинника в культуральній рідині (рис. 5). Подальші дослідження проводили за температури 36 “С.
Суттєвий вплив на накопичення бутанолу має рН середовища. Досліджено вплив зміни рН середовища на синтез бутанолу штамами IFBG C6Н та IFBG C7Р.
Встановлено, що максимальне накопичення бутанолу (3,5 г/л) штамом IFBG C6K у культуральній рідині відбувалося за рН 7,0, а штамом IFBG C7Р — 2,5 г/л за рН 6,0. Коливання рН від 5,0 до 7,0 суттєво не впли-
вало на накопичення бутанолу штамом IFBG C7Р (рис. 6).
Вплив на продуктивність культивування справляє його тривалість. Було досліджено вплив терміну ферментації на синтез бутано-лу культурами IFBG C6Н та IFBG C7Р.
Показано, що максимальне накопичення бутанолу для штамів IFBG C6Н та IFBG C7Р на синтетичному середовищі за визначених раніше оптимальних умов спостерігалося на 72-гу год культивування. За подальшого культивування кількість розчинника не збільшувалась (рис. 7).
ч : ■■
О
м --
^ j N
ю 1
£
'В
]
а ::-
ік
ік.
я
£
о
у
28 32 3-І 36 38
Температура культивування, С
■ IFBGC6H - IFBG С7Р Рис. 5. Вплив температури культивування на продукування бутанолу штамами IFBG C6Н та IFBG C7Р
hk Ik і
IFBG C6Н ■ IFBG 07Р
pH
Рис. 6. Вплив pH середовища на синтез бутанолу штамами IFBG C6Н та IFBG C7Р
їй і "■
Ё? ■
& < и ' е '■ 8 '■
Ь
kh
2-І
-IS
IFBG C6R
*2 96
Час культивування
IFBG 07Р
Рис. 7. Вплив терміну культивування на накопичення бутанолу штамами IFBG C6Н та IFBG C7Р
У процесі дослідження продуктивності штамів IFBG C7P та IFBG C6H було визначено концентрацію бутанолу в культуральній рідині та проведено її порівняння з концентрацією за використання гомологічно-спо-ріднених штамів (табл. 2).
З даних табл. 2 випливає, що штами-про-дуценти бутанолу IFBG C7P та IFBG C6H є продуктивними і перспективними з метою використання як основи для вдосконалення технології одержання бутанолу.
Для вивчення ступеня біоконверсії ліг-ноцелюлозної сировини було проведено ферментацію з використанням як субстрату фільтрувального паперу (рис. 8).
Дослідження показали, що біоконверсія цієї лігноцелюлозної сировини для штаму IFBG C6H становила близько 90%, для IFBG C7P — 60%, а для IFCG C4B — 30%. У процесі культивування всі штами продукували оцтову та масляну кислоти в сумарній концентрації 4 г/л і не продукували розчинників. Культуральну рідину після біоконверсії лігноцелюлозної сировини використовували як додатковий субстрат до ензиматичного
Рис. S. Біоконверсія фільтрувального паперу:
(Н — C. acetobutylicum IFBG C6H; Р — C. butyli-cum IFBG C7P; В — C. tyrobutyricum IFCG C4B; К — контроль)
мелясного середовища, рН стабілізували, додаючи крейду. Результати культивування IFBG C7P та IFBG C6H на ензиматичному середовищі (К) з додаванням культуральної рідини подано на рис. 9.
Результати культивування свідчать, що використання культуральної рідини після біо-конверсії як додаткового субстрату до ензиматичного середовища лігноцелюлозної сировини збільшувало вихід бутанолу для IFBG C6H на 20%, а для IFBG C7P — майже на 35%.
Одержані дані дали змогу в подальшому використовувати культуральну рідину після біоконверсії лігноцелюлозної сировини для підвищення продуктивності штамів.
Таким чином, у результаті досліджень встановлено, що гомологія штамів-продуцентів бутанолу з Колекції з існуючими штамами інших колекцій становила більше 90%. За допомогою фено-типових прийомів показано найбільше споріднення штамів із Колекції зі штамами
и
£
о
у
і:
іо
8
6
4
C. butylicum IFBG C7P C. acetobutylicum IFBG C6H
■ З додаванням кислот ■ Контроль
Рис. 9. Культивування C. butylicum IFBG C7P та C. acetobutylicum IFBG C6H на ензиматичному середовищі (К) з додаванням культуральної рідини після біоконверсії лігноцелюлози
Таблиця 2. Синтез розчинників штамами-продуцентами бутанолу
Штами-продуценти Вихід АБЕ- (ацетону-бутанолу-етанолу) продуктів (г/л) на середовищі Р2 з різними джерелами вуглецю
Глюкоза Ксилоза Арабіноза Целюлоза
C. acetobutyricum 824 5,7:10:1,1 [14,15] 0,2:1,9:0,2 [16,17] 0,2:1,9:0,2 [18] 0,1:2,4:0,2 [19]
C. beijerinckii NCIMB 8052 1,7:5,1:4,59 [20] 0,89:2,7:2,4 [21] 0,89:2,6:2,4 [22] 1,4:4,2:3,78 [22]
C. acetobutyricum DSM 1731 0,5:11:2 [23] Немає даних Немає даних Немає даних
C. saccharoperbutylacetonicum N 1-4 0,56:4,86:0,85 [12] 0,84:1,23:0,15 [12] 0,84:1,23:0,15 [12] 0,11:0,25:0,04 [12]
C. acetobutyricum IFCG C6R 0,7:8*:0,05 0,019:1,9*:-** 0,02:1,5:0,01* 0,013:1,1:0,01*
C. butylicum IFBG C7P 0,2:6*:0,03 0,015:1,3:0,02* 0,018:0,8:- ** 0,02*:1,3:- **
Примітка: * — за контроль приймали найнижчий рівень синтезу; ** — не продукують.
С. вассНагорггЬиіуІасгіопісит. Природна стійкість до антибіотиків подібна до стійкості клостридіальних штамів відповідних видів, що є також одним із підтверджень належності цих штамів до клостридій. Результати свідчать, що штами із Колекції продукують більше бутанолу на середовищі ТГД, ніж інші види С. асгіоЬиіуІісит. Показано, що штами ІЕБО С7Р та ІЕБО С6Н у разі культивування окремих складових лігноцелюлозних субстратів зброджували усі цукри, які входять до складу геміцелюлоз. У результаті порів-
няльного скринінгу зі штамами інших колекцій було встановлено, що штами ІЕБО С7Р та ІЕБО С6Н є продуктивними і в подальшому їх можна використовувати для вдосконалення технології виробництва бутанолу. Оптимізо-вано умови культивування штамів (Т = 36 °С, рН 5-7, термін культивування 3 доби) і знайдено технологічний прийом (використання культуральної рідини після біоконверсії ліг-ноцелюлозної сировини як додаткового субстрату до ензиматичного середовища) для підвищення виходу бутанолу.
REFERENCES
1. Tigunova O. O., Shulga S. M. New producer strains of biobutanol. I. Isolation and identification. Biotechnologia Acta. 2013, 6(1), 97-104. (In Ukrainian).
2. Oliynichuk S., Kizun G, Shiyan P., Sosnitskiy V. Modern and perspective technologies of biological fuel in the world market. Kharchova ta pererobna promyslovist. 2009, 6(358), 11-13. (In Ukrainian).
3. Pletnev I. Y. Waste as a source of biodiesel products with high added value. Biotech-nologiia. 2009, V. 1, P. 3-10. (In Russian).
4. Tigunova O. O., Shulga S. M., Blume Y. B. Biobutanol as an Alternative Type of Fuel. Cytologia i Genetica. 2013, 47 (6), 51-71.
5. Tigunova O. O., Shulga S. M. Obtaining of new butanol producers. Abstracts of the 15th European Congress of Biotechnology, Istambul, Turkey, 23-29 September 2012.
6. Shulga S. M., Tigunova O. O., Blume Y. B. Lignocellulose as an alternative source for obtaining of butanol. Biotechnologia Acta. 2013, 6(2), 9-21. (In Ukrainian).
7. Tigunova E. A., Shulga S. M. Synthesis butanol strains C. acetobutylicum on alternative substrates. Proceedings of the 7th International Congress Biotechnology: State and Prospects for Development, Russia, Moscow, 19-22 March 2013. (In Russian).
8. Ablaev A. P. Big oil and biofuels. Biotechno-logiia. 2011, V. 3, P. 8-14. (In Russian).
9. Wilkinson S. R., Young M., Goodacre R., Morris J. G., Farrow J. A. E., Collins M. D. Phenotypic and genotypic differences between certain strains of C. acetobutylicum. FEMS Microbiology letters. 1995,125(1-2), 199-204.
10. Jonson L. J., Toth J., Santiwatanakul S., Chen J. S. Cultures of “Clostridium acetobutylicum” from Various Collections Comprise Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, and two other Distinct Types Based on DNA-DNA Reassociation. Int. J. System. Bact. 1997, 47(2), 420-424.
11. Keis S., Bennett C. F., Ward K. V., Jones D. T. Taxonomy and Phylogeny of industrial
solvent-producing clostridia. Int. J. System. Bacteriol. 1995, 45(4), 693-705.
12. Al-Shorgani N. K. N., Kalil N. S., Yusoff W. M. W. The effect of different carbone sources on biobutanol production using C. saccharo-perbutylacetonicum N 1-4. Biotechnology. 2011, 10(3), 280-285.
13. Fedorenko V., Ostash B., Rebets Y., Gonchar M. Large workshop on genetics, genetic engineering and biotechnology analysis of microorganisms. Lviv. 2007. 279 p. (In Ukrainian).
14. Linggang S., Phang L. Y., Wasoh H., Abd-Aziz S. Acetone-Butanol-Ethanol Production by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Using Sago Pith Residues Hydrolysate. BioEnergy Research. 2013, 6(1), 321-328.
15. Colass F., Kuit W., Clement B., Marchal R., Lopez-Contreras A. M., Monot F. Simultaneous production of isopropanol, butanol, ethanol and 2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 engineered strains. AMB Express. 2012, 2(45), 1-10.
16. Xiao H., Gu Y, Ning Y., Yang Y,, Mitchell W. J., Jiang W., Yang S. Confirmation and elimination of xylose metabolism bottlenecks in glucose phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system-deficient Clostridium acetobutylicum for simultaneous utilization of glucose, xylose, and arabinose. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(22), 7886-7895.
17. Yong C., Tao Z., Dong L., An L., Songbo X., Qingguo L., Bingbing L., Hanjie Y. Production of butanol from glucose and xylose with immobilized cells of Clostridium acetobutylicum. Biotechnology & Bioprocess Engineerin. 2013, 18(2), 234-241.
18. Sivagnanam K., Raghavan V. G. S., Shah M. Characterization of Clostridium aceto-butylicum Protein Interaction Network from Butanol Fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(9), 5238-5243.
19. Lopez-Contreras A. M., Gabor K., Martens A. A., Renckens B. A., Claassen P. A., Van Der Oost J., De Vos W. M. Substrate-Induced
Production and Secretion of Cellulases by Clostridium acetobutylicum. Appl. Environ. Microbiol. 2004, 70(9), 5238-5243.
20. Lopez-Contreras A. M., Smidt H., van der Oost J., Claassen P. A., Mooibroek H., De Vos W. M. Clostridium beijerinckii Cells Expressing Neocallimastix patriciarum Glycoside Hydrolases Show Enhanced Lichenan Utilization and Solvent Production. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67(11), 5127-5133.
21. Xiao H., Li Z., Jiang Y., Yang Y., Jiang W., Gu Y., Yang S. Metabolic engineering of D-xylose pathway in Clostridium beijerinckii to optimize solvent production from xylose
mother liquid. Metab. Eng. 2012, 14(5), 569-578.
22. Watsom J. E. Pentose Sugar Utilisation in Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 for Biobutanol Production: Genetic and Physiological Studies. A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements of Edinburgh Napier University, for award of Doctor of Philosophy, 2012. 229 p.
23. Lutke-Everslohand T., Bahl H. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum: recent advances to improve butanol production. Cur. Opin. Biotechnol. 2011, 22(5), 1-146 DOI: 10.1016/j.copbio.2011.01.011.
НОВЫЕ ШТАММЫ-ПРОДУЦЕНТЫ БУТАНОЛА. П. ФЕРМЕНТАЦИЯ ЛИГНИНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ
Е. А. Тигунова С. М. Шульга
ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики» НАН Украины, Киев
E-mail: Shulga5@i.ua
Цель работы — исследование родового и видового родства отечественных штаммов-продуцентов, осуществление сравнительного по производительности скрининга штаммов-продуцентов бутанола, проведения ферментации с использованием сахаров, входящих в состав восстановительного лигноцеллюлоз-ного сырья и определение условий повышения выхода бутанола. Объектами исследования были штаммы Clostridium acetobutylicum 1МВ В-7407 (IFBG C6H), IFBG C4B и IFBG C7P из «Коллекции штаммов микроорганизмов и линий растений для пищевой и сельскохозяйственной биотехнологии» Института пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины. Изучено влияние среды на синтез бутанола и определены оптимальные параметры культивирования. Показано, что штаммы-продуценты бутанола из этой коллекции являются более продуктивными по сравнению с существующими в других коллекциях и в дальнейшем могут использоваться для усовершенствования технологии получения бута-нола.
Ключевые слова: биобутанол, лигноцеллюло-за, штаммы-продуценты.
NEW STRAINS PRODUCER OF BUTANOL.
П. RENEWABLE LIGNOCELLULOSE FERMENTATION
O. O. Tigunova
S. M. Shulga
State Organization «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: Shulga5@i.ua
The purpose of our work was to study generic and specific affinity of domestic strains-producers, comparative productivity butanol strains-producers screening, fermentation of sugars being a part of renewable lignocellu-lose raw materials and to determine the conditions for the butanol yield increasing. The objects of research were strains Clostridium acetobutylicum 1МВ В-7407 ("IFBG C6H), IFBG C4B and IFBG C7P from «Collection microorganism’s stains and plants line for food and agriculture biotechnology» of Institute of Food Biotechnology and Genomics of the National Academy of Sciences of Ukraine. It was determined that domestic butanol-producing strains were relatively more productive and might be promising for improvement technology of butanol production.
Key words: biobutanol, lignocellulose, strains producer.
