CC BY
12
УДК 591.463.2:[577.114/.115:579.842.11]:599.323.4
МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СПЕРМАТОЦИТОВ СЕМЕННИКОВ КРЫС В РАННИЕ СРОКИ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ESCHERICHIA COLI © Поплавская Е.А., Поплавский Д.Ю.
Гродненский государственный медицинский университет, Республика Беларусь, 230009, Гродно, ул. Горького, 80
Резюме
Цель. Изучение влияния бактериального липополисахарида Escherichia coli, введенного самцам крыс, на структуру и функции сперматоцитов семенных канальцев семенников в ранние сроки после воздействия.
Методика. Самцам крыс вводили ЛПС Е. ooli в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно. Готовили парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином и галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону. На криостатных срезах проводили гистохимические реакции по выявлению активности ферментов ЛДГ; НАДН2ДГ, Г6ФДГ и НАДФН2ДГ. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование, морфометрию и цитофотометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения ImageWarp (Bit Flow, США). Оценку достоверности изменения численных значений проводили с помощью непараметрической статистики с применением компьютерной программы Statistica 6.0 для Windows.
Результаты. В результате исследования установлено, что при введении ЛПС Е. coli уменьшается количество сперматоцитов в канальцах семенников - на 26,54% (p<0,05). В цитоплазме первичных сперматоцитов в ранние сроки после воздействия ЛПС Е. aoli снижается количество РНП на 33,33% (p<0,05). Происходит изменение уровней активности ключевых ферментов энергетического обмена в цитоплазме клеток: увеличивается уровень активности НАДН2ДГ - на 27,90% (p<0,05) и уровень активности ЛДГ - на 20% (p<0,05).
Заключение. Сделан вывод, что введение бактериального ЛПС Е. aoli вызывает структурные и функциональные изменения в клетках сперматогенного эпителия извитых семенных канальцев семенников крыс, в частности, в сперматоцитах, заключающиеся в снижении их количества, а также изменении уровня активности ключевых ферментов энергетического обмена и содержания РНП в их цитоплазме, что свидетельствует о замедлении их пролиферации и дифференцировки, приводящей к нарушению функций клеток, что, в конечном итоге, может привести к нарушению сперматогенеза и функции органа в целом.
Ключевые слова: семенник, бактериальный липополисахарид, сперматоциты, сперматогенез
MORPHO-FUNCTIONAL FEATURES OF SPERMATOCYTES IN TESTIS OF RATS IN THE EARLY STAGES AFTER THE IMPACT OF LIPOPOLYSACCHARIDE ESCHERICHIA COLI Poplavskaja E.A., Poplavskij D.Ju.
Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230009, Grodno, Republic of Belarus
Abstract
Objective. Study of the influence of the bacterial lipopolysaccharide Escherichia coli, administered to male rats, on the structure and functioning of primary spermatocytes of the seminiferous tubules of the testis in the early stages after exposure.
Methods. Male rats were injected LPS E. coli at a dose of 50 ^g/kg of mass intraperitoneally, once. Paraffin sections were prepared, stained with hematoxylin and eosin and gallocyanin-chromic alum according to Einarsson. The histochemical reactions were carried out on the cryostat sections in order to reveal the activity of LDH enzymes; NADN2DG, G6FDG and NADPH2DG. Studies of histological specimens, their microphotography, morphometry and cytophotometry were carried out at different magnifications of the Axioskop 2 plus microscope (Zeiss, Germany), the Leica DFC 320 digital camera (Leica Microsystems GmbH, Germany) and the ImageWarp image analysis software (Bit Flow, USA). Evaluation of the reliability of changes in numerical values was carried out using nonparametric statistics using the computer program Statistica 6.0 for Windows.
Results. As the result of the study, it has been found that when E. coli LPS is introduced, the number of spermatocytes in the testicle canals decreases by 26.54% (p<0.05). In the cytoplasm of primary spermatocytes, the amount of RNP decreases by 33.33% (p <0.05) in the early periods after the effect of LPS E. coli. There is a change in the activity levels of key enzymes of energy metabolism in the cytoplasm of cells: the level of activity of NADH2DG increases by 27.90% (p<0.05) and the LDH activity level increases by 20% (p<0.05).
Conclusion. It has been concluded that the injection of bacterial LPS of E. coli causes structural and functional changes in the cells of the spermatogenic epithelium of convoluted seminiferous tubules of testicles of rats, in particular, in spermatocytes, which is reflected in the reduction of their quantity, changes in the level of activity of key enzymes of energy metabolism and the content of RNP in their cytoplasm , which indicates a slowing of their proliferation and differentiation, leading to a disruption of the functions of cells, which, in the end analysis, can lead to a violation of spermatogenesis and the function of the organ on the whole.
Keywords: testis, bacterial lipopolysaccharide, spermatocytes, spermatogenesis
Введение
Сперматогенез является одним из наиболее динамичных процессов в организме человека и животных. Нормальное его протекание требует скоординированного влияния многочисленных факторов - генетических, клеточных, гормональных и других. Подобная сложность делает данный процесс «легкой мишенью» для всякого рода негативных воздействий, в том числе и липополисахаридов ггомотрицательных микроорганизмов Г2, 101. Защита и сохранность половых клеток от негативных влияний различных факторов в силу уникальной роли половых клеток в онтогенезе является важной проблемой исследователей.
В многочисленных работах, как клинических, так и экспериментальных, объясняются различные нарушения дифференцировки и созревания полового эпителия, повышенной чувствительностью сперматогенного эпителия к разного рода агентам. Из химических факторов особое внимание уделяется разнообразным соединениям, которые имитируют эффекты эстрогенов или являются лигандами рецепторов андрогенов. Они способны вмешиваться в естественные пути эндокринной регуляции процессов гаметогенеза и стероидогенеза. Большую опасность представляют и разнообразные искусственно созданные химические соединения - компоненты топлива, соединения, образующиеся при сгорании нефтепродуктов, обладающие эстрогенной и антиандрогенной активностью [3, 4, 9].
На разных стадиях созревания сперматозоиды имеют неодинаковую чувствительность к воздействующему агенту. Например, бисульфан и прокарбазин влияют на сперматогонии, 2-метоксиэтанол - на сперматоциты, метила хлорид - на сперматиды, 1,3-динитробензол и 2,5-гексанедион - на сустентоциты. Ткань семенников весьма чувствительна к действию ряда многих химиотерапевтических препаратов, применяющихся при лечении рака: типа хлорамбуцина, антиметаболиты - метотрексат, антибиотик доксорубицин, алкилирующие агенты -циклофосфамид, - оказывающие антимейотическое действие на сперматогонии. При этом наблюдается дегенерация мейотических сперматоцитов, задержка развития сперматид, приводящая к появлению аномальных форм клеток и задержке образования сперматозоидов [6].
Бактериальные липополисахариды (ЛПС) являются постоянным структурным компонентом клеточных мембран грамотрицательных бактерий. Интерес к ним обусловлен не только их уникальной структурой и весьма широким разнообразием вызываемых эффектов, но и тем, что организм человека постоянно контактирует с достаточно большим количеством этого токсина, что обеспечивает поддержание гомеостаза, адаптацию организма к стрессовым воздействиям, способствуют предотвращению проникновения потенциально патогенной флоры в кровоток, стимулируют иммунитет и неспецифическую резистентность организма, при этом, обладая выраженным токсическим эффектом [1].
На наш взгляд, наиболее подвержены воздействиям различных факторов клетки сперматогенного эпителия в профазе первого мейотического деления из-за большой продолжительности фазы и уникальности процессов, происходящих при этом: коньюгации и кроссинговера гомологичных хромосом. В связи с вышеизложенным, представляет несомненный интерес исследование влияния бактериальных липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов на клетки сперматогенного эпителия семенных канальцев семенников и, в частности, на первичные сперматоциты. Поэтому целью исследования явилось изучение влияния бактериального липополисахарида Escherichia coli (Е. coli), введенного самцам крыс, на структуру и функции
первичных сперматоцитов семенных канальцев семенников крыс в ранние сроки после воздействия.
Методика
Объектом исследования являлись половозрелые самцы беспородных белых крыс. В качестве агента воздействия использовался бактериальный липополисахарид Escherichia coli серотип 0111:B4, производство фирмы «Sigma», США. В эксперименте было использовано 12 самцов беспородных белых крыс. Масса самцов составляла 200±30 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением требований, изложенных в Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными. Из самцов были сформированы опытная и контрольная группы. Самцам опытной группы вводили ЛПС Е. coli в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно. Самцам контрольной группы - физиологический раствор в эквиобъёмном количестве. На 3-и сут. после воздействия ЛПС, самцов экспериментальных групп усыпляли парами эфира с последующей декапитацией. Животных вскрывали и выделяли семенники.
Одну часть семенника фиксировали в жидкости Карнуа, проводили через спирты возрастающей концентрации, смесь спирта и ксилола, чистый ксилол и заключали в парафин. Готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону на выявление рибонуклеопротеидов (РНП). На окрашенных гематоксилином и эозином гистологических препаратах определяли среднее количество сперматоцитов на срезе извитого канальца семенника (на 20-ти срезах канальцев). На окрашенных галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону препаратах - относительное содержание РНП в цитоплазме клеток.
Вторую часть семенника, сразу после взятия, замораживали в жидком азоте. Из замороженного кусочка семенника готовили криостатные срезы толщиной 10 мкм в микротоме-криостате Microm HM 525 при температуре минус 25°С. На криостатных срезах проводили гистохимические реакции по выявлению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - маркера анаэробного гликолиза; НАДН2-дегидрогеназы (НАДН2ДГ) - показателя активности митохондриальных процессов; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (ГбФДГ) - маркёра пентозофосфатного шунта и НАДФН2-дегидрогеназы (НАДФН2ДГ) - показателя обеспеченности синтетических процессов [5]. Все гистохимические исследования сопровождались безсубстратными контролями.
Количественную оценку активности НАДН2-ДГ, НАДФН2-ДГ, ЛДГ, Г-6-Ф-ДГ и относительного содержания РНП проводили, определяя оптическую плотность полученного осадка хромогена в цитоплазме первичных сперматоцитов на максимуме поглощения окрашенных продуктов реакций. Активность ферментов и содержание вещества выражали в единицах оптической плотности. В каждой экспериментальной группе оценивали не менее 100 клеток. Изучение гистологических препаратов, их микрофотографирование, морфометрию и цитофотометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC 320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения ImageWarp (Bit Flow, США).
Оценку достоверности изменения численных значений проводили с помощью непараметрической статистики с применением компьютерной программы Statistica 6.0 для Windows. Сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test). Различие между показателями считали статистически достоверными, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (p<0,05).
Результаты исследования
Сперматоциты, располагающиеся в боковых впячиваниях сустентоцитов - крупные, округлой или овальной формы, несколько удалены от базальной мембраны извитого канальца, образуя несколько ярусов. В их ядрах хорошо выражен рисунок гетерохроматина. Анализ количества сперматоцитов на срезе канальца показал, что у самцов, получавших ЛПС E. coli, на 3-и сут. после воздействия происходит статистически достоверное - на 26,54% (Z=2,40, p=0,01) - снижение среднего количества сперматоцитов по сравнению с таковым в контроле (табл., рис. 1).
Таблица. Количество сперматоцитов в канальце, показатели РНП и уровня активности ферментов в цитоплазме первичных сперматоцитов у самцов крыс контрольной и опытной групп (Ме (ЩЯ))
Исследуемые показатели (ед. опт. пл.) Контроль Опыт
Количество первичных сперматоцитов в канальце 41,63 (40,74; 42,21) 30,58* (29,02; 32,64)
Количество РНП в цитоплазме первичных сперматоцитов 0,222 (0,180; 0,281) 0,148* (0,135; 0,163)
Активность НАДН2-ДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов 0,172 (0,141; 0,183) 0,220 * (0,217; 0,243)
Активность НАДФН2 ДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов 0,154 (0,105; 0,212) 0,145 (0,138; 0,181)
Активность ЛДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов 0,160 (0,131; 0,174) 0,192* (0,190; 0,198)
Активность Г-6-Ф-ДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов 0,055 (0,034; 0,066) 0,066 (0,060; 0,070)
Примечание: * - p<0,05 при сравнении с контролем
Рис. 1. Количество сперматоцитов в канальце у контрольных крыс (А) и у крыс на 3-и сут. после однократного внутрибрюшинного введения липополисахарида E. coli (Б). Снижение количества сперматоцитов в канальце у опытных крыс. Окраска гематоксилином и эозином. Цифровая микрофотография. Ув. ><20
Исследования показали, что при введении ЛПС E. coli самцам крыс происходит как изменение относительного количества РНП, так и изменение уровня активности исследуемых ферментов в цитоплазме первичных сперматоцитов по сравнению с контрольными показателями.
На 3-и сут. после воздействия ЛПС наблюдается достоверное снижение - на 33,33% (Z=2,30, p=0,02) - относительного количества РНП в цитоплазме первичных сперматоцитов по сравнению с таковым в контроле (табл., рис. 2).
Рис. 2. Количество РНП в цитоплазме первичных сперматоцитов семенных канальцев самцов крыс в контрольной группе (А) и на 3-и сутки после однократного внутрибрюшинного введения липополисахарида E. coli (Б). Уменьшение количества рибонуклеопротеидов у животных опытной группы. Окраска по Эйнарсону. Цифровая микрофотография. Ув. ><40
В результате гистохимических исследований установлено, что на 3-и сут. после воздействия ЛПС E. coli происходит статистически достоверное повышение - на 27,90 % (Z=-2,08, p=0,00) - уровня активности НАДН2-ДГ (табл., рис. 3).
Рис. 3. Активность НАДН2-ДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов самцов крыс в контрольной группе (А) и на 3-и сут. после однократного внутрибрюшинного введения липополисахарида E. coli (Б). Повышение уровня активности фермента у крыс в опытной группе. Тетразолиевый метод по Lojda. Цифровая микрофотография. Ув. ><40
Уровень активности ЛДГ на 3-и сут. после введения ЛПС E. coli в цитоплазме первичных сперматоцитов у опытных животных также был статистически достоверно повышен на 20% (Z=-2,73, p=0,00) по сравнению с таковым в контроле (табл., рис. 4). Уровни активности НАДФН2-ДГ и Г-6-Ф-ДГ практически не отличается от контрольных показателей.
Рис. 4. Активность ЛДГ в цитоплазме первичных сперматоцитов у самцов крыс в контрольной группе (А) и на 3-и сут. после однократного внутрибрюшинного введения ЛПС E. coli (Б). Повышение уровня активности фермента у крыс в опытной группе. Тетразолиевый метод по Lojda. Цифровая микрофотография. Ув. ><40
Обсуждение результатов исследования
Введение бактериального ЛПС Е. coli в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно самцам крыс вызывает структурные изменения в извитых семенных канальцах семенников крыс, которые выражаются в уменьшении количества сперматоцитов. Кроме того, приводит к перестройке метаболизма клеток сперматогенного эпителия семенников, в частности первичных сперматоцитов. В цитоплазме клеток в ранние сроки после воздействия ЛПС (3-и сут.) снижается количество РНП на 33,33% (p<0,05), что свидетельствует об угнетении белкового синтеза в исследуемых клетках.
Происходит изменение уровней активности ключевых ферментов энергетического обмена в цитоплазме первичных сперматоцитов. На 3-и сут. после воздействия ЛПС наблюдается снижение активности НАДФН2ДГ, что свидетельствует об уменьшении выработки НАДФН2,
который используется для восстановления активности антиоксидантов (глутатиона, аскорбиновой кислоты и витамина Е) [7]. При этом происходит статистически достоверное увеличение активности НАДН2-ДГ - на 27,90% (р<0,05) и уровня активности ЛДГ - на 20% (р<0,05). Увеличение активности НАДН2-ДГ - первого фермента электрон-транспортной цепи -свидетельствует об усилении окисления в дыхательной цепи митохондрий НАД-зависимых субстратов с получением АТФ и может происходить в результате активации гликолиза, что подтверждается и увеличением активности ЛДГ.
Изменение уровня активности исследуемых ферментов может быть связано напрямую или косвенно с процессами окислительного стресса, который вызывается введением липополисахарида [8]. Всё вышесказанное свидетельствует о нарушении структуры и функций клеток-предшественников сперматозоидов и может привести к нарушению сперматогенеза и функции органа в целом.
Выводы
1. Введение бактериального ЛПС Е. coli в дозе 50 мкг/кг массы внутрибрюшинно, однократно самцам крыс вызывает структурные изменения в извитых семенных канальцах семенников крыс, которые выражаются в уменьшении количества сперматоцитов.
2. Введение бактериального ЛПС Е. coli приводит к перестройке метаболизма клеток сперматогенного эпителия семенников, в частности первичных сперматоцитов, заключающиеся в изменении уровня активности ключевых ферментов энергетического обмена и содержания РНП в их цитоплазме.
Литература (references)
1. Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В., Веткова Л.Г. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004. - №3. - С. 98-105. [Bondarenko v.m., Rjabichenko E.V., Vetkova L.G. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. Journal Microbiology, epidemiology and immunobiology. - 2004. - N3. - P. 98-105. (in Russian)]
2. Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы) // Проблемы репродукции. -2000. - №1. - С. 6-13. [Bykov B.L. Problemy reprodukcii. Reproduction problems. - 2000. - N1. - P. 6-13. (in Russian)]
3. Дуденкова Н.А., Шубина О.С. Изменения морфофункционального состояния и продуктивности семенных желез белых крыс при воздействии ацетата свинца // Фундаментальные исследования. -2013. - №10(Ч.6). - С. 1253-1259. [Dudenkova N.A., Shubina O.S. Fundamental'nye issledovanija. Fundamental research. - 2013. - N10(P.6). - P. 1253-1259. (in Russian)]
4. Карташев А.Г. Влияние хронических факторов в постнатальном онтогенезе животных - Томск : В-Спектр, 2010. - 116 с. [Kartashev A.G. Vlijanie hronicheskih faktorov v postnatal'nom ontogeneze zhivotnyh. Influence of chronic factors in postnatal ontogenesis of animals. - Tomsk: V-Spectrum, 2010. - 116 p. (in Russian)]
5. Ковальский Г.Б., Журавлева Т.В., Прочуханова Р.А. Количественная гистохимия дегидрогеназ. // Введение в количественную гистохимию ферментов / Под ред. Т.В. Журавлевой, Р.А. Прочухановой. -М., 1978. - 240 с. [Koval'skij G.B., Zhuravleva T.V., Prochuhanova R.A. Kolichestvennaja gistohimija degidrogenaz. // Vvedenie v kolichestvennuju gistohimiju fermentov / Pod red. T.V. Zhuravlevoj, R.A. Prochuhanovoj. Quantitative histochemistry of dehydrogenases / Introduction to quantitative histochemistry of enzymes. - Moscow, 1978. - 240 p. (in Russian)]
6. Курляндский Б.А., Филова В.А. Общая токсикология / Под общ. ред. Б.А. Курляндского. - М.: Медицина, 2002. - 608 с. [Kurljandskij B.A., Filova V.A. Obshhaja toksikologija / Pod obshh. red. B.A. Kurljandskogo. General toxicology. - Moscow: Medicine, 2002. - 608 p. (in Russian)]
7. Оковитый С.В. Клиническая фармакология антиоксидантов. «ФАРМиндекс-Практик». - 2003. - №5. - С. 85 - 111. [Okovityj S.V. Klinicheskaja farmakologija antioksidantov. Clinical pharmacology of antioxidants. "PHARMINDEX-Practitioner". - 2003. - N5. - P. 85-111. (in Russian)]
8. Aly H.A., El-Beshbishy A., Banjar Z.M. Mitochondrial dysfunction induced impairment of spermatogenesis in LPS-treated rats: modulatory role of lycopene // European Journal of Pharmacology. - 2012. - V.677, N1-3. - P. 31-38.
9. Sheiner E.K., Sheiner E, Hammel R. D. et al. Effect of occupational exposures on male fertility: literature review // Industrial Health. - 2003. - V.41, N2. - P. 55-62.
10. Sofikitis N., Giotitsas N., Tsounapi P. et al. Hormonal regulation of spermatogenesis and spermiogenesis // Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. - 2008. - V. 109, N3/5. - P. 323-330.
Информация об авторах
Поплавская Елена Александровна - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Гродненского государственного медицинского университета. Гродно, Республика Беларусь. E-mail: Len.poplavska@mail.ru
Поплавский Денис Юрьевич - студент лечебного факультета Гродненского государственного медицинского университета, Гродно, Республика Беларусь. E-mail: denispoplavski@gmail.com
