CC BY
48
УДК 591.1.05/639.371.5
Н. Н. Федорова, В. В. Залепухин*
Астраханский государственный технический университет Волгоградский государственный университет
НЕКОТОРЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОНЦЕПЦИИ ЭНДОГЕННОЙ РАЗНОКАЧЕСТВЕННОСТИ
Концепция эндогенной разнокачественности (КЭР), в нашем понимании, - это система взглядов и выводов, отражающая воздействие генетически детерминированных признаков взрослых рыб и их физиологического состояния на качество половых продуктов и молоди, на процессы формирования внутривидового разнообразия и величину пополнения промысловых запасов. Ее научное и практическое значение может рассматриваться в следующих основных аспектах: а) теоретическом; б) диагностическом; в) прикладном; г) ресурсосберегающем.
Основные результаты и их обсуждение
Фактический материал, полученный в результате экспериментальных исследований, представлен нами в [1]. В ходе работы выявлен ряд биометрических и физиолого-биохимических характеристик, пригодных для оценки производителей, икры и личинок, в том числе при различных нарушениях репродуктивного цикла и биотехнического процесса. Использование таких показателей базируется не только на визуальном или инструментальном сравнении, но и на результатах биометрического моделирования (линейной корреляции и нелинейной регрессии) между характеристиками половозрелых рыб, развивающейся икры и потомства. При выборе критериев оценки качества мы руководствовались двумя основными положениями:
1) значения того или иного показателя должны иметь статистически достоверные отличия от аналогов в группах с худшим качеством;
2) тот или иной показатель должен иметь достоверные корреляции с важнейшими рыбоводными характеристиками развивающейся икры в период инкубации (уровень оплодотворения, %; количество нормально развивающихся эмбрионов, %; выход предличинок, %), определение которых является арбитражным методом контроля при оценке качества икры.
Такой подход к выбору критериев качества является более жестким по сравнению с обычно применяемым сопоставлением различных групп, подкрепленным лишь статистическим анализом.
Диагностическое значение КЭР заключается:
1) в анализе динамики функциональных связей между физиологическим состоянием производителей, морфологическими и биохимическими характеристиками овулировавшей икры, размерами и выживаемостью потомства;
2) раскрытии биохимических механизмов процессов созревания и перезревания икры карповых рыб при экзогенном стимулировании созревания;
3) понимании механизмов накопления и трансформации структурных биохимических компонентов в овулировавшей икре (прежде всего - белков и фосфоглицеридов) при воздействии экзогенных гормонов.
В данной статье будут рассмотрены и обсуждены только некоторые диагностические аспекты КЭР.
Совершенно очевидно, что эндогенная разнокачественность производителей оказывает серьезное влияние на результаты гормонального стимулирования. Различная степень зрелости ооцитов и разный уровень накопления эссенциальных элементов, состояние эндокринной системы и уровень собственных гормонов в крови, активность и физиологическое действие применяемых стимулирующих препаратов неизбежно ведут к самым разнообразным последствиям экзогенного стимулирования. Скорее всего, инъекция не может считаться единственным и радикальным способом добиться полноценного созревания и овуляции без участия систем самого организма. Однако гормоны, введенные извне, тем более в достаточно высоких дозах, не могут не оказать влияния на организм - не удивительно, что некоторые авторы [2] называют физиологическое состояние в период инъекций «биохимическим хаосом», хотя в большинстве случаев экзогенное
вмешательство (инъецирование) приводит к положительному результату. При одной и той же дозе (что в реальности и используется в практике рыбоводства) конечный ответ репродуктивной системы индивидуальной особи-производителя зависит от уровня функциональной активности эндокринных желез и степени мейотических преобразований в ооцитах - т. е. от совокупности свойств, объединяемых в понятие «степень подготовленности производителей к нересту». Известно, что гормоны, введенные извне, достаточно быстро, всего лишь за 5-6 часов, выводятся из организма [3], но они дают мощный толчок к интенсивной секреции собственных гормонов [4].
Значительные колебания индивидуальных гематологических показателей производителей свидетельствуют о сильной лабильности физиологического состояния. Характеристиками, четко связанными с рыбоводным качеством икры, следует считать показатели системы эритрона (красной крови) - концентрацию гемоглобина и эритроцитов. Как правило, при повышении данных показателей у самок карпа и пестрого толстолобика возрастают уровень оплодотворения и выход, уменьшается количество уродливых эмбрионов. Параметром, отрицательно связанным с рыбоводными показателями развивающейся икры у обоих видов, является коллоидоустойчивость сывороточных белков (КСБ), а у карпа, кроме того, уровень общих липидов, а- и Р-липопротеидов и кальция. У карпа и пестрого толстолобика с уровнем оплодотворения икры достоверно связана концентрация свободного холестерола в сыворотке, причем у пестрого толстолобика высокодостоверные корреляции сохраняются в ходе всего эмбрионального развития [5].
Для самок карповых рыб после экзогенного стимулирования процессов созревания характерен видоспецифичный биохимический состав овулировавшей икры. Рыбоводные характеристики икры (оплодотворяемость и др.) в большей степени определяются условиями ее получения и в меньшей - биологическими особенностями производителей. Это позволяет выделить не только генотипические и паратипические компоненты эндогенной разнокачественности, но и технологическую составляющую. Недозрелая икра характеризуется наименьшей обводненностью, наибольшим количеством минеральных элементов, высоким уровнем фосфоглицеридов и низкими значениями коэффициента Дьерди. Постовулярно перезревшая икра имеет наибольшее количество воды и наименьшую долю фосфоглицеридов, характеризуется повышенным уровнем свободных жирных кислот и эфиров холестерина, пониженной концентрацией Р-липопротеидов в сравнении с высококачественной зрелой икрой.
Объективным критерием качества овулировавшей икры растительноядных рыб в условиях искусственного воспроизводства является содержание общего белка: максимальные значения соответствуют лучшим результатам инкубации и выживаемости непитающихся личинок. Дополнительными тестами при оценке качества икры могут быть: для белого амура - количество фосфоглицеридов и Р-липопротеидов, для пестрого толстолобика - гликогена, свободного холе-стерола и меди.
Потеря способности икры к оплодотворению в результате постовулярного перезревания связана с количественными изменениями структурных биохимических компонентов: на фоне развивающегося протеолиза возникает диспропорция в содержании фосфоглицеридов и холестерина, о чем можно судить по значительному росту коэффициента Дьерди. Динамика коэффициента Дьерди и соотношения натрий/калий согласуется с процессом интенсивного обводнения яйцеклеток.
Физиолого-биохимические особенности процессов перезревания и резорбции икры в условиях искусственного воспроизводства с применением метода гипофизарных инъекций в основном сходны с динамикой таких же процессов в естественных условиях [6]. Но скорость биохимических изменений, связанных с потерей способности к оплодотворению и нормальному развитию, в наших условиях оказалась гораздо выше в сравнении с таковой у различных представителей осетровых, карповых, окунёвых рыб. Такая ускоренная деструкция яйцеклеток у трёх изученных видов может быть следствием совместного влияния температурного фактора и гормонов, введённых извне. Резорбция зрелых яйцеклеток карповых рыб характеризуется повышением обводненности и уровня минеральных элементов, уменьшением содержания белка и липидов, изменениями электрофоретической подвижности белковых фракций и соотношения различных липидных компонентов, ростом соотношения натрий/калий.
Постовулярное перезревание икры и резорбция яйцеклеток значительно ухудшают физиологическое состояние самок белого амура, о чем можно судить по снижению уровня гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в крови, общего белка в сыворотке; повышению скорости оседания эритроцитов и коллоидоустойчивости сывороточных белков.
Уже в [7] мы обращали внимание на очень интересную особенность: наиболее сильные взаимосвязи с показателями эмбрионального развития (оплодотворяемость и др.) имеют биохимические характеристики овулировавшей икры, связанные с выполнением структурных функций у развивающихся зародышей, - количеством белков, фосфоглицеридов, холестерина, свободных жирных кислот. При этом количественные изменения этих компонентов, вероятно, связаны с динамикой проницаемости биологических мембран.
Фосфоглицериды, как известно, являются наиболее стабильными компонентами клеток, обеспечивающими их структурную целостность [8 и др.]. В период созревания половых продуктов количество фосфоглицеридов в органах и тканях рыб может существенно снижаться за счет их транспортировки в гонады. Икра на IV стадии зрелости гонад обладает структурой зрелой яйцеклетки, и, соответственно, для построения клеточных компонентов требуется своевременное поступление фосфоглицеридов. Это отчетливо заметно при анализе абсолютного содержания этого компонента липидов (в мкг на 1 икринку) и свидетельствует о первоочередном поступлении его в гонады. Этим можно объяснить также наибольшее содержание фосфоглицеридов в недозрелой икре, выброшенной из фолликулов под действием значительной дозы гормонов гипофиза. В процессе дозревания (перехода от недозрелой к зрелой икре) доля фосфоглицери-дов может уменьшиться по двум причинам: во-первых, растет доля других фракций, также поступающих в гонады, а во-вторых, происходит окончательная стабилизация биомембран, в результате которой все компоненты приводятся к оптимальному для данного вида соотношению. Возможен и третий вариант, когда ранее накопленные фосфоглицериды используются в качестве источника других липидных компонентов: гидролиз фосфоглицеридов под действием фосфолипаз может привести к синтезу иных ацилглицеринов через фосфатидную кислоту [9], другие компоненты распада фосфоглицеридов могут быть использованы в процессах биосинтеза (жирные кислоты, фосфорная кислота) или в макроэргических соединениях. Имеются данные о том, что под воздействием гонадотропных гормонов происходит обновление фосфолипидов [10], что может означать их частичный распад и синтез других, необходимых для развития. Применительно к половым клеткам рыб можно вести речь о распаде липовителлина, фосфитина и других фосфорорганических соединений, поступающих в клетку, и частичном синтезе новых фосфоглицеридов, специфичных для ооцитов и необходимых в ходе эмбриогенеза - аналогично процессам образования специфичных зародышевых белков [11]. Установлено также, что в биологических мембранах возможен самостоятельный синтез жирных кислот, триацилглицеринов, некоторых групп фосфоглицеридов - фосфатидилсерина, фосфатидилино-зита, лецитина [12]. Фосфоглицериды могут также участвовать в биосинтезе белка в качестве «депо» для концентрирования аминокислот или их активации при сближении с рибосомами, причем между содержанием белка и фосфоглицеридов в овулировавшей икре рыб обнаружена положительная корреляция [13] - в наших условиях такая корреляция также выявлена у карпа, но она не достигает порога достоверности (гху = + 0,21).
Таким образом, фосфоглицериды могут быть тем универсальным резервом яйцеклеток, который оказывает воздействие не только на липидный, но и на белковый обмен, причем их количество может зависеть от потребностей развивающегося эмбриона в том или ином компоненте. Создается впечатление, что фосфоглицериды выполняют не только структурные функции, но и являются своеобразным «депо» других липидных компонентов. Судя по коэффициентам корреляции, у белого амура количество фосфоглицеридов в овулировавшей икре тесно связано с уровнем оплодотворения и размерами эмбрионов, несколько слабее аналогичные зависимости у пестрого толстолобика. Не исключено, что гидролиз фосфоглицеридов является одним из факторов, обусловливающих необратимость физиолого-биохимических процессов в икре в ходе постовулярного перезревания, наряду с асфиксией в полости тела самок вследствие потери связи с кровеносными сосудами [14] и «энергетической депрессией» яйцеклеток [15].
Динамика свободного холестерола в икре может рассматриваться как фактор стабилизации или, напротив, дестабилизации мембран, приводящий липидную фазу в то или иное кон-формационное состояние, - включение холестерина оказывает «конденсирующий» или «разжижающий» эффект по отношению к биомембранам [6]. Так, в высококачественной икре сазана и белого амура содержание свободного холестерола минимально, а у пестрого толстолобика, наоборот, максимально. Как известно, в клетках и тканях животных существует хорошо сбалан-
сированная система, регулирующая содержание свободного холестерола в клеточных органел-лах и мембранах, причем часть его используется как строительный материал для образования внутриклеточных мембран, а часть запасается в виде эфиров холестерина [17]. При этом общее содержание холестерина сохраняет свой специфичный для органа или ткани уровень и, как следует из наших данных, имеет и видовые отличия в яйцеклетках.
В процессе перезревания при постоянном увеличении коэффициента Дьерди не происходит соответствующего повышения уровня оплодотворения икры, чего можно было бы ожидать, исходя из возможного повышения проницаемости мембран. Переход от недозрелой к зрелой икре у всех видов сопровождается повышением уровня оплодотворения, однако дальнейшее увеличение коэффициента не приводит к соответствующему росту. В соответствии с современными представлениями о структуре биологических мембран [18], количественные и структурные изменения белков и липидов, аналогичные наблюдаемым, можно рассматривать как фактор дестабилизации мембран. Вполне вероятно, что причиной, обусловливающей потерю способности ооцитов к оплодотворению, является нарушение стабильности структур и функций биологических мембран. Изменения коэффициента Дьерди в данном случае могут иметь лишь подчиненную роль, поскольку основным процессом, приводящим к дестабилизации, является протео-лиз. Однако в первом приближении по величине коэффициента вполне можно судить о возможных нарушениях: значительное возрастание свидетельствует о нарушении оптимального соотношения между основными липидными компонентами - фосфоглицеридами и холестерином. О патологическом значении чрезмерного повышения коэффициента Дьерди говорят отрицательные корреляции с уровнем оплодотворения и количеством нормально развивающихся эмбрионов [1, 7].
Для размеров и выживаемости непитавшихся личинок также можно выделить оптимальные значения различных компонентов овулировавшей икры, соответствующие лучшим рыбоводным показателям. В экспериментах установлены количественные характеристики разнораз-мерности и выживаемости непитавшихся личинок карповых рыб и их взаимосвязи с биохимическим составом овулировавшей икры. Биометрическое моделирование позволило показать, что у сазана и карпа длина вылупляющихся предличинок также гораздо сильнее связана с количественным содержанием структурных биохимических компонентов в овулировавшей икре (белок, фосфоглицериды, свободный холестерол), чем с уровнем энергетических составляющих (общие липиды и триацилглицериды). Повышенная концентрация минеральных веществ в икре негативно сказывается на размерах и жизнестойкости личинок.
Заключение
Совокупность физиолого-биохимических параметров производителей, икры и молоди дает много полезного материала для оценки их качества в условиях искусственного воспроизводства. На основании полученных экспериментальных данных могут быть сформулированы представления о «гематологическом статусе» половозрелых рыб; соответствующие показатели для личинок могут пригодиться при создании размерно-возрастного стандарта для молоди карповых рыб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Залепухин В. В. Концепция эндогенной разнокачественности в условиях искусственного воспроизводства карповых рыб: Моногр. - Волгоград: Волгоград. науч. изд-во, 2006. - 320 с.
2. Долидзе Ю. Б. Физиолого-биохимическая характеристика производителей каспийской белуги (Huso huso L.) в естественных и заводских условиях: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1983. - 17 с.
3. Бурлаков А. Б. Физиологические механизмы формирования качества половых продуктов при искусственном воспроизводстве рыб // Первый конгресс ихтиологов России. - М., 1997. - С. 213.
4. Баранникова И. А. Гормональная регуляция размножения и проблема стимуляции созревания половых желез рыб в связи с задачами рыбного хозяйства // Тр. ВНИРО. - 1975. - Т. 111. - С. 23-34.
5. Залепухин В. В. Гематологический анализ в оценке производителей карповых рыб // Стрежень: науч. ежегод. - Волгоград, 2004. - Вып. 4. - С. 79-85.
6. Перезревание и резорбция зрелых яйцеклеток и физиолого-биохимическое проявление их у тарани и леща / В. Н. Жукинский, Р. И. Гош, Ю. Д. Коновалов и др. // Разнокачественность онтогенеза у рыб. -Киев: Наук. думка, 1981. - С. 85-126.
7. Залепухин В. В. Биологическая и физиолого-биохимическая разнокачественность самок и икры карповых рыб в условиях заводского воспроизводства: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М.: ВНИИПРХ, 19S5. - 25 с.
S. Сидоров В. С. Экологическая биохимия рыб. Липиды. - Л.: Наука, 19S3. - 240 с.
9. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. - М.: Мир, 19S1. - 216 с.
10. Дин Р. Процессы распада в клетке. - М.: Мир, 19S1. - 120 с.
11. Нейфах А. А., Тимофеева М. Я. Молекулярная биология процессов развития. - М.: Наука, 1977. - 312 с.
12. Поликар А. Молекулярная цитология мембранных систем животной клетки. - М.: Мир, 1972. - 15S с.
13. Ким Е. Д. К вопросу о роли фосфоглицеридов в синтезе белка половых и эмбриональных клеток карповых рыб // Экологическая физиология и биохимия рыб: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. - Астрахань, 1979. - Т. 2. - С. 102-103.
14. Брашэ Ж. Биохимическая эмбриология. - М.: Изд-во иностр. лит., 1961. - 327 с.
15. Гош Р. И. Энергетический обмен половых клеток и эмбрионов у рыб. - Киев: Наук. думка, 19S6. - 14S с.
16. КрепсЕ. М. Липиды клеточных мембран. - Л.: Наука, 19S1. - 339 с.
17. Полякова Э. Д. Регуляция содержания холестерина в клетке // Биохимия липидов и их роль в обмене ве-
ществ. - М.: Наука, 19S1. - С. 120-127.
1S. Singer S. J., Nicolson G. L. The fluid mosaik model of the structure of cell membranes // Science. - 1972. -Vol. 175. - P. 720-727.
Статья поступила в редакцию 20.12.2006
SOME DIAGNOSTIC ASPECTS OF ENDOGENOUS HETEROGENEITY CONCEPTION
N. N. Fedorova, V. V. Zalepukhin
Some diagnostic aspects of endogenous heterogeneity conception, which was worked out for the conditions of fish artificial reproduction, are discussed in the paper. An opinion is expressed about the interrelation between qualitative characteristics of developing eggs and quantitative changes of components of biological membranes - proteins, phospholipids and cholesterol.
