CC BY
220
УДК 619:616.98:579.873.21:636.22.28
НОВЫЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
Якупов Т.Р.
ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана»
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ВЛКРС,
антитела, ИФА, иммуноблотинг, иммунные комплексы.
Key words: leucosis of cattle, BLV, antibodies, ELISA, Immunobloting, immune complexes.
Лейкоз крупного рогатого скота относится к числу наиболее распространенных хронических инфекционных болезней
сельскохозяйственных животных во многих странах мира, включая Россию. В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота распространен во многих субъектах Российской Федерации. По официальным данным в России на конец 2007 г. имеется 2411 неблагополучных пунктов, а доля лейкоза в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота составляет более 50 %. Уровень инфицированности крупного рогатого скота ВЛКРС составляет в среднем по стране 10,5 %, а в отдельных регионах достигает 20-40% и выше.
Отношение к этой инфекции двоякое: либо её игнорируют, либо уничтожают больных животных или изолируют их. Какой-либо
общепризнанной и распространенной терапии этого заболевания не существует.
Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими, молекулярно-биологическими, гематологическим, клиническим и патоморфологическим методами. Несвоевременная
диагностика лейкоза, связанная с использованием разноплановых методов исследования, не обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью, является одним из сдерживающих факторов эффективности оздоровительных мероприятий.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) относится к семейству ретровирусов, роду дельтаретровирусов. Геномная молекула РНК ВЛКРС не инфекционна, тогда как вирион, в котором находятся две таких молекулы РНК, ею обладает (1). Транскрипция вирусных и РНК возможна только, если вирусная ДНК встроена в геном клетки и она чаще происходит в незрелых В-лимфоцитах, чем зрелых (2). Если провирус оказывается в активной зоне хромосомы, он может функционировать сразу, если в молчащей - то длительное время может себя не проявлять.
Это зависит от многих факторов в конкретной клетке соответствующей фазе её развития.
Изучение гуморального и цитотоксического ответа на ВЛКРС инфекцию показало, что к 1-8 неделе после инокуляции появляется признак инфекции - гуморальный антивирусный ответ. В высоких титрах синтезируются антитела к эпитопам структурных (gp51), капсидных (р24) и регуляторных белков. Уровень цитолитических антител увеличивается при прогрессировании болезни до острой фазы. Такая антивирусная активность поддерживается в течение жизни животного, показывая, что иммунная система стимулируется постоянно антигенами вируса.
Таким образом, постоянным и характерным признаком инфицированности животных является наличие антител к антигену ВЛКРС, следовательно, одним из важных моментов в диагностике лейкоза крупного рогатого скота является выявление инфицированных животных с помощью разных серологических методов.
В настоящее время согласно стандартам МЭБ (OIE. World Animal Health in 2005) узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). Ранее считали, что применение ИФА для выявления анти-ВЛКРС антител ограничено коротким промежутком времени, так как уровень специфических антител растет очень быстро и в связи с этим все методы диагностики равны по эффективности. Отчасти это действительно так, если иметь дело с классическим течением инфекционного процесса, однако существует немало факторов, влияющих на их чувствительность. К ним относятся инкубационный период болезни, продолжительность которого может быть до 2 месяцев, и вторичные иммунодефициты, обусловленные пред- и послеродовым периодом у коров, некоторыми инфекционными и инвазионными болезнями, применением живых вакцин, а также особенности образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).
Известно, что при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, в биологических жидкостях организма появляются иммунные комплексы «антиген-антитело», которые имеют определенное значение в патогенезе этих инфекций.
Связывание вирусов антителами, лишенными нейтрализирующей активности, имеет одно необычное патологическое следствие: эти
иммунные комплексы в результате взаимодействия с Fc-рецепторами поглощаются макрофагами, в которых вирус восстанавливает свою инфекционность (Абелян А.В., 1997). Вполне возможно, что одна из причин «феномена рецидивов» ВЛКРС инфекций в ранее оздоровленных стадах именно в этом. Кроме того, в результате исследований по выяснению структуры ЦИК нами доказано, что иммунные комплексы
могут содержать провирусную ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Роль этих комплексов в патогенезе ВЛКРС инфекции не известна. Возможно, они формируются в процессе гибели инфицированных В-лимфоцитов путем соединения не встроенных в геном вирусных ДНК с поверхностными ^М, обладающими высокой аффинностью к ДНК. Очевиден тот факт, что появляются они в более поздних стадиях болезни при выраженной вирусемии организма, когда животное становится потенциально опасным источником перезаражения стада.
Гематологические изменения в этот период могут оставаться стабильными. Поэтому при лейкозе крупного рогатого скота окончательная постановка диагноза должна быть направлена на обнаружение ДНК вируса в ЦИК методом ПЦР, что исключит необходимость гематологических исследований и повысит эффективность противолейкозных мероприятий.
Иммунные комплексы в сыворотке крови человека и животных могут формироваться из любых классов или подклассов иммуноглобулинов. По данным Ц^аг^агоп Н. й а1. (1992) иммунные комплексы в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и и ^М. Соотношение антител в комплексах
(«связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркулирующих иммунных комплексов. При этом титры свободных антител могут снижаться до минимальных значений. Эти данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.
Изучению ЦИК в сыворотке крови и молоке при лейкозе крупного рогатого скота посвящен ряд исследований отечественных и зарубежных исследователей. Большинством из них отмечается, что определение ЦИК имеет большое значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу и может служить индикатором инфицированности животных вирусом.
Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа с выявлением специфических антител в составе иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке является весьма перспективным в повышении эффективности диагностических мероприятий и ликвидации этого заболевания.
Существуют различные способы диссоциации иммунных комплексов, которые основаны, главным образом на изменение значений рН и ионной силы раствора, на применение ферментов и др. Однако все эти методы приводят к снижению биологической активности антител и, в конечном итоге, к резкому снижению чувствительности сеологических методов при их определении.
Нами разработан способ обработки проб сыворотки крови и молока позволяющий диссоциировать ЦИК при лейкозе и выявлять в ИФА «связанные» антитела без изменения их активности. В своих ранних исследованиях, методом осаждения в ПЭГ, нами были выделены иммунные комплексы, как в пробах сыворотки крови, так и молока от больных лейкозом коров. Активность «связанных» антител изучали в ИФА и титры достигали до 1:1024 (5). Определение специфичных антител в составе иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови и молоке не менее чем на 20%.
Важным преимуществом иммуноферментных методов перед РИД является то, что ИФА, будучи более чувствительным, позволяет выявлять специфические антитела в пробах молока, молозива и сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения данного метода, а также трудности, связанные с взятием крови и созданием стрессовых ситуаций для животных, то исследования проб молока и сборного молока являются привлекательными для оценки благополучия хозяйств (мониторинга) по лейкозу крупного рогатого скота.
О высокой информативности ИФА проб молока в диагностике лейкоза отмечают многие исследователи (Nguyen V.K., Maes R.F., 1993; Sargeant J.M., Kelton D.F et al., 1997; Rosskopf M. et al., 1994 и др.). Результаты данных, а также других исследований свидетельствуют о более низкой эффективности ИФА молока в диагностике лейкоза крупного рогатого скота по сравнению с ИФА сывороток крови. Однако возможность повышения чувствительности данного метода, путем предварительной диссоциацией иммунных комплексов в исследуемых пробах, открывает большие перспективы для широкого применения его в практике, как менее трудоемкого. ИФА молока с предварительной диссоциацией ЦИК по чувствительности превосходит РИД анализ в диагностике лейкоза, что в конечном итоге проявляется в более полном выявлении инфицированных ВЛКРС животных. Особенно ценен данный метод для мониторинга эпизоотической ситуации в хозяйствах по сборному молоку.
Считается, что уровень специфических антител отражает степень активности инфекционного заболевания. У зараженных ВЛКРС животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, р10, gp30, gр51 и другим антигенам. В настоящее время большинство серологических реакций применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота направлены на выявление анти^р51 антител. Однако титры и спектр антител меняется с развитием инфекционного процесса.
Одним из доказательств этого утверждения являются результаты наших исследований по определению степени активности и спектра
антител против ВЛКРС в иммунохимических реакциях с антигенами вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). При этом установлено, что антитела против антигенов ВЛКРС перекрестно реагируют с как неструктурными (р55, р40), так и структурным (р24/25) белком гена gag ВИЧ в иммунохимической реакции. Степень гомологии анти-ВЛКРС антител к полипептидам ВИЧ резко меняется с развитием инфекционного процесса. Увеличение титра антител против gр51 ВЛКРС в крови у больных лейкозом коров не всегда сопровождается увеличением титра перекрестно-реагирующих антител к антигенам ВИЧ. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител меняется.
Данный факт свидетельствует о недостаточной эффективности серологических методов, основанных на выявление антител только против одного антигена.
В заключении следует отметить, что наиболее перспективным, в исключении недостатков существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, может являться применение методов иммуноблот анализа.
Иммуноблотинг позволит изучать титры и спектр антител против всех антигенов ВЛКРС, а также продуктов их расщепления. Изучение спектра и динамики образования антител, ЦИК в крови и молоке животных по стадиям развития инфекции, определение взаимосвязи между антительным спектром и появлением в ЦИК провирусной ДНК позволили бы стандартизировать параметров и разработать тест-систему для диагностики лейкоза методом иммуноблотинга. Такая тест-система способна при массовых исследованиях заменить все серологические и гематологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Сергеев В.А. Структура и биология вирусов животных/ В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин// М. «Колос».- 1983.- с.36; 2. Хазипов Н.З. Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на неё/ Н.З.Хазипов, Р.П.Тюрикова// Ученые записки КГАВМ.- Казань.- 2008.- Т.192.- с.152-160; 3. Абелян А.В.
Иммунологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа/ А.В.Абелян// Успехи современной биологии.- 1997.- Т.117.-№5.- с.549-967; 4. Ungar-Waron H. Circulating immune complexes in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle/ H.Ungar-Waron, J.Brenner, R.Paz, Z.Trainin// Vet.Immunol.Immunopathol., 1992 Oct: 34 (1-2): 173-9; 5. Якупов Т.Р. Динамика изменений титров «свободных» и «связанных» антител у инфицированных ВЛКРС коров// Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов// Ученые записки КГАВМ.-2009.- Т.197.- с.150-154; 6. Nguyen V.K. evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine leukemia virus in serum and milk / V.K. Nguyen, R.F. Maes // J.Clin.Microbiol., 1993.-31(4). - 979-981.
НОВЫЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Якупов Т.Р.
Резюме
В работе описываются недостатки существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Основываясь на новые экспериментальные и теоретические данные указываются пути повышения эффективности диагностических мероприятий.
NEW APPROACHES IN DIAGNOSTICS OF BOVINE LEUKOSIS
Jakupov T.R.
Summary
In work the lacks of existing methods of diagnostics of bovine leucosis are described. Being based on the new experimental and theoretical data the ways of increase of efficiency of diagnostic actions are specified.
