CC BY
136
ЁР
ИССЛЕДОВАНИЯ / Перспективные технологии
Мясо in vitro
как перспективный источник
полноценного белка
И. А. Рогов, академик РАСХН, доктор техн. наук,
Московский государственный университет пищевых пр-в,
А. Б. Лисицын, академик РАСХН, доктор техн. наук, К. Г. Таранова,
ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии,
И. М. Волкова, канд. техн. наук,
ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко
В течение ряда лет в России проводятся фундаментальные исследования по созданию технологии получения мяса in vitro. В настоящее время методами клеточной инженерии путём направленной миодиффе-ренцировки мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК in vitro получена клеточная биомасса, сходная по биологической ценности с мышечной тканью крупного рогатого скота.
^ Стремительно ускоряющийся рост численности населения Земли требует кардинальных решений проблем увеличения объемов производства продовольствия. В глобальном масштабе обеспечение населения планеты мясом путем развития животноводства будет всё глубже обострять сопряжённые с этим вопросы сохранения окружающей среды и неэффективного использования природных, энергетических и трудовых ресурсов [1, 2].
Одним из новых направлений получения животного полноценного белка является выращивание мышечной ткани in vitro из стволовых клеток сельскохозяйственных животных.
Научные достижения в области культивирования клеток к началу XXI века достигли достаточно высокого уровня, и идея создания культурального мяса почти одновременно стала очевидной для многих зарубежных (Нидерланды, США, Австрия, Великобритания, Индия, Канада и др.) [3-7] и российских ученых [8, 9].
По сравнению с традиционной мясной индустрией производство культурального мяса имеет ряд очевидных преимуществ: состав такого мяса в процессе получения поддаётся строгому контролю; снижается до минимума риск заболеваний, связанных с употреблением пищи; отпадает необходи-
мость в широкомасштабном воспроизводстве животных. Способ получения мяса in vitro является гуманным, поскольку отбор стволовых клеток не требует осуществления убоя животных. Стоит также особенно отметить, что способ не включает генных модификаций.
Результаты исследований, проведённых по заказу ряда зарубежных организаций и фирм, показали, что в сравнении с традиционно выращенным мясом для производства 1000 кг культурального мяса требуется 26-33 ГДж энергии (меньше на 7-45%), 367521 м3 воды (меньше на 82-96%), 190-230 м2 земли (меньше на 99%), а выбросы парниковых газов составляют 1900-2240 кг в СО2-экв. (меньше на 78-96%) [10].
Первые исследования, проведенные в России, позволили предложить оригинальный способ накопления клеток мышечной ткани [8, 9]. В развитие полученных результатов учеными Московского государственного университета пищевых производств, Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Л. Р. Коваленко, Всероссийского научно-исследовательского института мясной промышленности им. В. М. Горбатова Россельхозакадемии были продолжены научно-исследовательские работы по созданию перспективных методов получения культу-
УДК 637.5.045:57.085.2 Ключевые слова: мясо in vitro (культуральное мясо), мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, костный мозг, жировая ткань, клеточная биомасса, фракционный состав белков, аминокислотный состав. рального мяса и формированию молодых научных кадров, способных работать на стыке таких наук как биология, биотехнология, технология мяса и мясных продуктов, клеточная и тканевая инженерия.
В настоящее время путём направленной миодифференци-ровки мультипотентных мезенхим-
Коитрель Ml
»1
»3
Рисунок 1. Электрофореграмма белковых фракций
Обозначения: клетки мышечной ткани, полученные путем направленной дифферен-цировки ММСК, выделенных из КМ КРС, in vitro (параллельные выработки); образец №3 - мышечная ткань говядины; контроль - стандартный образец с известными молекулярными массами
Перспективные технологии / ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 1. Фракционный состав белков образцов клеточной биомассы и мышечной ткани говядины
Белки мяса Молекулярная масса, кДа Экспериментальные образцы
№1 №2 длиннейшая мышца спины
Коллагеновый белок 300 - 400 - - +
Тяжелые цепи миозина 205 - 210 + + +
Миомезин 185 + + -
М-белок 165 + + +++
Глобулин X 160 - - +
С-белок 110 - 140 + + ++
а-актинин 100 ++ ++ +
Миоген 81 ++ ++ ++
Тубулин р 55 + + +
Тубулин а 53 + + -
I - белок 50 - - +
G - актин 42 + + -
Тропомиозин1 39 + + +
Тропонин Т 35 - 38 + + +++
Тропомиозин 2 32 + + +
ТропонинI 23 - 21 ++ ++ ++
Легкие цепи миозина:
ЛЦ 1 25 + + -
LС - А1 20.7 + + -
ЛЦ 2 16 + + +
ЛЦ 3 14 + + +
Обозначения: - - отсутствует; + - присутствует; ++ - присутствует в значительном количестве; +++
ных стволовых клеток (ММСК) in vitro получена биомасса, состоящая из клеток мышечной ткани. Для этих целей из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖГ) крупного рогатого скота (КРС) были выделены и охарактеризованы клеточные популяции с фенотипом, подобным ММСК. Установлено, что ММСК, выделенные как из КМ, так и из ЖГ КРС, способны формировать клетки жировой, костной и мышечной тканей при культивировании в индукционных средах in vitro [11, 12]. Полученная биомасса клеток мышечной ткани представляет интерес, прежде всего, как источник полноценного белка. В связи с этим было проведено изучение фракционного и аминокислотного состава белков полученной клеточной биомассы в сравнении с мышечной тканью говядины.
Объекты и организация исследований
Объектами исследования являлись образцы клеток мышечной ткани, полученные путем направленной дифференцировки ММСК, выделенных из КМ КРС, in vitro. В качестве объекта сравнения брали мышечную ткань говядины (L. dorsi).
Мясо in vitro (клеточную биомассу) получали следующим способом: культуры ММСК, выделенные из КМ КРС, высевали в культуральные матрасы с площадью поверхности 225 см2 в концентрации 1x106 кл./см2 каждый. По достижении клетками 70-80% монослоя рабочую среду меняли на индукционную (в качестве индуктора использовали ретиноевую кислоту) и культивировали в течение четырех суток. Далее диффе-ренцировку проводили в питательной среде без добавления индуктора. На 30-е сутки культивирования клетки снимали с помощью культурального скребка для клеток и проводили одномерный (1D) электрофорез, а также определяли аминокислотный состав.
Методы исследования
Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ).
Исследования фракционного состава белков в полученной клеточной биомассе проводили мето-
- присутствует в большом количестве.
дом одномерного электрофореза, основываясь на литературных данных, представленных в [13].
Электрофоретическое разделение белков проводили в двух основных режимах при постоянном напряжении 300 В и смене силы тока от 15 до 30 мА на приборе Consort E833 (Sigma, США). Высушенный в мембраной пленке гель помещали в денситометр SYN-GENE Bio Imaging systems, и с помощью специализированного программного обеспечения Gene Tool и Gene Snap проводили идентификации белковых полос.
Определение аминокислотного состава. Изучение аминокислотного состава образцов проводили по стандартным методикам [14] на автоматическом аминокислотном анализаторе Aracus (Abacus, Германия) методом постколоночной дериватизации нингидрином после кислотного гидролиза. Определение аминокислот проводили в соответствии с руководством по эксплуатации анализатора Aracus.
В процессе кислотного гидролиза триптофан и оксипролин разрушаются (на 80-90%), поэтому их определение в настоящем исследовании не проводилось и будет предметом дальнейшего изучения.
Результаты и их обсуждение
Результаты электрофоретического разделения представлены на элек-трофореграмме (рис. 1).
В табл. 1 приведены белковые фракции, выявленные при проведении эксперимента. Полученные результаты электрофоретического разделения сравнивали с имеющимися данными электрофореза мышечной ткани говядины.
В результате проведенных исследований были получены следующие данные. Образец мышечной ткани говядины (№3) содержал коллагеновый белок (300 - 400 кДа). В образцах клеточной биомассы (№1 и №2) данный белок не выявлен, что объясняется отсутствием в ней клеток соединительной ткани. Тяжелые цепи миозина (205 - 210 кДа) присутствовали во всех образцах в количестве одной фракции. Одна фракция белка миомезина (185 кДа) присутствовала только в клеточной биомассе (образцы №1 и №2).
Во всех исследуемых образцах были обнаружены такие фракции высокомолекулярных белков, как С-белок (110 - 140 кДа) и М-белок (170 кДа). С-белок относится к группе белков семейства тайтина, относящегося к саркомер-
№ 4 август 2013 ВСЁ О МЯСЕ
23
ИССЛЕДОВАНИЯ I Перспективные технологии
Таблица 2. Общий аминокислотный состав клеточной биомассы
Наименование аминокислоты Наименование об разца Рекомендации ФАО/ВОЗ 1985, г АК/100 г белка
Говядина Опыт 1 (образец клеточной биомассы) Опыт 2 (образец клеточной биомассы)
Незаменимые аминокислоты (НАК), г/100 г белка
Валин 3.3 2.964 3.375 4.4
Цистеин 1.6 1.4
Изолейцин 3.2 2.518 2.667 4.3
Лейцин 6 6.915 7.776 7.2
Лизин 7.3 4.693 5.877 5.5
Метионин 2.3 0.636 0.505 2.3
Треонин 5.7 6.031 4.957 6.3
Триптофан 1.3 - - 1.1
Фенилаланин 4.4 2.943 3.368 4.6
Тирозин 4.3 2.559 2.96 3.3
Сумма НАК 39.4 29.259 31.485 43.5
Заменимые аминокислоты (ЗАК), г/100 г белка
Аспарагиновая кислота 7.6 11.192 9.128 10.2
Серин 5.4 6.328 5.295 4.6
Глутаминовая кислота 18.5 14.486 13.144 16.8
Пролин 4.2 7.898 7.477 5.5
Глицин 5.8 7.161 7.635 3.7
Аланин 4.4 5.911 7.13 3.8
Гистидин 5.1 3.125 4.419 2.3
Аргинин 7.5 3.641 3.285 6.7
Сумма ЗАК 58.5 59.742 57.513 52.6
Сумма общих аминокислот 97.9 89.001 88.998 97.1
ным белкам поперечнополосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в сар-комере. Кроме того, не исключено, что С-белок, способный взаимодействовать как с миозином, так и с актином, оказывает влияние на взаимодействие толстых (мио-зиновых) и тонких (актиновых) нитей в скелетных мышцах. Аминокислотный состав С-белка и М-белка характеризуется высоким содержанием пролина. Пролин очень важен для поддержания функции суставов и для работы сердца. При длительном недостатке или перенапряжении во время занятий спортом пролин может использоваться как источник энергии для мышц, способствует заживлению ран, улучшает способность к обучению, является главным компонентом коллагена, важен для функционирования хрящевой поверхности суставов, укрепляет связки, сухожилия и сердечную мышцу, улучшает состояние кожи. Поэтому пищевые продукты (особенно мясные), богатые пролином, очень полезны для здоровья человека.
Также в исследуемых образцах были обнаружены белки фракции миогена. Миоген составляет около 20% всех белков мышечного волокна и является полноценным белком. Миоген относится к глобулярным, растворимым в воде белкам саркоплазмы, он является легкоусвояемым, также выполняет ряд важных ферментативных функций, связанных с процессом гликолиза как основным энергетическим процессом в организме человека.
Во всех исследуемых образцах были обнаружены субъединицы белка тропомиозина (39 и 32 кДа) и белка тропонина: тропонин Т (35-38 кДа), тропонин I (2325 кДа). Тропонин — регулятор-ный глобулярный белок, состоящий из трёх субъединиц, который участвует в процессе мышечного сокращения. Содержится в скелетных мышцах и сердечной мышце, но не содержится в гладкой мускулатуре. Наличие в исследуемых образцах фракций тропонина и тро-помиозина свидетельствовало о том, что в полученном мясе in vitro
присутствовали клетки скелетной мышечной ткани.
Основные полноценные белки мышечной ткани животных - миозин и актин. По их содержанию можно судить о биологической ценности продукта. В исследуемых образцах клеточной биомассы фракции этих белков были обнаружены, что свидетельствовало о большом потенциале биомассы как источника полноценного белка для производства продуктов питания. Миозин - основной мышечный сократительный белок. Его нормальное функционирование обеспечивают тяжелые и легкие цепи (ЛЦ). В каждой головке молекулы миозина с тяжелой цепью ассоциированы две разные ЛЦ: "щелочная" (или "существенная") и "регуля-торная". Миокард имеет существенные ЛЦ (ЛЦ1) и регулятор-ные ЛЦ (ЛЦ2), отличающиеся по молекулярному весу от таковых гладких и скелетных мышц. ЛЦ миозина принадлежит ведущая роль в запуске сокращения в мышцах с так называемым миозиновым типом регуляции. К ним относятся поперечнополосатые и гладкие мышцы позвоночных.
Существует две формы щелочных ЛЦ - А1 и А2. Они имеют
идентичные С-концевые последовательности, состоящие из 141 аминокислотного остатка. Остальные 8 N-концевых остатков в А2 не полностью идентичны соответствующим остаткам в А1 (имеется 4-5 замен). Однако главное различие состоит в том, что А1 имеет дополнительный, отсутствующий у А2 N-концевой сегмент из 40-41 аминокислотного остатка, богатый пролином, лизином, аланином. Как правило, миозины из разных объектов содержат одну из этих форм щелочных ЛЦ: либо типа А1 (миозин из медленных скелетных мышц и из сердца), либо типа А2 (миозин из гладких мышц). В образцах клеточной биомассы были обнаружена фракция легких цепей миозина А1, что свидетельствовало о том, что миозин, содержащийся в мясе in vitro, соответствовал миозину скелетных мышц [15].
Таким образом, полученные результаты позволили сделать вывод, что фракционный состав белков полученной клеточной биомассы не существенно, но отличается от фракционного состава белков говядины. Это связано с отсутствием в клеточной биомассе белков соединительной ткани, а также с ее несовершенным соста-
Перспективные технологии / ИССЛЕДОВАНИЯ)
вом в сравнении с говядиной. Стоит отметить наличие фракций многих важных полноценных белков мышечной ткани (актин, миозин) в полученной биомассе. Наличие в исследуемых образцах фракций тропонина и тропомио-зина, а также фракции А1 свидетельствует о том, что, скорее всего, полученная клеточная биомасса состояла из смеси клеток скелетной мышечной ткани и клеток гладкой мускулатуры. Представляет интерес продолжить исследования в данном направлении для получения биомассы по составу более разнообразной, содержащей большее количество фракций полноценных и неполноценных белков.
Изучение аминокислотного состава в мышечных тканях позволило получать данные, характеризующие качественный и количественный состав белков мышечной ткани. Кроме того, результаты аминокислотного анализа позволили оценить первичную структуру белков, характер протекающих обменных процессов и возможность последующего усвоения при включении их в пищевой рацион. Определение лимитирующих аминокислот в изучаемом белке проводили в сравнении с «идеальным» белком, полностью сбалансированным по аминокислотному составу. Для сравнения в качестве «идеального» белка использовали аминокислот-
ную шкалу Комитета ФАО/ВОЗ (1985), рекомендуемую для взрослого человека [16].
Результаты определения аминокислотного состава исследованных образцов выращенной клеточной биомассы приведен в табл. 2.
Как свидетельствуют данные табл. 2, образцы клеточной биомассы содержали все НАК, т.е. являлись полноценными, а также имели достаточно высокие показатели биологической ценности, близкие к норме, рекомендованной ФАО/ВОЗ. Также представляло интерес сравнить аминокислотный состав образцов биомассы и мышечной ткани говядины. Так, сумма НАК в образцах биомассы была ниже на 14,2% и на 12% по сравнению с нормами ФАО/ВОЗ, на 10,1% и на 7,9% по сравнению с мышечной тканью говядины. Наиболее существенная разница в содержании отдельных НАК наблюдалась по изолейцину, фенил-аланину и метионину, по остальным НАК образцы были близки к нормам ФАО/ВОЗ и к аминокислотному составу говядины.
Общее содержание ЗАК в образцах биомассы №1 и №2 было выше на 7,1% и на 4,9%, соответственно, по сравнению с нормами ФАО/ВОЗ и на 1,2% в образце №1 по сравнению с мышечной тканью говядины. Отмечалось повышенное содержание следующих
ЗАК в образцах биомассы по сравнению с нормой: серин, про-лин, глицин, аланин, гистидин.
Отношение группы НАК к группе ЗАК (аминокислотный индекс НАК/ЗАК) в опытных образцах составил 0,49 - для образца №1 и 0,55 - для образца №2, что близко к значениям этого показателя, рекомендованного ФАО/ВОЗ для сбалансированного питания -0,56...0,67.
Аминокислотный индекс отношения НАК к общему содержанию аминокислот для «стандартного» белка имеет значение 0,4; в исследованных образцах биомассы этот показатель составил 0,33 - для образца №1 и 0,35 - для образца №2, что также показывало достаточно высокую биологическую ценность клеточной биомассы.
Таким образом, основные показатели биологической ценности полученной клеточной биомассы свидетельствовали о сходстве ее состава с белками мышечной ткани говядины, то есть о перспективности дальнейшего развития методов ее получения и применения в качестве пищевого белкового ингредиента.
Контакты:
Иосиф Александрович Рогов Андрей Борисович Лисицын Ксения Геннадьевна Таранова Ирина Михайловна Волкова +7 (925) 049-9460
Литература
1. Доклад о человеческом развитии 2011. Устойчивое развитие и равенство возможностей: лучшее будущее для всех / Пер. с англ.; ПРООН. М.: Изд-во «Весь Мир», 2011. 188 с.
2. Thornton P. K. Livestock production: recent trends, future prospects // Philosophical transactions of the royal society. 2010. Vol. 365. P. 2853 - 2867.
3. Langelaan M. L. P., Boonen K. J. M., Polak R. B., Baaijens F. P. T., Post M. J., D. W. J. van der Schaft Meet the new meat: Tissue engineered skeletal muscle // Trends in Food Science & Technology. 2009. doi: 10.1016/j.tifs.2009.11.001.
4. Haagsman H. P., Hellingwerf K. J., Roelen B. A. J. Production of animal proteins by cell systems // Utrecht: Faculty of Veterinary Medicine, October 2009. 58 p.
5. Post M. J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects //Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297 - 301.
6. United States patent № US 6,835,390 B1. Method for producing tissue engineered meat for consumption / Vein Jon - 28 Dec. 2004.
7. United States patent № US 7,270,829 B2. Industrial production of meat using cell culture methods / van Eelen W. F. - 18 Sept. 2007.
8. Патент 2314719 Российская Федерация МПК7 C12N 5/06, A23 L 1/31. Способ получения мясного продукта / Рогов И. А., Валихов А. Ф., Демин Н. Я., Кроха Н. Г., Лисицын А. Б., Семёнов Г. В., Титов Е. И., Тутельян В. А., Рогов С. И., Эрнст Л. К.: заявитель и патентообладатель ФАО ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии. - № 2006119540; заявл. 06.06.2006; бюл. №2.
9. Рогов И.А., Волкова И. М. Способ выращивания мяса in vitro. Обзор // Биозащита и биобезопасность. 2012. Т. IV, № 3 (12). С. 26 - 32.
10. Toumisto H. L., de Mattos M. J. T. Environmental impacts of cultured meat production // Environmental Science and Technology. 2011. Vol. 45. P. 6117 - 6123.
11. Волкова И. М., Викторова Е. В., Савченкова И. П., Гулюкин М. И. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 2. С. 32 - 38.
12. Рогов И. А., Волкова И. М., Кулешов К. В., Савченкова И. П. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, в клетки мышечной ткани in vitro // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 6. С. 66 - 72.
13. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование: практическое пособие. М.: Наука, 1981. 288 с.
14. Иванкин А. Н., Красноштанова А. А. Гидролиз нанобиомакромолекулярных систем. М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2010. 396 с.
15. Хапчаев А.Ю., Ширинский В. П., Воротников А. В. Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина // Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 365 - 420.
16. Protein Quality Evaluation. Rep. of Joint FAO/WHO Expert Consultation // Rome: FAO of UN, 1990. 66 p.
№ 4 август 2013 ВСЁ 0 МЯСЕ
25
