CC BY
22
УДК: 615.099 DOI: 10.12737/21853
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ТРЁХ ТИПОВ УГЛЕРОДНЫХ НАНОВОЛОКОН НА ОРГАНЫ ПИЩЕВАРЕНИЯ КРЫС ЛИНИИ ВИСТАР ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ
В .В. ЧАЙКА*, А.А СЕРГИЕВИЧ*, Н.В. САЯПИНА**, Т.А. БАТАЛОВА**, И.В. МИШАКОВ***,
А.А. ВЕДЯГИН***, К.С. ГОЛОХВАСТ*
* Дальневосточный федеральный университет, ул. Суханова, 8, Владивосток, 690000, Россия,
e-mail: altexes@mail.ru Амурская государственная медицинская академия, ул. Горького, 95, г. Благовещенск, Амурская область, 675000, Россия Институт катализа им. Г.К. Борескова, Академика Лаврентьева пр-т, д. 5, Новосибирск,
630090, Россия
Аннотация. Применение наноматериалов, согласно имеющимся на сегодняшний день данным, поднимает ряд вопросов об экологической безопасности и оценки возможных рисков. Последнее требует тщательного изучения механизмов отрицательного токсического или положительного биологического эффектов на организменном, системном и клеточном уровнях, что позволит раскрыть их уникальные реакционные способности изменять физико-химические свойства окружающей жидкостной среды. В настоящей работе представлены результаты исследования влияния 3 типов углеродных нановолокон на организм крыс линии Вистар при пероральном введении с пищей в дозе 500 мг/кг тела в течение 14 дней. Углеродные нановолокна по результатам электронной микроскопии имели линейные размеры: средний диаметр 85 нм и длину 5-50 мкм. Показано влияние нановолокон на гистологическое строение желудка, кишечника и печени крыс. Отмечается ответная реакция на механическое раздражение: повышенное слизеобразование, утолщение слизистой, увеличение лимфоидных фолликулов, и, в ряде случаев, вакуолизация и некроз. Таким образом, показано выраженное влияние наноматериалов на гистологическое строение органов пищеварительной системы после перорального применения и существует необходимость дальнейшего изучения данного вопроса ввиду высокой важности технологического процесса получения перспективных наноматериалов. Полученные данные согласуются с данными других авторов.
Ключевые слова: углеродные нановолокна, токсичность, крысы Вистар.
MORPHOLOGICAL ASSESSMENT OF THE 3 TYPES OF CARBON NANOFIBRES EFFECTS ON DIGESTIVE ORGANS IN VISTAR RATS DURING ORAL INTRODUCTION
V.V. TCHAIKA*, А.А. SERGIEVICH*, N.V. SAYAPINA**, Т.А. BATALOVA**, I.V. MISHAKOV***,
А.А. VEDYAGIN***, KS. GOLOKHVAST*
Far Eastern Federal University, Suchanov str., 8, Vladivostok, 690000, Russia, e-mail: altexes@mail.ru Amur State Medical Academy, Gorkogo str., 95, Blagoveschensk, 675000, Russia G.K. Boreskov Institute of catalysis, Ak. Lavrenyeteva str., 5, Novosibirsk, 630090, Russia
Abstract. The use of nano-materials, according to currently available data, raises a number of questions about the environmental safety and risk-assessment. It requires careful study of the toxic mechanisms of negative or positive biological effects at the organisme, systemic and cellular levels that will reveal their unique reactivity to modify physico-chemical properties of the surrounding liquid environment. Results of research of the 3 types of carbon nanofibres effects on an organism of Vistar rats at oral introduction with food in a dose of 500 mg/kg of a body within 14 days are presented. Carbon nanofibres by results of electronic microscopy had the linear sizes: average diameter is 85 nanometers and length of 5-50 microns. Influence of nanofibres on a histologic structure of a stomach, intestines and a liver of rats is shown. Response to mechanical irritation is noted: the raised slime production, a thickening mucous, increase in lymphoid follicles, and in some cases, a vacuolation and a necrosis. Thus, it is shown a marked effect of nano-materials on the histological structure of the digestive system after oral administration. So there is a need for further study of this issue due to the high importance of the technological process of obtaining of promising nano-materials. The obtained data are consistent with the data of other authors.
Key words: carbon nanofibers, toxicity, Wistar rat.
В последнее время на углеродные нановолокна обращают всё больше внимания [2, 4-6, 8, 11].
Их применяют в широкой области технологии, в том числе, от текстильной промышленности, для производства нанотканей [3] до сорбции токсичных соединений и адресной доставки лекарств [9].
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2016 - N 4
Но, как показывают данные исследователей, существует опасность для окружающей среды и здоровья человека при применении наноматериалов, в том числе, нановолокон, [7, 10, 12]. Углеродные на-нотрубки и нановолокна могут быть более токсичными, чем кварцевые волокна. Как сообщается в одной из работ [1], заметная цитотоксичность однослойных нанотрубок наблюдается при 6-часовой экспозиции и увеличивается на 35% при повышении концентрации трубок до 11,3 мкг/см2
Цель данной работы изучить морфологические изменения в пищеварительном тракте у животных при пероральном применении 3 типов углеродных нановолокон.
Материал и методы исследования. Все опыты с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Перед выполнением работ всех животных содержали в одинаковых условиях. Не менее 10 дней перед началом эксперимента крысы получали полноценный пищевой рацион в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (1977).
Для определения влияние углеродных нановолокон (УНВ) на морфологию внутренних органов при пероральном введении использованы самцы крыс линии Вистар массой 300 г. Они получали УНВ с пищей в дозировке 500 мг/кг массы тела в течении 14 дней. УНВ перемешивали с едой (стандартный комбикорм) и контролировали процесс поедания.
Животных разделяли на 4 экспериментальные группы по 10 особей в каждой, в том числе: «Контроль» - животные, которые не получали минералы, «КМ2» - крысы, получавшие УНВ КМ2-56-БР, «БР» - крысы, получавшие УНВ 56-БР, «ОБР» - крысы, получавшие УНВ 56-ОБР.
Углеродные нановолокна были синтезировали в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН (Новосибирск) путём каталитического разложения пропан-бутановой смеси (С3-С4) на гетерогенном катализаторе 90%Ni0+10%Al203, приготовленном методом соосаждения нитратов никеля и алюминия. Синтез проводили на установке с роторным реактором при 500°С. Выход углеродного продукта составил 24 г/г (кат). Морфология полученных углеродных нитей соответствовала коаксиально-коническому типу. Полученный образец (56БР) был разделен на 3 части. Вторая часть была обработана в концентрированной азотной кислоте (30 мин), что позволило удалить дисперсные частицы никеля из состава углеродного материала (56-ОБР). Третья часть исходного материала 56БР была подвергнута влажному размолу в керамической мельнице в суспензии с водой в течение 24 часов (КМ2-56БР). По данным электронной микроскопии, средний диаметр углеродных нитей во всех трех образцах составил 85 нм и не менялась при обработке, а длина нитей немного уменьшилась при размельчении. Длина нитей колебалась в пределах 5-50 мкм. Характеристика разных УНВ приводится в табл. 1.
Таблица 1
Физико-химические параметры УНВ, взятых в эксперимент
Характеристика Диаметр УНВ, нм Длина УНВ, мкм Площадь удельной поверхности УНВ, м2/г
56-БР от 20 до 200 (в среднем 85) 5-50 105
КМ2-56-БР 103
56-ОБР 125
УНВ представляли собой агрегаты разного размера (рис. 1).
Рис. 1. Агрегат углеродных нановолокон БР-56. Электронная трансмиссионная микроскопия.
Измерительный отрезок 200 нм
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES, eEdition - 2016 - N 4
Гранулометрический анализ размера агрегатов УНВ проводили на лазерном анализаторе частиц Analysette 22 NanoTech (фирма Fritsch).
Забор материала осуществлялся после наркотизации крысы внутримышечным введением 0,5 мл 5% раствора кетамина. Блоки фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина «Histoline» (Элемент, Россия), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в парафин «Histomix Extra» (БиоВитрум, Россия). Из полученных блоков готовили полутонкие срезы, окрашивали гематоксилин-эозином, изучали под световым микроскопом «Zeiss Axio Observer А1» (Zeiss, Германия), для фотосъемки - «Axio Cam 3» (Zeiss, Германия) и программу компьютерной морфо-метрии «AxioVision 4.2».
Результаты и их обсуждение. УНВ при введении животным с кормом не выявлялись в виде индивидуальных структур и были представлены агрегатами разного размера.
Рис. 2. Распределение агрегатов УНВ 56-БР по размеру и их доля (%) в типовом образце Для удобства результаты лазерной гранулометрии сведены в табл. 2.
Таблица 2
Физико-химические параметры УНВ, взятых в эксперимент
Характеристика Средний арифметический диаметр агрегатов УНВ, мкм Площадь удельной поверхности агрегатов УНВ, см2/см3
56-БР 14,52 7549,34
КМ2-56-БР 25,22 8983,11
56-ОБР - -
Как можно видеть агрегаты обладают высокой площадью удельной поверхности и могут сорбировать биомолекулы и нарушать ход нормальных биохимических и физиологических процессов.
Гистологическое строение ткани желудка (рис. 3а и б), при световой микроскопии в экспериментальных группах животных, получавших с кормом УНВ, выявило ряд отличий от контроля.
Рис. 3. Гистологическое строение желудка у крыс при введении УНВ разных типов. а) Желудок крысы в группе КМ2. Поверхностный слой слизистой желудка отсутствуют ядра, граница клеток стерта. Окраска гематоксилин-эозином. б) Желудок крысы в группе 56-ОБР. Крупный лимфоидный фолликул. Окраска
гематоксилин-эозином. Увеличение а) ><400, б) х200
В целом, в группах 56-БР, КМ2 и 56-ОБР отмечается утолщение слизистой оболочки желудка по отношению к группе «Контроль», что является следствием механического раздражения УНВ. Подслизи-стая и серозная оболочка, гладкая мускулатура во всех группах без патологических изменений. Сосуды полнокровны, но стаза не отмечается.
В группе КМ2 в поверхностных слоях слизистой оболочки отмечаются дистрофические изменения и некрозы (рис. 2а). Ядра здесь не прослеживаются, границы клеток стерты. В группе 56-ОБР отмечается в подслизистой оболочке множественные лимфоидные фолликулы (рис. 2б).
Морфометрические параметры эпителиоцитов желудка в экспериментальных группах приводится в табл. 3.
Таблица 3
Морфометрические параметры эпителиоцитов желудка в экспериментальных группах, мкм
Группа Длина ядра Ширина ядра Площадь ядра Длина клетки Ширина клетки Площадь клетки
Контроль 5,11±0,46 4,46±0,46 16,29±2,58 11,55±1,5 9,05±1,46 69,47±14,74
КМ2 5,41±0,6 4,69±0,56 18,62±3,17 12,22±1,37 10,24±1,31 85,05±15,24
БР 5,15±0,68 4,49±0,44 16,85±3,18 11,6±1,55 9,32±1,06 73,3±12,29
ОБР 5,49±0,61 4,73±0,53 18,59±3,51 12,18±1,31 9,76±1,04 78,95±14,61
Гистологическое строение кишечника (рис. 4а и б), при световой микроскопии в экспериментальных группах выявило ряд отличий от контроля.
Рис. 4. Гистологическое строение кишечника у крыс при введении УНВ разных типов. а) Кишечник крысы в группе КМ2. Отмечается множество вакуолей.
Окраска гематоксилин-эозином. б) Кишечник крысы в группе 56-ОБР. Отмечается множество вакуолей.
Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение а) ><400, б) х200
В слизистой оболочке в группах КМ2, 56-БР и 56-ОБР наблюдается выраженное слизеобразова-ние. В эпителии множество бокаловидных клеток с вакуолями, заполненными слизью (рис. 4а и 4б). Сосуды полнокровны.
В группе 56-БР и 56-ОБР в подслизистом слое отмечается гипертрофия лимфоидных фолликул. Других патологических изменений не обнаружено.
Морфометрические параметры эпителиоцитов кишечника в контрольной группе и при введении приводится в табл. 4.
Таблица 4
Морфометрические параметры эпителиоцитов кишечника в экспериментальных группах
животных, мкм
группа длина ядра ширина ядра площадь ядра длина клетки ширина клетки площадь клетки
Контроль 4,96±0,66 3,81±0,65 12,84±2,86 14,34±2,97 8,64±2,28 60,67±14,7
КМ2 5,63±1,07 4,12±0,85 16±3,7 16,5±2,1 7,25±1,52 76,71±11,13
БР 6,2±0,74 4,5±0,77 18,54±3,34 17,68±1,74 6,79±1,08 85,32±10,81
ОБР 5,36±0,74 4,1±0,7 15,15±2,56 14,7±1,6 5,77±0,57 68,16±5,56
Ткани печени во всех экспериментальных группах не отличается от контрольной. Не было выявлено никаких патологических признаков: дистрофии, некроза, отека, воспаления. Можно лишь отметить, что при введении УНВ наблюдается более выраженное полнокровие сосудов и инфильтрацию эритроцитами (рис. 5).
Рис. 5. Гистологическое строение печени у крыс в группе КМ2. Отмечается полнокровие и инфильтрация эритроцитами. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение ><200
Морфометрические параметры гепатоцитов в контрольной и экспериментальной группе «Куликовское» приводится в табл. 5.
Таблица 5
Морфометрические параметры гепатоцитов в экспериментальных группах животных, мкм
группа длина ядра ширина ядра площадь ядра длина клетки ширина клетки площадь клетки
Контроль 6,23±0,56 5,67±0,52 26,73±4,07 15,9±1,47 13,3±1,73 150,56±22,1
КМ2 6,59±0,57 5,89±0,4 29,13±3,78 15,32±1,05 13,29±1,02 145,59±12,9
БР 6,61±0,63 5,85±0,72 28,89±5,48 15,75±1,3 13,48±2,13 148,68±17,71
ОБР 6,45±0,39 5,83±0,4 28,5±3,4 15,1±1,36 12,84±1,36 139,74±21,86
Как можно видеть по нашим результатам разные виды УНВ оказывают выраженного влияния на гистологическое строение органов пищеварения при пероральном введении.
Так, подслизистая и серозная оболочка желудка, гладкая мускулатура во всех группах без патологических изменений. Но в слизистой оболочке всех экспериментальных групп (КМ2, 56-БР и 56-ОБР) наблюдается утолщение по отношению к группе «Контроль».
В кишечнике крыс всех экспериментальных групп наблюдается множество бокаловидных клеток с вакуолями, заполненными слизью (рис. 3а и 3б), и как следствие, выраженное слизеобразование, сосуды полнокровны, что является следствием механического раздражения нановолокнами.
Ткань печени отреагировала менее выражено - можно лишь отметить, что при введении УНВ наблюдается более выраженное полнокровие сосудов и инфильтрацию эритроцитами.
Есть также реакция иммунной системы - при введении УНВ 56-БР и 56-ОБР в подслизистом слое отмечается гипертрофия лимфоидных фолликул.
Выраженное токсическое свойство, связанное по-видимому, как и другие обнаруженные эффекты, с механическим повреждением ткани и заключается в дистрофических изменениях и некрозах слизистой в группе КМ2. Возможно это связано с меньшим размером УНВ, возникающем при размоле и высокой площадью поверхности агрегатов (до 8983,11 см2/см3).
В целом, наши результаты созвучны данным других исследователей. В работе [12, 13] изучали зависимость токсичности нанотрубок и нановолокон от соотношения длина/диаметр и наличия различных функциональных групп на их поверхности. Токсичность многослойных нанотрубок оказалась ниже токсичности нановолокон, причем токсичность нанотрубок возрастает с увеличением отношения длина/диаметр.
Несомненно, что данная работе требует дальнейшего изучения ввиду высокой важности технологического процесса получения перспективных наноматериалов.
Работа выполнена при поддержке Гранта Президента РФ для молодых докторов наук
(МД-7737.2016.5).
Литература
1. Андреев Г.Б., Минашкин В.М., Невский И.А., Путилов А.В. Материалы, производимые по на-нотехнологиям: потенциальный риск при получении и использовании // Российский химический журнал. 2008. Т. 52, № 5. С. 32-38.
2. Дриаева М.Д., Сыпченко А.Я., Туктамышев И.Ш., Удина Н.В., Хадарцев А.А. Изучение влияния свойств шунгита на микроорганизмы // Вестник новых медицинских технологий. 2003. №4. С. 60-61.
3. Кричевский Г.Е. Нано-, био-, химические технологии и производство нового поколения волокон, текстиля и одежды. М.: «Известия», 2011. 528 с.
4. Митрофанов И.В., Туктамышев И.Ш. Шунгиты в стоматологии // Вестник новых медицинских технологий. 2003. №4. С. 55.
5. Морозов В.Н., Натарова Э.В., Платонов В.В., Руднева Н.А., Туктамышев И.И., Туктамышев И.Ш., Яшин А. А. Возможности шунгита в кондиционировании питьевой воды и лечении заболеваний кожи // Вестник новых медицинских технологий. 2004. №4. С. 71-73.
6. Хадарцев А.А., Туктамышев И.И., Туктамышев И.Ш. Шунгиты в медицинских технологиях // Вестник новых медицинских технологий. 2002. №2. С. 83.
7. Delorme M.P., Muro Y., Arai T., Banas D.A., Frame S.R., Reed K.L., Warheit D.B Ninety-day inhalation toxicity study with a vapor grown carbon nanofiber in rats // Toxicol Sci. 2012. Vol. 128, №2. P. 449-460.
8. Feng L., Xie N., Zhong J. Carbon Nanofibers and Their Composites: A Review of Synthesizing, Properties and Applications // Materials. 2014. №7. P. 3919-3945.
9. He C., Nie W., Feng W. Engineering of biomimetic nanofibrous matrices for drug delivery and tissue engineering // Journal of Materials Chemistry B. 2014. Vol. 2, № 45. P. 7828-7848.
10. Horváth L., Magrez A., Schwaller B., Forró L. Toxicity Study of Nanofibers // Supramolecular Structure and Function. 2011. №10. P. 133-149.
11. Huang X. Fabrication and properties of carbon fibers // Materials. 2009. №2. P. 2369-2403.
12. Magrez A., Kasas S., Salicio V., Pasquier N., Seo J.W., Celio M., Catsicas S., Schwaller B., Forro L. Cellular toxicity of carbon-based nanomaterials // Nano Lett. 2006. № 6. P. 1121-1125.
13. Murray A.R., Kisin E.R., Tkach A.V., Yanamala N., Mercer R., Young S.H., Fadeel B., Kagan V.E., Shvedova A.A. Factoring-in agglomeration of carbon nanotubes and nanofibers for better prediction of their toxicity versus asbestos // Part. Fibre. Toxicol. 2012. №9. P. 10.
References
1. Andreev GB, Minashkin VM, Nevskiy IA, Putilov AV. Materialy, proizvodimye po nanotekhnolo-giyam: potentsial'nyy risk pri poluchenii i ispol'zovanii [The materials produced by nanotechnology: a potential risk in obtaining and using]. Rossiyskiy khimicheskiy zhurnal. 2008;52(5):32-8. Russian.
2. Driaeva MD, Sypchenko AY, Tuktamyshev ISh, Udina NV, Khadartsev AA. Izuchenie vliyaniya svoystv shungita na mikroorganizmy [The study of the properties of shungite effect on microorganisms]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2003;4:60-1. Russian.
3. Krichevskiy GE. Nano-, bio-, khimicheskie tekhnologii i proizvodstvo novogo pokoleniya volokon, tekstilya i odezhdy [Nano-, bio- and chemical technologies and production of a new generation of fibers, textiles and clothing.]. Moscow: «Izvestiya»; 2011. Russian.
4. Mitrofanov IV, Tuktamyshev IS. Shungity v stomatologii [Shungites in dentistry]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2003;4:55. Russian.
5. Morozov VN, Natarova EV, Platonov VV, Rudneva NA, Tuktamyshev II, Tuktamyshev IS, Yashin AA. Vozmozhnosti shungita v konditsionirovanii pit'evoy vody i lechenii zabolevaniy kozhi [Features schungite in air-conditioning drinking water and the treatment of skin diseases]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2004;4:71-3. Russian.
6. Khadartsev AA, Tuktamyshev II, Tuktamyshev IS. Shungity v meditsinskikh tekhnologiyakh [Shungites in medical technology]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2002;2:83. Russian.
7. Delorme MP, Muro Y, Arai T, Banas DA, Frame SR, Reed KL, Warheit DB Ninety-day inhalation toxicity study with a vapor grown carbon nanofiber in rats. Toxicol Sci. 2012; 128(2):449-60.
8. Feng L, Xie N, Zhong J. Carbon Nanofibers and Their Composites: A Review of Synthesizing, Properties and Applications. Materials. 2014;7:3919-45.
9. He C, Nie W, Feng W. Engineering of biomimetic nanofibrous matrices for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 2014;2(45):7828-48.
10. Horváth L, Magrez A, Schwaller B, Forró L. Toxicity Study of Nanofibers. Supramolecular Structure and Function. 2011;10:133-49.
11. Huang X. Fabrication and properties of carbon fibers. Materials. 2009;2:2369-403.
12. Magrez A, Kasas S, Salicio V, Pasquier N, Seo JW, Celio M, Catsicas S, Schwaller B, Forro L. Cellular toxicity of carbon-based nanomaterials. Nano Lett. 2006;6:1121-5.
13. Murray AR, Kisin ER, Tkach AV, Yanamala N, Mercer R, Young SH, Fadeel B, Kagan VE, Shvedo-va AA. Factoring-in agglomeration of carbon nanotubes and nanofibers for better prediction of their toxicity versus asbestos. Part. Fibre. Toxicol. 2012;9:10.
Библиографическая ссылка:
Чайка В.В., Сергиевич А.А., Саяпина Н.В., Баталова Т.А., Мишаков И.В., Ведягин А.А., Голохваст К.С. Морфологическая оценка влияния трёх типов углеродных нановолокон на органы пищеварения крыс линии вистар при перо-ральном введении // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание. 2016. №4. Публикация 2-1. URL: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2016-4/2-1.pdf (дата обращения: 03.10.2016). DOI: 10.12737/21853.
