CC BY
55
риамицина 500 мг/м2), интервалы между последними тремя курсами химиотерапии составляли до 5 нед.
С 1988 по 1991 г. мы интенсифицировали вышеуказанную программу использованием препаратов платины из расчета 100—120 мг/м2 на I и III этапах лечения, а также включили впервые в нашей клинике обязательное оперативное вмешательство в объеме органосохранных операций при операбельных локализациях (ребра, малоберцовая кость, ключица, лопатка), которое производили после предоперационного облучения. По второй программе лечение проведено 22 больным.
Для достижения лучших результатов лечения с 1989 г. по настоящее время мы стали использовать внутри-артериальную химиотерапию. По третьей программе лечение получили 19 детей. На I этапе проводили 4 курса регионарной ПХТ по схеме: винкристин, 1,5 мг/м2, в 1-й день в/в струйно + циклофосфан, 1200 мг/м2, в 1-й день в/в капельно + платидиам, 100—120 мг/м2, в 3-й день внутриартериально (в/а) + адриамицин, 30 мг/м2, в 4-й и 5-й дни в/а, интервалы между курсами 3 нед. На II этапе проводили облучение первичного очага поражения в СОД 57 Гр на фоне потенцирования 4 курсов ПХТ по схеме, идентичной двум предыдущим программам. При операбельных локализациях — органосохранная операция. На последнем этапе проводили адъювантную ПХТ (7—8 курсов) с 4-, 5-недельными интервалами между курсами. Проводили альтернирующие курсы ПХТ схемами: винкристин + адриамицин + циклофосфан +
платидиам и винкристин + адриамицин + циклофосфан в дозах и режимах введения цитостатиков, идентичных таковым на I этапе лечения. При суммарной дозе ад-риамицина 400—500 мг/м2 или имеющихся каких-либо отклонениях со стороны внутренних органов проводятся альтернирующие курсы ПХТ по схемам: винкристин, 1,5 мг/м2, в 1, 8 и 15-й дни в/в + циклофосфан, 400 мг/м2, в 1, 8 и 15 дни в/в + дактиномицин, 10—15 мкг/кг,
© Н. Е. Кушлинский, 1998 УДК 616.71-006.04
Н. Е. Кушлинский
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ В СОВРЕМЕННОЙ ОСТЕОЛОГИИ
НИИ клинический онкологии
Нарушение регуляции пролиферативных процессов является одним из основных механизмов возникновения и развития злокачественных новообразований [4, 6, 10, 24].
В экспериментальных исследованиях последних десятилетий установлено, что одним из путей ухода опухолевых клеток из-под рострегулирующего контроля организма может служить продукция ими или окружающими стромальными клетками полипептидов, стимулирующих пролиферацию, так называемых факторов роста. К числу наиболее известных и экспериментально изученных ауто- и паракринных регуляторов опухолевого роста относятся эпидермальный (ЭФР) и а-трансформи-
age and schedule similar to stage I. On achieving a total adriamycin dose 400-500 mg/m2 or in cases with visceral disorders we performed alternating PCT as follows: vincristine 1.5 mg/m2 on days 1, 8 and 15 i. v. + cyclophosphane 400 mg/m2 on days 1, 3, 15 i. v. + dactinomycin 10-15 mcg/kg on days 2, 5, 9 and 14 i. v. + methotrexate 0.5-1.0 mg/kg on days 2, 5, 9 and 14 i. v. (the cytostatics were administered by bolus) and vincristine 1.5 mg/m2 on day 1 i. v. bolus + vepeside 120 mg/m2 on days 1, 2, 3 by i. v. drip + dactinomycin 450 mcg/m2 on days 1, 2, 3 by i. v. drip + cyclophosphamide 400 mg/m2 on days 1, 2, 3 by i. v. drip.
The 2-year survival of all children receiving the above-mentioned treatment is 42% for the first program, 56% for the second and 85% for the third programs, 2-year disease-free survival is 51, 69 and 91%, respectively.
The study results prove reasonable the use of the third program to improve outcomes of treatment for Ewing sarcoma.
во 2, 5, 9 и 14-й дни в/в + метотрексат, 0,5—1 мг/кг, во 2, 5, 9 и 14-й дни в/в (введение цитостатиков струйное) и винкристин, 1,5 мг/м2, в 1-й день в/в струйно + вепезид, 120 мг/м2, в 1, 2, 3-й дни в/в капельно + дактиномицин, 450 мкг/м2, в 1, 2, 3-й дни в/в капельно + циклофосфан, 400 мг/м2, в 1, 2, 3-й дни в/в капельно.
Двухлетняя выживаемость всех детей с использованием вышеуказанных программ составляет 42% при первой программе, 56% — при второй и 85% — при третьей программе.
Результаты исследования свидетельствуют о перспективности применения третьей программы для повышения эффективности лечения детей с саркомой Юинга.
Поступила 05.11.97 / Submitted 05.11.97
N. E. Kushlinsky
NEW APPROACHES TO ANTITUMOR THERAPY IN MODERN OSTEOLOGY
Research Institute of Clinical Oncology
Disregulation of cell proliferation is a main mechanism of malignancy development [4, 6, 10, 24].
As demonstrated by experimental findings over the last decades, production of proliferation-stimulating polypeptides or so called growth factors by tumor cells or surrounding stromal cells is a way for tumor cells to avoid growth regulation by the body. Epidermal (EGF) and a-transforming (a-TGF) growth factors interacting with a common cell membrane receptor are the most known and experimentally studied auto/paracrine tumor growth regulators.
EGF receptor (EGFR), a large transmembrane glycoproteid with a molecular weight 170,000 dalton,
рующий (а-ТФР) факторы роста, взаимодействующие с общим рецептором на мембранах клеток.
Рецептор ЭФР (РЭФР) — крупный трансмембранный гликопротеид с мол. массой 170 ООО Д — является продуктом одного из онкогенов семейства erb — c-erb В1, его структура (главным образом структура внутриклеточного домена) гомологична структуре продуктов некоторых других онкогенов группы erb (c-erb В2, v-erb В, HER2/neu) и относится к числу так называемых рецепторных тирозинкиназ (РТК), важнейших регуляторов клеточной пролиферации и злокачественной трансформации [12, 20, 44].
Различают РЭФР с высоким (Kd порядка 10 10 М) низким (Kd составляет 10JJ—10 * М) сродством к лигандам. Функциональное значение каждого из этих видов РЭФР пока четко не разграничено.
Принципиальным отличием РТК от нерецепторных тирозинкиназ, также являющихся продуктами некоторых важнейших онкогенов, например v-src, v-abl и brc-alb, является их трансмембранная локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим полипептидным лигандом для реализации киназной активности. Помимо собственно ЭФР, специфическими лигандами РЭФР являются a-трансформирующий фактор роста (а-ТФР), фактор роста вируса Vaccinia, а также открытые относительно недавно пептиды амфи-регулин, cripto, бетацеллюлин, связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор [8, 17, 34, 43]. Все эти лиганды представляют собой небольшие пептиды, состоящие примерно из 40 аминокислот и имеющие мол. массу около 6000 Д. Они имеют между собой 24—40% гомологии по первичной структуре, но сходны по пространственному строению благодаря наличию консервативных последовательностей в областях трех дисульфидных мостиков, определяющих и стабилизирующих конформацию молекул. Они оказывают сходные биологические эффекты на чувствительные клетки, а также способны перекрестно индуцировать синтез друг друга.
Молекула РЭФР, как и молекулы всех РТК, состоит из трех основных доменов [12, 43]: внеклеточного N-концевого гликозилированного лигандсвязываю-щего участка, составляющего 50% всей молекулы (621 из 1173 аминокислотных остатков) и обеспечивающего специфичность восприятия сигнала; собственно трансмембранного а-спирального участка, состоящего всего из 23 гидрофобных аминокислот, и внутриклеточного тирозинкиназного домена (542 аминокислоты), аналогичного для всех РТК.
Основные события, происходящие с РЭФР в результате его взаимодействия с лигандом, представляются в настоящее время следующим образом [35, 36, 41]: непосредственно после связывания лиганда происходит димеризация рецептора, приводящая к активации ти-розинкиназы и аутофосфорилированию тирозиновых остатков С-концевого домена и изменению его конформации, способствующему связыванию и фосфори-лированию экзогенных субстратов и последующему конкурентному ингибированию аутофосфорилирования рецептора; после аутофосфорилирования лигандрецеп-
is a product of an oncogene c-erbBl belonging to the erb family with structure (mainly that of the intracellular domain) homologous to some other oncogenes from the erb group (c-erbB2, v-erbB, HER2/neu). It belongs to so called receptor tyrosine kinases (RTK), most important regulators of cell proliferation and malignant transformation [12,20,44].
There are EGFR with high (Kd about 10 10 M) and low (Kd 10-9 to 10 s M) ligand affinity. Functional distinction of these EGFR is yet unclear.
Fundamental difference of RTK from non-receptor tyrosine kinases which are also produced by some important oncogenes, e. g. v-src, v-abl, brc-alb is their transmembrane location and the necessity to bind to a relevant polypeptide ligand to effect kinase activity. Besides the EGF there are other EGFR specific ligands, such as the a-TGF, Vaccinia virus growth factor, and recently discovered peptides amphiregulin, crypto, be-tacellulin, heparin-binding EGF-like factor [8, 17, 34, 43]. All these ligands are small peptides consisting of about 40 amino acids and having a molecular weight of about 6,000 dalton. They are 24-40% homologous by primary structure though are similar by spatial structure owing to conservative sequences in regions of three disulfide bridges determining and stabilizing the molecule conformation. They produce similar biological effects on sensitive cells and are able to cross-induce synthesis of each other.
The EGFR molecule like all RTK molecules consists of three main domains [12, 43]: an extracellular N-ter-minal glycozylated ligand-binding site that is 50% of the whole molecule (612 of 1173 amino acid residues) and renders specificity of signal reception, a transmembrane а-spiral site consisting of 23 hydrophobic amino acids and an intracellular tyrosine kinase domain (542 amino acids), common for all RTK.
Main EGFR events resulting from its interaction with the ligand are as follows [35, 36, 41]. The receptor is dimerized immediately on the ligand binding, this leads to activation of the tyrosine kinase and autophosphorylation of tyrosine residues of the C-terminal domain and change in its conformation that enhances binding and phosphorylation of exogenous substrates and further competitive inhibition of the receptor autophosphorylation; after the autophosphorylation the li-gand-receptor dimers aggregate into a larger complex on cell membranes to form membrane-covered blisters and then are internalized. Phosphatidyl inositol metabolism and the ras gene system [12, 27] are most important intracellular signal systems regulated with participation of the EGFR, though the EGFR effects are not of course limited to these two systems only.
The EGFR regulatory role in bone tumorigenesis has been studied in detail in cell cultures in vitro. EGFR expression was studied both in normal and tumor-trans-formed osteoblasts in vitro to appear different in individual osteoblast cultures. High-affinity EGFR was found on cell surface of osteogenic sarcoma OST-1RF,
торные димеры агрегируют на поверхности клетки в более крупные комплексы, образуют покрытые участком мембраны пузырьки, а затем интернализуются. Среди важнейших внутриклеточных сигнальных систем, в регуляции которых участвует РЭФР, следует выделить метаболизм фосфатидилинозитола и систему гена ras [12, 27], хотя эффекты РЭФР, безусловно, не исчерпываются только этими двумя системами.
Регуляторная роль ЭФР-рецепторной системы при опухолях костей достаточно подробно исследована in vitro на клеточных культурах. Экспрессия РЭФР была исследована на нормальных и опухольтрансформиро-ванных остеобластах in vitro, при этом она была различна в зависимости от исследуемых культур остеобластов. Высокоаффинные РЭФР были найдены на поверхности клеток культуры остеогенной саркомы OST-1-PF, при этом ЭФР и а-ТФР стимулировали пролиферацию этих клеток [46]. РЭФР определялись преимущественно на быстроделящихся клетках культуры UMR 106 [10] и не обнаружены в мембранной фракции клеток культуры высокодифференцированной остеогенной саркомы крыс ROS 17/2.8 [39]. РЭФР и его лиганд — ЭФР были обнаружены иммуногистохимическим методом в опухолях у больных с остеогенной саркомой с частотой 81 и 51% соответственно, однако при этом не выявлено корреляции между экспрессией РЭФР и ЭФР [40]. Стало известно, что стимуляция РЭФР остеобластов возможна как аутокринным путем — ЭФР, продуцируемым самими остеобластами, так и паракрин-ным — взаимодействуя с ЭФР, синтезируемым клетками окружения, в частности эозинофилами костного мозга [16]. С помощью пространственного видеоанализа удалось установить различную чувствительность к гормонам и факторам роста клеток линии остеогенной саркомы UMR 106-01 в субконфлюентной монослойной культуре на различных этапах дифференцировки [18].
ЭФР-индуцированная пролиферация остеобластов обусловлена изменением потенциала плазматической клеточной мембраны, вызывающим поступление в клетку ионов кальция из внеклеточной среды [37]. ЭФР-обусловленный синтез ДНК также частично подавляется блокаторами кальциевых каналов.
ЭФР индуцирует синтез мРНК и протеина транскрипционного фактора типа zinc finger Egr-1 через путь активации протеинкиназы С и другие сигнальные пути, a Egr-1, возможно, является частью регуляторной ЭФР-зависимой системы, передающей воздействие ЭФР на рост и дифференцировку остеобластов. При взаимодействии ЭФР с остеобластами происходит активация внутриядерных сигнальных систем, приводящая к активации пролиферативной активности и дифференцировки. Механизм этой активации до конца не выяснен и может, в частности, включать мгновенную индукцию «ранних» генов, таких как Egr-1 [23].
Известно, что ЭФР вызывает быструю активацию фосфорилирования внеклеточных сигналрегулируемых киназ в клетках линии остеогенной саркомы человека G292, а также в первичных культурах остеобластов экспериментальных животных. Это фосфорилирование обратимое и времязависимое. ЭФР в культуре клеток
and the EGF and a-TGF stimulated proliferation of these cells. [46]. The EGFR was mainly discovered on rapidly proliferating cells of UMR 106 culture [10] while being absent in cell membrane fraction of well differentiated rat osteosarcoma ROS [39]. The EGFR and its ligand EGF were found by immunohistochemical assay in 81 and 51% of osteosarcomas respectively, though the EGFR and EGF expressions demonstrated no correlation [40]. It was discovered that the EGFR stimulation of osteoblasts may be effected both in the autocrine (by osteoblast-produced EGF) and paracrine (by EGF produced by surrounding cells, i. e. bone marrow eosinophils) manner [16]. Three-dimension visual study discovered that cells of osteosarcoma UMR 106-01 demonstrated different sensitivity to hormones and growth factors in subconfluent monolayer culture at individual differentiation stages [18].
The EGF-induced osteoblast proliferation is due to alteration of plasmic cell membrane potential leading to extracellular calcium ion transport [37]. The EGF-induced DNA synthesis is in part inhibited by calcium channel blockers.
The EGF induces synthesis of mRNA and zinc finger Egr-1 transcription factor protein via activation of protein kinase C and other signal routes, while the Egr-1 is likely to be a part of the EGF-dependent regulatory system transmitting the EGF effect on osteoblast growth and differentiation. The EGF-osteoblast interaction results in activation of intranuclear signal systems in its turn leading to enhancement of the proliferative activity and differentiation. Mechanism of this enhancement is unclear and may involve abrupt induction of early genes such as EGR-1 [23]. The EGF is known to induce rapid activation of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases in human osteogenic sarcoma G292 cells, as well as in primary cultures of animal osteoblasts. This phosphorylation is reversible and time-dependent. The EGF enhances DNA synthesis and c-myc protooncogene expression in human osteogenic sarcoma G292 cell culture [42].
At the same time the EGF interaction with its receptor also leads to activation of c-fos oncogene in MC3T3-E1 osteoblast culture in serum-free low calcium medium as compared to control. The mRNA c-fos expression was also much higher in low calcium medium than in control. It is most likely that the cells tried to restore their genome functioning reduced due to low calcium concentration in the medium [39].
The EGF influences collagenase synthesis as demonstrated on human osteosarcoma MG-63 and U2-OS osteoblast culture. It is important that the EGF has no effect on collagenase mRNA expression but rather enhances transcription of genes c-fos and c-jun whose products interact directly with human collagenase promoter segments [45]. The c-fos and c-jun expression on osteoblasts under the EGF action was also demonstrated in human osteosarcoma MG-63 and U2-OS osteoblast culture: the EGF stimulated transcription of
остеогенной саркомы человека 0292 вызывает повышение синтеза ДНК, а также экспрессии протоонкогена с-туе [42].
Вместе с тем взаимодействие ЭФР со своим рецептором приводит к активации также онкогена с-1'о8 в культуре остеобластов МСЗТЗ-Е1 в свободной от сыворотки среде с низким содержанием кальция. Экспрессия с-К^ мРНК была значительно выше в среде с низким содержанием кальция по сравнению с контролем. По всей вероятности, таким образом клетки пытаются восстановить свое функционирование, сниженное из-за низкой концентрации кальция в среде, на геномном уровне [39].
ЭФР влияет на синтез коллагеназы, что было продемонстрировано на клетках культур остеобластов остеогенной саркомы человека МО-63 и и2-08. При этом следует отметить, что ЭФР не влияет на экспрессию мРНК коллагеназы, но стимулирует транскрипцию генов с-Гов и с^'ип, продукты которых непосредственно взаимодействуют с промоторным участком гена коллагеназы у человека [45]. Экспрессия протоонкогенов с-^эб и с-дт в остеобластах под воздействием ЭФР была также продемонстрирована в клетках культур остеобластов остеогенной саркомы человека МО-63 и 112-ОБ: ЭФР стимулировал транскрипцию генов с-Го5 и с-]ип, продукты которых непосредственно взаимодействуют с промоторным участком гена коллагеназы у человека [45].
ЭФР влияет на дифференцировку остеобластов: он подавлял активность щелочной фосфатазы — важного индикатора дифференцировки (в культуре остеобластов линии СРК-1) [11].
Обнаружено, что ЭФР на разных этапах пролиферации и дифференцировки повышал синтез остеобластами активатора плазминогена в обогащенной культуре клеток черепа новорожденных экспериментальных животных, а также активатора — ингибитора активатора плазминогена, но в меньшей степени, чем ИЛ-1 и [3-ТФР [15, 33].
Вероятно, синтез метаболитов арахидоновой кислоты является одним из механизмов ретроконтроля, включающихся после активации РЭФР. В культуре клеток МОВ 3-4Р2, полученной из остеобластов черепа экспериментальных животных, ЭФР стимулировал образование арахидоновой кислоты и ее метаболитов [29]. В культуре клеток остеогенной саркомы ИМЯ 106-01 ЭФР стимулировал, в то время как ПГЕ2 подавлял митогенез и вызывал повышение концентрации внутриклеточной цАМФ, внутриклеточного кальция и увеличение интенсивности инозитолфосфатного обмена [22].
ЭФР оказывает влияние на синтез разных форм секреторного фосфопротеина (СФП-1) остеопонтина, наиболее фосфорилированные формы которого имеют мол. массу 55 и 44 кД. При этом было показано, что в клетках костной ткани, несмотря на существование нескольких форм СПФ-1, синтез их регулируется на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях в нормальных и трансформированных клетках с соответствующими изменениями мРНК [28].
Инкубация культуры клеток остеогенной саркомы иМ11106 в присутствии ЭФР, а также ПТГ и 1,25(ОН)Л),,
c-fos and c-jun whose products interact directly with human collagenase promoter segments [45].
The EGF influences osteoblast differentiation: it inhibited activity of alkaline phosphatase, an important differentiation indicator (in CFK-1 osteoblasts) [11].
The EGF was found to increase plasminogen activator synthesis by osteoblasts in enriched culture of newborn animal skull cells as well as the synthesis of plasminogen activator inhibition activator though at a less degree than IL-1 and a-TGF [15, 33].
The arachidonic acid metabolite synthesis seems to be a mechanism of retrocontrol triggered after EGFR activation. The EGF enhanced synthesis of arachidonic acid and its metabolites in MOB 3-4F2 cell culture from animal skull osteoblasts [29]. In cell culture of UMR 106-01 the EGF stimulated while the PGE2 inhibited mitogenesis and increased concentration of extracellular cAMP, intracellular calcium and inositolphos-phate exchange [22].
The EGF influences synthesis of various forms of osteopontine secret phosphoprotein (SPP-1) whose most phosphorylated forms have a molecular weight 55 and 44 kilodalton. It was demonstrated that in spite of the existence of several SPP-1 forms their synthesis in normal and transformed bone tissue cells is regulated at transcriptional and post-transcriptional levels with corresponding changes in mRNA [28].
Incubation of cell culture of osteosarcoma UMR 106 in the presence of EGF, PTH and l,25(OH),D3 led to increase in expression of mRNA fz-1 and fz-2 which suggested the presence in osteoblasts of Fz proteins transmitting intracellular signals needed for normal morphogenesis and differentiation [13]. PTH and calcitriol enhance EGFR expression in cell culture of osteoblastlike UMR 106-01 cells and this effect may be modulated by retinoids [26]. Investigators believe that the PTH-induced increase in the number of EGFRs is associated with protein synthesis while PTH proliferation effects on osteoblasts may be mediated via the increase in EGFR number [21].
Of interest are glucocorticoid and EGFR interactions. Incubation of periodontal ligament fibroblasts able to generate bone matrix with dexamethazone enhance synthesis of AP (an early mineralization marker) in parallel with inhibition of this synthesis by EGF. Two-day incubation of the periodontal ligament fibroblasts with dexamethazone that accelerated cell differentiation resulted in decrease in expression of EGFR-mRNA, synthesis of EGFR protein and EGFR number [38].
Thus, osteosarcoma cells can produce polypeptides and proteins referred to as growth factors which by interacting with specific receptors on membranes of the producent cell, neighbor tumor cells or surrounding stromal cells (in the body) induce their proliferation. However, the reverse process may take place: growth factors produced by stromal cells may stimulate tumor cell proliferation. Thus, the mechanism of autocrine and paracrine tumor growth regulation is engaged which unlike
приводила к повышению экспрессии &-1 и Г/-2 мРНК, что предполагает необходимость наличия в остеобластах Иг-протеинов для передачи внутриклеточных сигналов, необходимых для нормального морфогенеза и дифференцировки [13]. ПТГ и кальцитриол вызывают увеличение экспрессии РЭФР в культуре остеобластоподобных клеток иМК 106-01, и этот эффект может быть модулирован ретиноидами [26]. Исследователи полагают, что индуцированное ПТГ увеличение числа РЭФР сопряжено с белковым синтезом, а пролиферативные эффекты ПТГ на остеобласты могут быть опосредованы через увеличение количества РЭФР [21].
Интересными являются исследования взаимодействия между глюкокортикоидами и РЭФР. Инкубация культуры фибробластов перидонтальных связок — фиброб-ластов, способных к формированию костного матрикса, — с дексаметазоном вызывала увеличение синтеза ЩФ (раннего маркера процесса минерализации), в то время как ЭФР его подавлял. Двухдневная инкубация культуры фибробластов перидонтальных связок с дексаметазоном, который ускорял дифференцировку клеток, приводила к снижению экспрессии РЭФР-мРНК, синтеза РЭФР-белка, а также числа РЭФР [38].
Таким образом, клетки сарком костей способны продуцировать полипептиды и белки, названные факторами роста, которые, взаимодействуя со специфическими рецепторами на мембранах клеток продуцентов, соседних опухолевых клеток или окружающих их в условиях организма стромальных клеток, индуцируют их пролиферацию. Однако возможен также и обратный процесс: факторы роста, продуцируемые клетками стро-мы, могут стимулировать пролиферативную активность клеток опухоли. Таким образом функционирует механизм аутокринной и паракринной регуляции опухолевого роста, который в отличие от центрального эндокринного механизма может, в принципе, обеспечить быстрое и относительно независимое от остального организма развитие опухолевого процесса. Однако в реальных условиях действие полипептидных факторов роста в механизмах регуляции пролиферации остеобластов в ответ на ЭФР до конца не известен, но осуществляется в сложном взаимодействии между собой и с эндокринными факторами, в частности со стероидными гормонами и некоторыми другими биологическими регуляторами [3, 5, 7].
Следовательно, вмешательство в процессы образования и секреции ростовых факторов и в особенности в процессы восприятия и передачи их ростстимулиру-ющего сигнала может оказаться перспективным новым подходом к терапии опухолей разных локализаций, в том числе и сарком костей.
В ранее представленных нами обзорах [1, 32] были описаны несколько возможных, к тому времени известных, вариантов воздействия на РЭФР и/или связанные с ними регулируемые ими клеточные процессы при разработке новых схем противоопухолевой терапии: 1) целенаправленный учет способности некоторых известных противоопухолевых и гормональных препаратов влиять на продукцию факторов роста, количество и свойства их рецепторов; 2) использование не-
the central endocrine mechanism can provide rapid tumor development relatively independent from the body. However, the action of polypeptide growth factors in osteoblast proliferation regulation in response to EGF effect is yet unclear though it proceeds in intricate interaction between themselves and with endocrine factors, in particular with steroid hormones and some other biologic regulators [3, 5, 7].
Therefore, the interference in generation and release of growth factors and especially in reception and transmission of their growth-stimulating signals may be a promising novel approach to therapy of tumors in various sites including bone sarcoma.
Our previous publications described several variants of the influence on EGFR and/or cell processes associated with and regulated by the EGFR to be employed in development of new anti tumor therapy schedules: 1) purposeful study of the ability of some conventional antitumor and hormonal agents to influence the growth factor production, number and properties of their receptors; 2) utilization of non-specific and/or specific blockers of growth factor-receptor interaction; 3) use of agents influencing EGFR functioning first of all its tyrosine kinase activity; 4) use of hybrid proteins containing conjugates of growth factors and bacterial toxins or other cytotoxic factors; 5) generation of antisense RNA blocking synthesis of growth factors or their receptors at the translation level. However, this molecular biological approach is in the stage of purely experimental study and will not be described in detail. The table summarizes major agents able to influence EGF-depend-ent processes in tumor cells discovered so far (the table from review [5]).
The conventional drugs influencing production and release of EGF and a-TGF include triphenyl ethylene antiestrogen tamoxifen and octreatid or sandostatin (SMS 201-995), a metabolic stable analog of somatostatin. It was demonstrated in a study in breast cancer cell culture that tamoxifen antiproliferative action is accompanied by inhibition of a-TGF release and synthesis induction of its antagonist (3-TGF having antiproliferative effect on breast cancer cells. This tamoxifen ability was recently confirmed by clinical study. Results of experimental study of inhibition by tamoxifen of the EGF or a-TGF-induced breast cancer cell proliferation are equivocal. Somatostatin analogs demonstrating marked antiproliferative activity in gastrointestinal tumors and inhibiting breast and prostate cancer cell proliferation in vitro and in animals reduce serum EGF and IGF-I concentration which may be an important mechanism of their antitumor action.
Inhibition of ligand-receptor interaction (which is well studied and rather efficient in steroid hormone therapy) seems to be a most promising approach to inhibition of EGF/a-TGF-associated tumor cell proliferation. Suramin, a naphthylurea polysulfonate, was the first agent studied as an antagonist of growth factor-
специфических и/или специфических блокаторов взаимодействия факторов роста с рецепторами; 3) применение препаратов, влияющих на функциональную активность РЭФР, в первую очередь ингибиторов его тирозинкиназной активности; 4) использование гибридных белков, содержащих конъюгаты факторов роста и бактериальных токсинов или других цитотоксических агентов; 5) создание антисмысловых РНК, блокирующих синтез факторов роста и/или их рецепторов на уровне трансляции. Однако такой молекулярно-биоло-гический подход находится в настоящее время в стадии чисто экспериментальной разработки и подробно рассматриваться не будет. В таблице представлены основные известные к настоящему времени препараты, влияющие по вышеперечисленным направлениям на ЭФР-зависимые процессы в опухолевых клетках (таблица из обзора [5]).
К числу известных и используемых в клинике препаратов, влияющих на продукцию и секрецию ЭФР и а-ТФР, следует в первую очередь отнести трифенил-этиленовый антиэстроген тамоксифен и октреатид или сандостатин (SMS 201-995) — метаболический стабильный аналог соматостатина. В исследованиях на культурах клеток рака молочной железы установлено, что антипролиферативное действие тамоксифена сопровождается торможением секреции а-ТФР и индукцией синтеза его антагониста — [3-ТФР, оказывающего антипролиферативное действие на клетки рака молочной железы. В недавней работе это свойство тамоксифена подтверждено на клиническом материале. Результаты экспериментального исследования возможности подавления тамоксифеном ЭФР или а-ТФР индуцированной пролиферации клеток рака молочной железы неоднозначны. Аналоги соматостатина, проявляющие выраженную противоопухолевую активность по отношению к опухолям желудочно-кишечного тракта и оказывающие тормозящее действие на пролиферацию клеток рака молочной железы и рака предстательной железы в опытах in vitro и на животных, снижают концентрацию ЭФР и ИФР I сыворотки крови, что может оказаться одним из важных механизмов их противоопухолевого действия.
Подавление взаимодействия лигандов с рецепторами, хорошо изученное и оказавшееся весьма эффективным при использовании антагонистов стероидных гормонов, является, по-видимому, одним из наиболее перспективных подходов к торможению ЭФР/а-ТФР-зависимой пролиферации опухолевых клеток. Первым препаратом, исследованным в качестве антагониста связывания факторов роста с рецепторами, был сурамин — полиани-онное соединение, представляющее собой полисульфонат нафтилмочевины. В опытах in vitro сурамин в концентрациях 20—2500 мкг/мл ингибировал пролиферацию клеток различных опухолей человека, включая рак молочной железы, рак предстательной железы, опухоли головы и шеи, яичников, легкого, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, остеогенную саркому, меланому и глиобластому. Не выявлено четкой связи между наличием РЭФР и распределением IS5„ и концентрацией сурамина, вызывающей 50% торможения
receptor binding. Suramin at concentrations 20 to 2500 mcg/ml inhibited in vitro proliferation of various human tumors including breast, prostate, head-and-neck, ovary, lung, bladder, colon cancer, osteosarcoma, melanoma and glioblastoma. There was no clear correlation of EGFR and distribution of IC50, suramin concentration inducing 50% cell growth inhibition. Though there was a weak correlation between receptor-positive cell EGFR content and IC5„. Suramin inhibition activity is suppressed after adding IGF I or alkaline fibroblast growth factor or estradiol to culture medium. Suramin, a specific inhibitor of EGF-EGFR binding, was shown to exert marked antiproliferative action on cell culture of human osteosarcoma SaOS-2 [19].
Interim clinical results demonstrated suramin to produce definitive antitumor effect on metastasizing adrenal, prostatic tumors, some lymphomas. Experimental and preclinical study proved serum suramin concentration to reach ±280 mcg/ml after administration at a load dose 350 mg/m2 daily for 10 days (schedule of clinical application) which makes possible the use of suramin as a supplement to therapy of cancers of various sites whose growth is regulated by peptide growth factors. Although the suramin antitumor activity can hardly be directly related to its effect on EGFR because of a large variety of its extracellular effects and non-specificity of membrane receptor binding.
Some polysulfated hydrocarbons such as laminarin and carragenin sulfates, as well as dextrane sulfates of various molecular weights were recently proposed as non-specific growth factor receptor blockers.
The use of monoclonal antibodies (Mab) to receptors seems to be the most promising approach to EGFR-ligand interaction block. Intense study of this problem is in process in Memorial Sloan-Kattering Cancer Center (USA). The investigators generated several Mabs to EGFR and demonstrated their ability to block EGF and a-TGF binding to receptors and to inhibit ligand-dependent stimulation of EGFR tyrosine kinase activity. There is experimental evidence of the ability of Mab to EGFR to enhance antitumor effect of conventional chemotherapy combinations, in particular cis-diaminedi-chloroplatinum and doxorubicin, in treatment for squamous cell carcinoma A-131 and breast adenocarcinoma MDA-468 transplanted to athymic mice.
The encouraging laboratory findings concerning antitumor activity of Mabs to EGFR made a basis for clinical trial of these agents in patients with tumors expressing EGFR in big amount.
Thus, the experimental and clinical study of anti-EGFR demonstrated their ability both to inhibit li-gand-receptor binding and to suppress receptor autophosphorylation. In this respect the anti-EGFR Mab may to a certain degree be classified as an agent influencing EGFR functional activity.
An isofiavone derivative, genistein, was the first relatively specific inhibitor of EGFR tyrosine kinase described in literature. Genistein inhibits EGFR autophos-
Таблица Препараты, влияющие на ЭФР-зависимые процессы в опухолевых клетках Agents influencing EGF-dependent processes in tumor cells Table
Принцип действия Препарат Стадия изучения
Влияние на синтез и секрецию фактора роста Effect on growth factor synthesis and secretion Неспецифическое подавление факторов роста с рецепторами Non-specific inhibition of growth factors with receptors Специфическое подавление взаимодействия лигандов с РЭФР Specific inhibition of ligand-EGFR interaction Влияние на функциональную активность РЭФР Effect on EGFR functional activity Направленный перенос цитотоксических агентов Target-specific transport of cytotoxic agents Тамоксифен / Tamoxifen Аналоги соматостатина / Somatostatin analogs Антисмысловые РНК/Antisense RNA Сурамин / Suramin Каррагенины / Carragenins Сульфаты ламинарина, сульфаты декстрана Laminarin sulfates, Dextrane sulfates Моноклональные антитела к РЭФР: lgG2a-528, IgG 1-225, lgG2a-425, ch225, m225, EMD 55900, RG83852 Monoclonal antibodies to EGFR: lgG2a-528, lgG1-225, lgG2a-425, ch225, m225, EMD 55900, RG3852 Ингибиторы тирозинкиназы: генистеин, тирфостины. Активаторы тирозинфос- фатазы: О-фосфотирозин Tyrosine kinase inhibitors: genistein tyrfostins. Tyrosine phosphatase activators: O-phospho- tyrosine Рекомбинантные белки: а-ТФР-экзотоксин APresudomonas: TP40, PE35/TGF-aKDEL, Cys-PE40; ЭФР-дифтерийный токсин: DAB389EGF Recombinant proteins: а-TGF-exotoxin A Pseudomonas: TP40, PE35/TGF-a-KDEL, Cys-PE40; EGF-diphtheria toxin: DAB389EGF Исследование in vitro / In vitro study Клиническое использование без учета фактора роста Clinical use without evaluation of growth factor effect Экспериментальная разработка Experimental development Детально изучен механизм in vitro In vitro mechanism is studied in detail I фаза клинических испытаний Phase I clinical study Экспериментальные исследования in vitro и in vivo; предклинические испытания, I фаза клинических испытаний Experimental in vitro and in vivo study Preclinical study, phase I clinical study Исследование на культурах клеток, опухолях, перевитых бестимусным мышам Study of cell culture, tumors transplanted to athymic mice Исследование на колониеобразующую и пролиферативную способность культур клеток, рост опухолей у бестимусных мышей; предклинические испытания Study for colony stimulating and proliferative activity of cell culture, tumor growth in athymic mice. Preclinical study
Mechanism of action Agent Stage of study
роста клеток. В то же время обнаружена слабая положительная корреляция между количеством РЭФР в рецепторположительных клетках И величиной Вя,. Ингибирующий эффект сурамина подавляется при добавлении в среду ИФР I или щелочного фактора роста фибробластов, а также эстрадиола. Показано, что су-рамин, специфический ингибитор взаимодействия ЭФР с РЭФР, оказывал значительное антипролиферативное влияние на клетки культуры остеогенной саркомы человека 8аОБ-2 [19].
В предварительных клинических исследованиях продемонстрирована определенная противоопухолевая активность сурамина при метастазирующих опухолях надпочечников, предстательной железы, некоторых лимфомах. Результаты экспериментальных исследований и предклинических испытаний сурамина свидетельствуют о том, что в достаточно высоких дозах, которые используются в клинике, при нагрузочных дозах 350 мг/м2 в день через 10 дней лечения в крови достигается концентрация препарата 280 мкг/мл, он может оказаться эффективным дополнительным средством терапии больных с опухолями различных локализаций, рост которых стимулируется пептидными ростовыми факторами. Однако однозначно связывать противоопухо-
phorylation in a dose-dependent manner with cell arrest in G2M phase. At concentrations 1 to 25 mcM genistein inhibits growth of cell culture of human gastric cancer AGS stimulated with 10 nM EGF, while at a concentration more than 6 mcM genistein suppresses growth of the same cells stimulated with embryo serum.
The purposeful research of EGFR-specific tyrosine kinase inhibitors resulted in development of a group of drugs referred to as tyrfostins. Most of them are malononitryl derivatives. Some tyrfostins are demonstrated to inhibit cell proliferation of breast cancer, gastric cancer in vitro, as well as growth of squamous cell carcinoma transplanted to athymic mice.
Effect similar to that of thyrosine kinase inhibitors may be achieved by activation of cell tyrosine phosphatases dephosphorylizing EGFR and EGFR-phos-phorylated proteins. This effect is also shown to be involved in actions of somatostatin and its analogs. There are low molecular agents with similar properties, e. g. O-phosphotyrosine.
There were no clinical trials of the above-mentioned drugs yet, nevertheless some authors believe them to be promising antitumor agents with an absolutely new
левую активность сурамина с его действием на РЭФР нельзя из-за мног ообразия его внеклеточных эффектов и неспецифичности блокирования мембранных рецепторов.
В последнее время в качестве неспецифических бло-каторов рецепторов факторов роста предложено использовать также некоторые полисульфатированные углеводороды, такие, как сульфаты ламинарина и каррагенины, а также сульфаты декстрана, различной молекулярной массы.
Более перспективным подходом к блокированию взаимодействия РЭФР с лигандами является использование моноклональных антител (МАТ) к рецепторам. Наиболее активно этот вопрос разрабатывается в Memorial Sloan-Kattering Cancer Center (США), где получена целая серия МАТ к РЭФР и продемонстрирована их способность блокировать связывание ЭФР и а-ТФР с рецепторами и тормозить лигандзависимую стимуляцию тирозинкиназной активности РЭФР. В экспериментальных исследованиях доказана способность МАТ к РЭФР усиливать противоопухолевый эффект известных комбинаций химиопрепаратов, в частности цис-диаминодихлорплатины и доксорубицина, при лечении плоско клеточной карциномы А-131 и аденокарциномы молочной железы МДА-468, трансплантированных бес-тимусным мышам.
Обнадеживающие результаты лабораторных исследований противоопухолевого эффекта МАТ к РЭФР подготовили базу для клинических испытаний этих препаратов у больных с опухолями, экспрессирующими высокие уровни РЭФР.
Таким образом, экспериментальные исследования и клинические испытания анти-РЭФР показали не только торможение ими связывания лигандов с рецептором, но и подавление аутофосфорилирования рецептора. В этом отношении МАТ к РЭФР можно отнести в какой-то степени и к препаратам, влияющим на функциональную активность РЭФР.
Одним из первых описанных в литературе относительно специфических ингибиторов тирозинкиназы РЭФР является производное изофлавона генистеин. Генистеин дозозависимо ингибирует аутофосфорили-рование РЭФР, при этом происходит арест клеток в С2-М-фазе митотического цикла. В интервале концентраций 1—25 мкМ генистеин тормозит рост культивируемых клеток рака желудка человека линии AGS, стимулированный 10 нМ ЭФР, а при концентрации более 6 мкМ — также рост этих клеток, стимулированный эмбриональной сывороткой.
Целенаправленная разработка РЭФР-специфических ингибиторов тирозинкиназы привела к созданию группы препаратов, получивших наименование «тирфости-нов». Большинство из них относится к производным малононитрила. Продемонстрировано ингибирующее действие некоторых тирфостинов на пролиферацию клеток рака молочной железы, рака желудка in vitro, а также на рост трансплантированной бестимусным мышам плоскоклеточной карциномы.
Эффект, аналогичный действию ингибиторов тирозинкиназы, может быть достигнут в результате активации клеточных тирозинфосфатаз, дефосфорилирую-
mechanism of action based on interference in intracellular mitogen signal transmission.
The literature described some recombinant proteins containing growth factors and bacterial toxins. V.Chaud-hary et al. [14] synthesized by genetic engineering a hybrid molecule consisting of a-TGF and exotoxin A of Pseudomonas. The exotoxin A inhibits protein synthesis by ADP-ribozylation of an elongation factor. The recombinant molecule called TP40 includes an exotoxin fragment free from the segment interacting with its own receptor. The TP40 may produce cytotoxic effect only on binding with EGFR. The TP40 antitumor activity was studied mainly in vitro on cell cultures of breast, endometrium, ovary, colon, non-small cell lung, suqamous-cell neck-and-head, pancreas, stomach, thyroid cancers, sarcoma, glioblastoma. Cells expressing big amount of EGFR were shown to be most sensitive to the recombinant protein. There are reports of the start of TP40 clinical study in which the agent is administered intravesically to patients with bladder cancer. Unlike TP40 the recently synthesized recombinant protein of exotoxin A and a-TGF with modified structure (PE35/TGF a-KDEL) can produce antitumor effect without previous proteolysis and formation of the C-terminal fragment. This protein demonstrated a 10-7-fold greater activity than TP40 in cell culture of human bladder cancer.
Another recombinant protein DAB389EGF is an expression product of a hybrid gene in which the binding domain of diphtheria toxin is replaced by EGF. Like TP40, DAB389EGF inhibits protein synthesis in human tumor cell culture and colony growth in soft agar and microcapsules. The agent is active against bladder, breast, ovary, and non-small cell lung cancers. The supposition may be made that recombinant proteins including a-TGF and EGF will appear efficient target-specific cytotoxic agents in adjuvant therapy for EGFR-positive tumors.
Thus, there is a considerable variety of agents interfering EGF- and a-TGF-mediated mitogen signal transmission under preliminary trial.
To apply effectively these drugs in the clinical practice one has to determine patient’s individual sensitivity, with tumor EGFR detection being a reasonable approach. Preliminary knowledge of sites and types of tumors potentially responsive to such treatment may also be acquired on this basis.
On summarizing interim results of the clinical and experimental studies described above the following supposition may be made. The presence of EGFR in a considerable portion of bone tumors of different sites and histology suggests that the EGF- (or a-TGF -) dependent signal transmission plays a significant role in regulation of their growth. Therefore certain success may be achieved by incorporating agents influencing EGF-dependent processes in neoadjuvant and adjuvant therapy schedules. There are a considerable number of theoretical and experimental findings to be a basis for development and trial of new antitumor therapy sched-
щих РЭФР и фосфорилированные им белки. Установлено, что такой эффект является одной из сторон действия соматостатина и его аналогов. Существуют также низкомолекулярные препараты, обладающие подобными свойствами, например О-фосфотирозин.
Клинических испытаний вышеописанных препаратов до настоящего времени не проводилось, однако многие авторы полагают, что они могут оказаться перспективными противоопухолевыми средствами с принципиально новым механизмом действия, основанным на вмешательстве во внутриклеточные процессы передачи митогенного сигнала.
В литературе описано несколько рекомбинантных белков, содержащих факторы роста и бактериальные токсины. Так, V. К. Chaudhary и соавт. [14] впервые синтезировали с помощью генной инженерии гибридную молекулу, состоящую из а-ТФР и экзотоксина А из Pseudomonas. Экзотоксин А ингибирует синтез белка посредством АДФ-рибозилирования одного из факторов элонгации. В рекомбинантную молекулу, получившую название ТР40, входит фрагмент экзотоксина, не содержащий участок, взаимодействующий с его собственным рецептором. Показано, что для цитотокси-ческого эффекта ТР40 необходимо его взаимодействие с РЭФР. Противоопухолевая активность ТР40 исследована преимущественно в системах in vitro на культурах клеток рака молочной железы, эндометрия, яичников, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого, плоскоклеточных опухолей головы и шеи, рака поджелудочной железы, желудка, щитовидной железы, саркомы, глиобластомы. Показано, что наиболее чувствительными к рекомбинантному белку являются клетки, экспрессирующие большое количество РЭФР. Имеются сообщения о начале клинических испытаний ТР40 при внутрипузырном введении больным раком мочевого пузыря.
Недавно сконструирован рекомбинантный белок экзотоксина А и а-ТФР с модифицированной структурой (PE35/TGF a-KDEL), который в отличие от ТР40 может проявлять противоопухолевую активность без предварительного протеолиза с образованием активного С-кон-цевого фрагмента. На линиях клеток рака мочевого пузыря человека этот белок в 10—700 раз более активен, чем ТР40.
Еще один рекомбинантный белок DAB389EGF представляет собой продукт экспрессии гибридного гена, в котором связывающий домен дифтерийного токсина замещен на ЭФР. Так же как ТР40, DAB389EGF тормозит синтез белка в культивируемых клетках опухолей человека и рост колоний в мягком агаре и микрокапсулах. Препарат был активен по отношению к раку мочевого пузыря, раку молочной железы, яичников и немелкоклеточному раку легкого. В целом можно предполагать, что рекомбинантные белки, включающие a-ТФР и ЭФР, окажутся эффективными цито-токсическими препаратами направленного действия для адъювантной терапии больных опухолями, содержащими РЭФР.
Таким образом, в настоящее время уже существует и проходит предварительное изучение целый арсенал
ules that include, besides classical drugs acting directly on DNA synthesis and replication, blockers of regulatory factor mitogen signal transmission at various stages, in particular blockers of EGF-dependent processes.
As demonstrated experimentally EGF and -TGF play an important part in cell regulation in breast, prostate cancer, osteosarcoma, non-small cell lung cancer. In hormone-dependent tumors the growth factor effects are produced in complicated interaction with steroid hormones, while EGFR hyperexpression may lead to hormone resistance even in steroid receptor positive tumors [5].
The Laboratory of Biochemistry, CRC RAMS, has conducted a study of plasma EGF and IGF I expression in patients with primary bone tumors since 1982 [2]. The first findings concerning EGFR and its ligand (EGF) in bone tumors were presented at the CRC in 1995 (O. I. Kostyleva, A. A. Radchenko, E. S. Gershtein, N. E. Kushlinsky). This study is continued using the standard redioligand methodology recommended by the Receptor and Merker Study group, European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) [9].
EGFR measurement was performed in 114 patients with malignant and benign bone tumors, tumor-like skeletal lesions of age ranging from 15 to 69 years.
It was found that more than half malignant bone tumors express EGFR: osteosarcoma (63%), chondrosarcoma (54%), Ewing tumor (57%), malignant fibrous histiocytoma (63%). EGFR was also frequently detected in giant-cell tumors (57%), while the rate of EGFR among the tumor-like lesions was lower (38%). O.I.Kostyleva et al. (1995) and A.A.Radchenko et al. (1996) who conduct the research at CRC believe that EGFR expression and consequently tumor response to EGF are a rather common characteristic of cell malignant transformation. The researchers failed to find any significant difference in EGFR contents between osteosarcoma, chondrosarcoma, Ewing tumor, malignant fibrous histiocytoma and tumor-like bone lesions. EGFR expression was significantly lower in giant-cell tumors and was not typically found in normal tissues. Until now parameters of EGF-receptor bindings were mainly studied in osteosarcoma cell cultures in which high-affinity EGFR were found [46], in rabbit differentiated chondrocytes with two types of sites of specific EGF-receptor binding, i.e. high-affinity and low-affinity sites [30]. O. I. Kostyleva et al. (1995) studied membrane fraction EGF binding parameters of osteo- and chondrosarcoma by Scatchard’s methodology to discover one type of EGF binding site in osteosarcoma (Kd = 1.04 nM) and in chondrosarcoma (Kd = 2.15 nM). According to the EGFR classification proposed by J.Schlessinger [43] and A. Kinoshita [30] these binding parameters characterize the EGFR in control and in tumors as low-affinity receptors.
Joint study performed by the Carcinogenesis Institute [31] and the Laboratory of Clinical Biochemistry [25] of CRC discovered the initiation of cell division under the effect of polypeptide growth factors, in particular
препаратов, воздействующих на процессы передачи ми-то генного сигнала с участием ЭФР и а-ТФР.
Для эффективного клинического применения подобных препаратов необходимо определение индивидуальной чувствительности больных, одним из наиболее очевидных подходов к которому может служить определение содержания РЭФР в опухолях. На этом же основании можно составить предварительное представление о локализации и типах опухолей, потенциально чувствительных к такому лечению.
Подводя предварительные итоги представленного клинического и экспериментального материала, можно высказать следующее предположение: обнаружение
РЭФР в значительной части опухолей костей разной локализации и гистологического строения свидетельствует о том, что ЭФР (или а-ТФР)-зависимый путь передачи митогенного сигнала играет существенную роль в регуляции их роста, поэтому при широком спектре опухолей можно ожидать определенного успеха от включения в схемы неоадъювантной и адъювантной терапии препаратов, влияющих на ЭФР-зависимые процессы. В целом можно заключить, что в настоящее время имеется значительная теоретическая и экспериментальная база для разработки и испытания новых схем противоопухолевой терапии, включающих наряду с классическими препаратами, действующими непосредственно на процессы синтеза и репликации ДНК, также и блокаторы различных стадий передачи митогенных сигналов регуляторных факторов, в частности блока-торов ЭФР-зависимых процессов.
В экспериментальных исследованиях показано, что ЭФР и а-ТФР играют важную роль в регуляции клеток рака молочной железы, рака предстательной железы, остеогенной саркомы, немелкоклеточного рака легкого. В гормонозависимых опухолях эффекты факторов роста осуществляются в сложном взаимодействии со стероидными гормонами, а гиперэкспрессия РЭФР может приводить к возникновению гормонорезистентности даже у опухолей, содержащих рецепторы стероидов [5].
Исследования экспрессии ЭФР и ИФРI типа в плазме крови больных первичными опухолями костей проводятся в лаборатории клинической биохимии нашего центра с 1982 г. [2]. Первые данные по исследованию РЭФР и его лиганда (ЭФР) в опухолях костей были представлены в ОНЦ в 1995 г. (О. И. Костылева, А. А. Радченко, Е. С. Герштейн, Н. Е. Кушлинский) и проводятся по настоящее время стандартизованным радиолигандным методом, рекомендованным группой исследования рецепторов и маркеров Европейской организации по исследованию и лечению рака (ЕСЖТС) [9].
РЭФР определяли в опухоли у 114 больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями кости, с опухолеподобными поражениями скелета в возрасте от 15 до 69 лет.
В результате проведенных исследований было обнаружено, что более половины злокачественных сарком костей экспрессируют РЭФР: остеогенная саркома (63%), хондросаркома (54%), опухоль Юинга (57%), злокачественная фиброзная гистиоцитома (63%). Также часто РЭФР выявлялись в гигантоклеточной опухоли
EGF to proceed in parallel with rapid activation of phospholipid turnover. Induction degree of the phospholipid turnover in short-term tumor cell cultures under the EGF effect was taken as a criterion for EGFR functional activity. Several interesting conclusions were made as a result of the study. None of EGFR-negative tumor specimens showed phospholipid turnover stimulation under their effect of EGF which confirmed radioligand study findings on EGFR content in these bone sarcomas. Cell treatment with lO-8 M EGF for 10 min stimulated in a statistically significant manner 32P uptake in phospholipids in one of three EGFR+ specimens. We managed to study genistein (a non-specific tyrosine kinase inhibitor) effect in the presence of EGF in one of the EGFR+ specimens. The EGF alone failed to activate phospholipid turnover. EGF in combination with genistein also failed to change the 32P uptake in phospholipids. The investigators believe the absence of response to exogenous EGF and genistein in this tumor sample to be related at least to three situations: 1) the EGFR were chronically activated by the ligand; 2) the EGFR discovered were not functionally inactive by some reason; 3) EGF mitogenic signal from the receptor to the phospholipid turnover is interrupted at the next stage (phospholipase C).
These findings suggest that EGFR presence on tumor cell membranes though being a limiting factor of their sensitivity to EGF is not always enough to receive the EGF mitogenic signal.
Investigators from the Biochemistry Laboratory of CRC found the following. Comparison of expressions of EGFR and sex steroid hormone receptors demonstrated that phenotypes EGFR+ER and EGFR+AR that mainly reflected autocrine regulation mechanism were most characteristic of osteogenic sarcoma, giant-cell tumor and Ewing’s tumor. The combination of the sex hormone receptor presence with no EGFR was more typical for tumorlike bone lesions.
There were clear tendencies to increase in EGFR expression frequency with rise in malignancy grade of osteogenic and chondrosarcoma. Analysis of overall survival of patients with osteogenic sarcoma discovered that the patients with EGF-like peptides and glucocorticoid receptors (especially if the concentration of the latter was not more than 50 fmol per mg protein) had a significantly better survival.
As concerns disease-free survival, the osteosarcoma patients with negative glucocorticoid receptor status or EGFR concentration 10 to 150 fmol per mg protein had the most poor prognosis.
Analysis of the disease-free survival with respect to tumor histology demonstrated the osteosarcoma patients with small-cell tumors had the poorest rate as compared to osteoblastic and anaplastic tumors. This corresponded to less frequent detection of GR and EGF-like peptides.
The discovery of EGFR, its ligands, Grm AR, ER in osteogenic sarcomas as well as evaluation of their
(57%), в то время как при опухолеподобных поражениях костей РЭФР встречались значительно реже (38%). Авторы этих исследований сотрудники лаборатории клинической биохимии нашего центра О. И. Костылева и соавт. (1995), А. А. Радченко и соавт. (1996) полагают, что экспрессия РЭФР, а следовательно, потенциальная чувствительность к ЭФР являются достаточно общей характеристикой злокачественной трансформации клеток. Исследователи не выявили достоверных отличий в уровнях РЭФР между остеогенной саркомой, хонд-росаркомой, опухолью Юинга, злокачественной фиброзной гистиоцитомой и опухолеподобными поражениями костей. Достоверно низкие показатели экспрессии РЭФР были обнаружены в гигантоклеточных опухолях. Для нормальной костной ткани экспрессия РЭФР не характерна. До настоящего времени параметры связывания ЭФР с рецепторами были исследованы в основном в культурах клеток остеогенной саркомы, где обнаружены высокоаффинные РЭФР [46], в дифференцированных хондроцитах кроликов, где были выявлены два типа мест специфического связывания ЭФР с рецепторами — высокоаффинные и низкоаффинные [30]. По данным исследования параметров связывания ЭФР в мембранной фракции остеогенной и хондросаркомы методом Скэтчарда, сотрудники лаборатории О. И. Костылева и соавт. (1995) обнаружили один тип мест связывания ЭФР в остеогенной саркоме (К<1 = 1,04 нМ) и в хондросаркоме (Кс1 = 2,15 нМ). Если следовать классификации РЭФР, предложенной .1. БсЫезэн^ег [43] и А. КтовЬка и соавт. [30], то обнаруженные авторами параметры связывания характеризуют РЭФР в контрольной системе и опухолях костей как низкоаффинные рецепторы.
Совместными исследованиями сотрудников Института канцерогенеза нашего центра [31] и лаборатории клинической биохимии [25] обнаружено, что инициация клеточного деления под действием полипептидных факторов роста, в частности ЭФР, сопровождается быстрой активацией цикла обращения фосфолипидов. В качестве критерия функциональной активности РЭФР нами была использована степень индукции обмена фосфолипидов в краткосрочных культурах клеток, выделенных из опухолей, под действием ЭФР. Проведенные исследования позволили сделать несколько интересных выводов. Ни в одном из РЭФР-отрицательных образцов опухолей стимуляция цикла обращения фосфолипидов под воздействием ЭФР не обнаружена, что подтвердило данные радиолигандного исследования содержания РЭФР в этих саркомах костей. Обработка клеток 10~я М ЭФР в течение 10 мин приводила к достоверной стимуляции включения 32Р в фосфолипиды в одном из трех РЭФР+-образцов. В одном из РЭФР+-образцов удалось исследовать влияние генистеина (неспецифического ингибитора тирозинкиназ) в присутствии ЭФР. Один ЭФР в этом образце не активировал цикл обращения фосфолипидов. При воздействии ЭФР в сочетании с ге-нистеином также не наблюдалось достоверных изменений включения ,2Р в фосфолипиды. Исследователи полагают, что отсутствие ответа на экзогенный ЭФР и генистеин в этом образце опухоли может быть связано
clinical significance suggest that the EGFR in combination with EGF-like peptides, steroid hormone receptors are both supplementary prognostic factors and allow a new approach to treatment of patients with osteogenic sarcoma with respect to tumor phenotype and mechanism of action of the agents summarized in the table.
This study was supported by the Russian Fundamental Research Foundation; Presidium of RAS; Presidium of RAMS; editorial boards of the “Bulletin of Experimental Biology and Medicine” and “Herald of the CRC RAMS”, International Science Foundation, Endocrinology Laboratory (Prof.D.Wang, Dr.J.Moor) of the Imperial Institute for Cancer Research (London, UK); Dr.R.E.Leake (Biochemistry Department, University of Glasgow, Scotland); Professor R.King (University of Guilford, UK), scientific department of Boehringer Mannheim (Germany).
по крайней мере с тремя положениями: 1) РЭФР хронически активированы лигандом; 2) обнаруженные РЭФР являются функционально неактивными по известным нам причинам; 3) нарушено следующее звено передачи митогенного сигнала ЭФР от рецептора к циклу обращения фосфолипидов (фосфолипаза С).
Учитывая полученные результаты, можно предположить, что наличие РЭФР на мембранах опухолевых клеток, хотя и является лимитирующим фактором в отношении чувствительности их к ЭФР, однако не всегда достаточно для реализации митогенного эффекта ЭФР.
Исследования, проведенные сотрудниками лаборатории клинической биохимии нашего центра, установили следующие факты. Так, при сопоставлении экспрессии РЭФР и рецепторов половых стероидных гормонов было обнаружено, что для остеогенной саркомы, гигантоклеточной опухоли и опухоли Юинга наиболее характерными являются фенотипы РЭФР+РЭ и РЭФР+РА , отражающие преимущественно ауто-кринный характер регуляции этих новообразований. Для опухолеподобных поражений костей более характерна экспрессия рецепторов половых гормонов в отсутствие РЭФР.
Обнаружены четко выраженные тенденции к повышению частоты экспрессии РЭФР с ростом степени злокачественности остеогенной и хондросаркомы.
При анализе общей выживаемости больных с остеогенной саркомой удалось установить, что больные, в опухолях которых определялись ЭФР-подоб-ные пептиды, а также рецепторы глюкокортикоидов, особенно если концентрация последних не превышала 50 фмоль на 1 мг белка, выживали достоверно лучше.
При анализе безрецидивной выживаемости больных с остеогенной саркомой наиболее неблагоприятный прогноз был отмечен у больных, в опухолях которых отсутствовали рецепторы глюкокортикоидов или определялись РЭФР в концентрации от 10 до 150 фмоль на 1 мг белка.
При сравнении безрецидивной выживаемости
больных с остеогенной саркомой в зависимости от гистологического варианта опухоли хуже всего выживали больные с мелкоклеточным вариантом остеогенной саркомы по сравнению с теми, у кого имели место остео-бластический и анаплазированный варианты. Это сочеталось с более редким определением в опухолях мелкоклеточного варианта РГ и ЭФР-подобных пептидов.
Обнаружение РЭФР, его лигандов, РГ, РА, РЭ в опухолях больных остеогенной саркомой, а также результаты оценки их клинического значения позволяют рассматривать РЭФР в сочетании с ЭФР-подобными пептидами, рецепторами стероидных гормонов не только дополнительными прогностическими факторами, но и на основании их возможно по-новому подходить к лечению больных с остеогенной саркомой с учетом фенотипа опухолей и механизма действия вышеуказанных в таблице препаратов [5, 7].
Настоящее исследование было поддержано Российским фондом фундаментальных исследований.
ЛИТЕРАТУРА /REFERENCES
I. Герштейн Е. С., Костылева О. И., Кушлипский Н. Е. //Всстн. ОНЦ РАМН. — 1995. — № 2. — С. 51—59.
2. Кушлипский Н. Е., Бассалык Л. С., Кузьмина 3. В. и др. //Вопр. онкол. — 1991. — № 6. — С. 676—683.
3. Кушитский Н. Е., Костылева О. И. и др. //Вестник ОНЦ
РАМН. — 1996. — № 1, — С. 20—26.
4. Кушлипский Н. Е„ Kocmbvieea О. И., Радченко A. A., Гершташ Е. С.
//Бюл. зкепер. биол. — 1996.—№ 7. — С. 78—82.
5. Кушлипский Н. Е., Герштейн Е. С. //Экспср. и клин, фармакол. — 1996. — № 1,—С. 74—80.
6. Кушлипский Н. Е., Костылева О. И., Радченко А. А. и др. //Бюл. экспср. биол. — 1996.—№ 7. — С. 78—82.
7. Трапезников Н. Н., Кушлипский Н. Е., Соловьев Ю. Н„ Алиев М. Д. //Там же. — 1997. — № 9. — С. 305—310.
8. Barnard J. A., Graves D. R., Piitelkmv М. R. ct al. //.I. biol. Chcm. —
1994.— Vol. 269.— P. 22817—22822.
9. Benraacl T. J., Foekens J. A. //Ann. clin. Biochcm. — 1990. —
Vol. 27. —P. 272—273.
10. Bernier S. М., Rouleau M. F., Goltzman D. //Endocrinology. —
1991, — Vol. 128, N 6.— P. 2752—2760.
II. Bernier S. M„ Goltzman D. //J. ecll. Physiol. — 1992. — Vol. 152, N 2.— P. 317—327.
12. Burgess A. W., Thumwood С. M. //Pathology. — 1994. — Vol. 26. — P. 453—463.
13. Chan S. /)., Karpf D. B., Fowlkes М. E. ct al. //J. biol. Chcm. —
1992.— Vol. 267' N 35.— P. 25202—25207.
14. Chaudhary V. K., Fitzgerald D. J., Aclhya S., Pastan I. //Proc. natl.
Acad. Sci. USA.— 1987.—Vol. 84.—P. 4538—4542.
15. Cheng S. I.., Shen V., Peck W. A. //Calcif. Tissue Int. — 1991.— Vol. 49, N 5.— P. 321—327.
16. Chou M. Y, Chou М. C., McBride J. ct al. //Lymfokinc. Cytokine. Res. — 1991, — Vol. 10, N 5.— P. 385—390.
17. Ciccodicolo A., Dono R., Obici S. ct al. //EMBO J. — 1989.— Vol. 8. —P. 1987—1991.
18. Civitelli R., Fujimori A., Bernier S. M. ct al. //Endocrinology.— 1992.—Vol. 130, N 4.—P. 2392—2400.
19. Corrall D. A., Sicker D. C, Salup R. R. //Рос. Annu. Meet. Am. Assoc. Canccr Res. — 1994. — Vol. 35. — P. A1669.
20. Dougall W. C., Qian X., Peterson N. C. ct al. //Oncogene. — 1994. — Vol.'9, —P. 2109—2123.
21. Drake М. Т., Baldassare J. J., McConkey C. L. ct al. //Endocrinology. — 1994.— Vol. 134, N 4.— P. 1733—1737.
22. Fang M. A., Kujubu D. A., Hahn T. J. //Ibid. — 1992. — Vol. 131, N 5.—P. 2113—2119.
23. Fang M. A., Noguchi G. M., McDouglas S. //Calcif. Tissue Int. — 1995.— Vol. 56, N 6.— P. 450—455.
24. Gershtein E. S., Leake R. E., Kushlinsky N. E. ct al. //Eur. J. Canccr. — 1994. — Vol. 30A. — Suppl. 2. — P. S43.
25. Gershtein E., Kushlinsky N„ Ermilova V. ct al. //Scand. J. clin. Lab. Invest. — 1995. — Vol. 55.— Suppl. 223.—P. 406.
26. Gonzalez E. A., Martin K. J. //Calcif. Tissue Int. — 1996. — Vol. 58, N 6, —P. 429—434.
27. Hsuan J. J. //Anticanccr Res. — 1993. — Vol. 13.— P. 2521— 2532.
28. Kasugai S., Zhang Q., Overall C. M. ct al. //Bone Miner. — 1991, — Vol. 13, N 3. — P. 235—250.
29. Kawase T., Orikasa M.. Suzuki A. //Pharmacol. Toxicol. — 1991. — Vol. 69, N 5.—P. 330—337.
30. Kinoshita A., Takigawa M., Suzuki F. //Biochcm. biophys. Res. Commun. — 1992. — Vol. 183, N 1, —P. 14—20.
31. Krasil’nikov M. A., Shatskaya V. A., Kuzmina Z. V. ct al. //Acta
cndocr. — 1993. — Vol. 128. — P. 543—548.
32. Kushlinsky N. E., Gershtein E. S., Kostyleva O. /., Radchenko A. A.
//Evaluation of epidermal growth factor receptors in human tumors as a possible basis for new treatment modalities //International Congress on Anticanccr Chemotherapy, 5-th. Jan. 31—Feb. 3. — Paris, 1995.—P. 712.
33. Laschinger C. A., Bellows C. G., Wasi S. //Bone Miner. — 1991. — Vol. 13, N 1,—P. 23—34.
34. LeJeune S., Leek R., Horak E. ct al. //Canccr Res. — 1993.—
Vol. 53.— P. 3597—3602.
35. Lemmon M. A., Schlessinger J. //Trends Biochcm. Sci. — 1994. — Vol. 19.— P. 459-463.
36. Nesterov A., Kurten R. C., Gill G. N. //J. biol. Chcm. — 1995. — Vol. 270.— P. 6320—6327.
37. Loza J., Marzec N.. Simasko S., Oziak R. //Cell Calcium. — 1995.— Vol. 14, N 4.— P. 301—306.
38. Matsuda N., Kumar N. M., Ramakrishnan P. R. ct al. //Arch. Oral. Biol. — 1993. — Vol. 38, N 7. — P. 559—569.
39. Matsumoto A., Okitsu M., Deyama Y. ct al. //Biochcm. biophys. Res. Commun. — 1993.—Vol. 193, N 1, —P. 77—87.
40. Oda Y„ Wehrmann B., Radig K. ct al. //Gen. Diagn. Pathol. — 1995.— Vol. 141, N 2.— P. 97—103.
41. Opresko L. K., Chang C., Will B. H. ct al. //J. biol. Chcm. —
1995.— Vol. 27.— P. 4325—4333.
42. Ren W., Kinnihurgh A. J., Dziak R. //Calcif. Tissue Int. — 1992. — Vol. 50.— P. 372—377.
43. Schlessinger J. //Biochemistry. — 1988.—Vol. 27.—P. 3119— 3123.
44. Schlessinger J. //International Congress Hormones and Canccr, 5-th. September 16—19. — Qucbcc City, 1995.—P. 17.
45. Tamura M. //Kokubyi. Gakkai. Zassahi. — 1991. — Vol. 58, N 1. —P. 284—299.
46. Yamada K., Yoshikate Y, Norimatsu //., Nishikawa K. //Cell. Struct. Funct. — 1992.— Vol. 17, N 1. — P. 9—17.
Поступила 06.11.97 / Submitted 06.11.97
