CC BY
38
УДК 541.183.022: 541.64
МОНОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СЛОИ КОЛЛАГЕНА
А. С. Фадеев, С. М. Левачев, В. Н. Измайлова
(кафедра коллоидной химии)
Изучены мономолекулярные слои коллагена, выделенного из склеры глаза свиньи, на границе вода - воздух при рН от 3.0 до 12.0. Показано, что изотермы двумерного давления коллагена характеризуются областями жидкорастянутого и жидкоконденсированного состояния с ярко выраженным плато, отражающим формирование фибрилл из отдельных молекул коллагена в горизонтальной ориентации. Наибольшее двумерное давление коллапса (60 мН/м) наблюдается в изоэлектрическом состоянии коллагена и уменьшается при переходе в кислую и щелочную области вследствие электростатического отталкивания между макромолекулами. Обнаружен гистерезис изотерм двумерного давления как в жидкорастянутом, так и в жидкоконденсированном состоянии, что связано с фибриллообразованием коллагена. Рассчитаны модули эластичности монослоев коллагена при разных рН. Наибольшее значение модуля эластичности (е0 = 67 мН/м) обнаружили монослои при изоэлектрическом состоянии коллагена. Сделан вывод, что на поверхности воды формируются самоорганизующиеся двумерные структуры, образованные молекулами и фибриллами коллагена.
Изучение мономолекулярных слоев белков на границе вода-воздух представляет интерес в связи с моделированием биологических мембран. Подавляющее большинство работ в этой области посвящено исследованиям глобулярных белков [1]. Белкам других типов, например фибриллярным, уделялось значительно меньше внимания.
Белки образуют устойчивые монослои, обратимо сжимаемые до определенного двумерного давления, величина которого зависит от свойств белка. Изотермы (двумерное давление п - площадь А) схожи для большинства белков. До сих пор не разработана приемлемая модель строения белкового монослоя. Обычно из экспериментальных данных путем экстраполяции изотермы на нулевое давление в ее восходящей части определяют характеристическую площадь на молекулу (£0). Эту величину можно сравнить с размерами молекулы белка и сделать некоторые выводы о степени конденсированности монослоя [2]. Несовпадение данных обычно связывают с процессами десорбции белка из монослоя в объемную фазу, изменением конформации или ассоциации и др.
Коллаген - фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани животных и обеспечивающий ее прочность [3]. Коллаген присутствует во всех тканях глаза человека и животных [4]. Это наиболее распространенный животный белок, составляющий у млекопитающих около 30% от всей массы белков. Молекула коллагена состоит из трех а-цепей (каждая содержит более 1000 аминокислотных остатков), скрученных в одну регулярную спираль, стабилизированную водородными связями между боковыми группами составляющих ее аминокислот. Молекула представляет собой жесткий стержень длиной 300 нм и диаметром 1 .5 нм. Различают несколько типов
коллагена, отличающихся аминокислотным составом а-це-пей [3].
Свойства монослоев коллагена на поверхности водных растворов описаны лишь в немногих работах [5-9], значительно лучше изучена желатина [1]. В ранних работах [58], когда свойства коллагена были еще недостаточно изучены, исследователи нередко называли коллагеном продукт его денатурации - желатину. Из известных нам работ только одна [9] посвящена изучению свойств натив-ного коллагена. Показано, что монослои коллагена и желатины наименее расширены на подложках, рН которых близки к изоэлектрической точке (ИЭТ) белков (~5.8 для коллагена и ~4.8 для желатины); при этом смещение рН в щелочную область оказывает на монослои коллагена расширяющее действие, значительно более сильное, чем на монослои желатины. Исследовано влияние трехвалентных ионов металлов ^е3+, А13+, Сг3+) на поведение белков в монослоях. Установлено, что введение в водную подлож-
т- 3+
ку ионов Ре оказывает на монослои коллагена и желатины чрезвычайно сильное конденсирующее и стабилизирующее действие. Так, на подложке с рН 3.0, содержащей 10-3 М ионов Ре3+, поверхностное давление в монослое коллагена, сжатом до ~0.5 м2/мг, достигает ~60 мН/м. Причина этого эффекта, по мнению авторов, в образовании на поверхности раздела вода/воздух двумерных комп -
3+
лексов макромолекул с ионами Ре по механизму координации связи ионов металла =МН- и =СО- группами молекул белка. В это же время ионы Сг3+ оказывают на монослои белков существенно меньшее действие, а ионы А1 эффективны только в случае желатины.
Данная работа проведена с фибриллярным белком коллагеном, поверхностные свойства которого мало изу-
чены. Целью работы было исследование мономолекулярных слоев коллагена на водной подложке при различных pH и изучение гистерезиса изотерм сжатия-растяжения (п-А).
Материалы и методы
Источником коллагена для исследований служила склера глаза свиньи в связи с относительно большим содержанием коллагена и легкостью его извлечения [10-11]. В склере в наибольшем количестве содержится коллаген типа I [11-12], присутствуют также типы III (уменьшается с возрастом) и V. Склера содержит значительные количества полисахаридов и протеогликанов [13-15], которые легко удаляются при обработке щелочью. Предварительное замораживание-размораживание ткани склеры нарушает пространственное расположение коллагеновых фибрилл и связанных с ними гликозаминогликанов [16-17], что облегчает щелочную экстракцию последних и уменьшает время ее проведения. После нейтрализации щелочи практически чистый коллаген растворяют в 0.05-0.30 M CH3COOH. Молекулярная масса определена методом SDS-PAGE и составляет 285 кДа.
При выделении коллагена и приготовлении растворов были использованы следующие реактивы марки «Реа-хим»: NaOH «ч.д.а.», Na2SO4 «ч.д.а.», H3BO3 «х.ч.», BaCl2 «ч.д.а.», CH3COOH «х.ч.», HCl «х.ч.», бидистиллированная H2O. 3
Для формирования и исследования монослоев в работе использовались весы Ленгмюра кругового типа. Прибор позволяет регистрировать изменение поверхностного натяжения в процессе изменения площади пленки поверхностно-активного вещества, нанесённого на поверхность раздела жидкость - воздух.
Прибор состоит из трех блоков: непосредственно измерительной ячейки, блока индикации и блока управления. Измерительная ячейка (рис. 1) представлена круглой ванной (а) из фторопласта. Внутри ванны имеются две перегородки, образующие вспомогательный отсек (b), предназначенный для приема избытка жидкости, сбрасываемой в него при движении барьера (с). Барьер также выполнен из фторопласта. Он вставляется в специальный
Рис. 1. Общий вид ванны Ленгмюра кругового типа (пояснения в тексте)
держатель (ё) с центральной осью, проходящей через штифт, и закрепляется винтом (е). Центральная ось вращается электроприводом (при этом барьер совершает вращательное движение по поверхности ванны), она соединена с резистором, служащим для измерения и преобразования площади пленки в электрический сигнал.
Двумерное давление измеряли с помощью пластинки Вильгельми. Была использована рифленая пластинка (/) из вольфрама с периметром 10 см, подвешенная на держателе механотрона (д), преобразующего механическое усилие в электрический сигнал. Измерительную пластинку и механотрон одновременно перемещали в вертикальном направлении с помощью подъемного механизма, микрометрический винт которого вынесен на переднюю панель прибора.
Блок регистрации представляет собой двухкоординат-ный самописец: на оси X регистрируется изменение площади пленки, на оси У - двумерное давление п, равное разности между поверхностным натяжением подложки о0 и поверхностным натяжением с нанесенным веществом оГ (п=о0-оГ). Калибрование показаний самописца производится путем подвешивания на держателе механотрона груза известной массы (500 мг) и записи показаний самописца (подвешенный груз соответствует давлению 50 мН/м).
Блок управления служит для проведения экспериментов по определению изотерм двумерного давления. Согласно схеме прибора движение самописца по оси X начинается с того момента, когда барьер пройдет определенный путь. При этом площадь поверхности ванны составляет 3.27-10-2 м2. Конечная точка движения соответствует площади монослоя 1.4-10- м . Изменение площади поверхности составляет 3.13-10-2 м2. Чувствительность прибора при комнатной температуре составляет 0.10-0.01 мН/м в зависимости от настройки.
Экспериментальная часть
Энуклеированные замороженные глазные яблоки свиньи (-20°) размораживали при комнатной температуре, склера была отделена от остатков мышц, связок и пигмента и промыта холодной водой. Полученная ткань может храниться в замороженном виде в течение 3-4 недель.
Выделение коллагена. 100 г очищенной склеры заливали 5 л щелочного раствора (66 г №0Н + 100 г Ма2804 на 1 л раствора) и при периодическом перемешивании выдерживали при 20° в течение 36 ч. При этом полисахариды и протеогликаны, составляющие значительную часть склеры, переходили в раствор. Затем склеру отделяли от раствора на воронке Бюхнера и промывали 1 0 л дистиллированной воды. Для нейтрализации щелочи ткань была обработана 2%-м Н3В03 в течение 40 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Обработку склеры раствором борной кислоты повторяли 4 раза до установления рН раствора 6.0. После нейтрализации щелочи склеру
4 раза отмывали от Н3В03 и №2804 дистиллированной водой (5 л), каждый раз в течение 40 мин при 20° при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Степень отмывки определяли по полному удалению 8042-(реакция с ВаС12).
Получение раствора коллагена. К отмытой склере добавляли равное по объему количество 0.3 М СН3С00Н и выдерживали полученную гелеобразную полупрозрачную массу в течение 7-8 сут при 4° и слабом перемешивании. В этих условиях коллаген переходит в раствор, и склера растворяется практически без остатка. Полученный раствор гомогенизируют и фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 160 мкм, используя водоструйный насос. Концентрация коллагена в полученном растворе (по сухому остатку) составляет 2% по массе. Часть полученного раствора разбавляли 0.2 М №-ацетат-ным буфером с рН 3.44 до концентрации 8.6-10- и 8.6-10-7 М.
Определение концентрации. Содержание коллагена в пробах определяли модифицированным методом Лоури [18] при помощи реактива Фолина-Чиокалто. В качестве стандарта использовали раствор желатины известной концентрации. Регистрацию проводили спектрофотометри-чески при X = 750 нм. Реакционная смесь состояла из 0.04 М Си8О4, 0.11 М №2С4Н406, 0.05М №2С03, 0.4 М №ОН, реактива Фолина-Чиокалто и коллагенового раствора. Метод основан на регистрации окрашенного соединения, образующегося при взаимодействии белка с реактивом Фолина [19].
Формирование монослоев. Для получения монослоев водный раствор коллагена наносили мерной пипеткой (деление шкалы 1 мкл, полный объем 200 мкл) по 20 мкл на каждый опыт, осторожно помещая капли раствора на
водную подложку в место, равноудаленное от барьера, краев ванны и пластинки Вильгельми. В качестве подложки использовали водный раствор, приготовленный на основе дистиллированной воды и соответствующих небольших добавок НС1 или №ОН для получения задаваемых значений рН. Барьер уменьшал площадь монослоя со скоростью 1.59-10- см /с, опыты проводили при температуре 20°. Получены изотермы сжатия-растяжения (п-А) для нанесенного коллагена при рН 3.0-12.0 и изменении площади от 0.15 мг/м2 (3158 нм2 на молекулу) до 35.1 мг/м (13.5 нм на молекулу).
Результаты и обсуждение
Рассмотрим влияние рН водного раствора подложки на изотермы двумерного давления коллагена. Результаты представлены на рис. 2, 3 и в табл. 1. Видно (рис. 2), что кривые имеют вид, типичный для жидких пленок с переходом от жидкорастянутого к жидкоконденсированному состоянию. Собственная площадь молекулы в «лежачем» положении по расчетам, исходя из геометрических параметров молекул, составляет 450 нм , в вертикальном («стоячем») положении - 2.25 нм . Для анализа изотерм выберем следующие характерные области: площадь на молекулу А (нм2) начала подъема кривой; интервал площадей на молекулу
А (нм2),
когда наблюдается плато на кривых п-А и значения двумерного давления в области плато; площадь, приходящаяся на молекулу в конце подъема кривых п-А, т. е. начало коллапса и соответствующее двумерное давление коллапса. Сравним выбранные области п-А с рассчитанными размерами коллагена в «лежачем» и «стоячем» положениях.
Начало подъема на кривых п-А коллагена на водной подложке для всех значений рН при площадях на молеку-
500 1500 2500 500 1500 2500
Площадь на молекулу А, нм 2 Площадь на молекулу А, нм 2
Рис. 2. Изотермы двумерного давления (р - А) сжатия монослоев коллагена, полученные на водных подложках при различных значениях рН: 1 - 3.0, 2 - 4.0, 5 - 5.0, 4 - 6.0, 5 - 7.0, 6 - 8.0, 7 - 9.0, 8 - 10.5, 9 - 11.0, 10 - 12.0. Концентрации наносимого коллагенового раствора С = 8.610 и 8.610 ' М
Т а б л и ц а 1
Параметры изотерм двумерного давления сжатия монослоев коллагена в зависимости от рН подложки. Концентрации
наносимого коллагена составляли 8.6»10-6 и 8.6-10-7 М
рН 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.5 11.0 12.0
Начало подъема А, нм2 2000 2000 2000 2150 1800 1800 2000 2300 2300 2350
Площадь на молекулу в области постоянных п (плато) А, нм 300-250 500-350 630-410 570-310 600-300 320-290 650-310 760-400 500-410 400
Двумерное давление, соответствующее плато п, мН/м 22.0 19.3 24.5 23.6 15.4 21.8 27.3 27.7 20.2 20.9
Площадь на молекулу, соответствующая началу коллапса (конец подъема) А, нм2 131 127 130 143 138 139 130 142 138 137
Давление коллапса п, мН/м 42.2 46.4 47.3 60.3 50.9 53.6 54.1 53.2 42.7 41.8
Т а б л и ц а 2
Зависимость модуля эластичности £о=^/ШпА (мН/м) и dп/dГ в монослоях коллагена в областях жидкорастянутого
и жидкоконденсированного состояния от рН водной подложки
Монослои коллагена рН подложки 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.5 11.0 12.0
Жидкорастянутое £0, мН/м 13.2 12.5 20.7 20.3 12.2 19.3 24.1 24.7 24.2 19.4
состояние (до плато) ап/аг 19.8 29.1 46.5 44.8 25.4 43.2 56.3 60.5 56.9 48.5
Жидкоконденсиро- £0, мН/м 36.3 31.3 29.9 66.7 21.5 18.7 35.2 39.1 34.7 44.2
ванное состояние (после плато) ап/аг 14.7 17.9 18.6 34.8 10.0 8.4 15.8 19.0 14.3 19.1
лу, равных 1800-2300 нм2 Эти значения в несколько раз больше рассчитанных площадей на молекулу в горизонтальном «лежачем» положении (450 нм ) и мало зависят от рН подложки. При площадях, приходящихся на молекулу коллагена, в 700-300 нм (сравнимых с площадью на молекулу коллагена в «лежачем» положении) на кривых п-А обнаруживается плато. Это означает, что повышение поверхностной концентрации коллагена на водных подложках приводит к уменьшению площади на молекулу коллагена при неизменном двумерном давлении п, зависящем только от рН, т.е. от заряда на макромолекулах коллагена. Сжатие монослоев коллагена до 120-130 нм2 приводит к появлению плато с постоянным двумерным давлением, равным 40-60 мН/м. Такие значения площадей, приходящихся на молекулу, в 4 раза меньше соответствующих площадей коллагена в «лежачем» положении и в 50 раз больше, чем в «стоячем». Можно предположить, что происходит ассоциация молекул коллагена и образование более упорядоченных поверхностных структур. Дальнейшее сжатие монослоя коллагена приводит к еще меньшей площади на молекулу, соответствующей формированию фибрилл коллагена, двумерное давление при этом не изменяется. Наблюдается зависимость давления коллапса коллагена от рН подложки (рис. 3). Наибольшее
значение давления коллапса в изоэлектрическом состоянии наблюдается при рН 6.0 и составляет 60 мН/м. При переходе в кислую и щелочную области давление коллапса уменьшается.
Анализируя ход кривых изотерм двумерного давления коллагена (рис. 2), можно заключить, что имеющиеся перегибы кривых обусловлены ориентационным переходом коллагена в монослое. Из табл. 1 видно, что процесс переориентации молекул коллагена в монослое при сжатии происходит при всех изученных значениях рН, причем их положение и параметры зависят от величины рН. Переориентация молекул коллагена в разных областях двумерного давления отражается и на петлях гистерезиса двумерного давления сжатия и растяжения (рис. 4, а и б). Видно, что в области жидкорастянутого состояния имеется небольшой гистерезис до плато (рис. 4, а), в области жидкоконденсированного состояния гистерезис проявляется сильнее после плато (рис. 4, б). Причиной гистерезиса могут быть межмолекулярные взаимодействия молекул коллагена, которые приводят к сетчатой двумерной структуре на поверхности подложки, которая при растяжении разрывается и оставляет обрывки скрепленных коллагено-вых поверхностных структур. Поверхностное давление падает при этом тем ниже, чем больше поверхностная кон-
плато наибольший в изоэлектрическом состоянии (рН 6.0) и составляет 67 мН/м.
В области жидкорастянутого состояния значение ёп/ёГ изменялось от 20 до 60, в области жидкоконденсированно-го - от 10 до 35. Это означает, что при больших поверхностных концентрациях двумерное давление изменяется меньше вследствие специфической ориентации молекул. Такая ориентация дает возможность образования большего числа фибрилл и межмолекулярных необратимо-разрушающихся контактов, обусловливающих модуль эластичности двумерной самоорганизующейся структуры коллагена на жидкой подложке.
Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант № 98-03-33365а.
Рис. 3. Зависимость давления коллапса пмакс коллагена на границе вода - воздух от рН подложки. Концентрация наносимого коллагенового раствора С = 8.610-6 М
центрация коллагена, полученная при сжатии пленки. Это свидетельствует об образовании прочно связанных надмолекулярных структур и является весомым аргументом в пользу предположения о фибриллообразовании в монослое коллагена. В растворе коллагена (и в живом организме) образование коллагенового волокна происходит в результате спонтанного, специфического соединения между собой трехцепочечных спиральных коллагеновых молекул. Основу структурной организации коллагеновых фибрилл составляют сдвинутые на 1/4 ступенчато расположенные параллельные ряды коллагеновых молекул. Особенность фибрилл коллагена состоит в том, что расположенные в ряд молекулы не связаны «конец в конец», между концом одной молекулы и началом следующей имеется промежуток около 40 нм. Известно, что фибриллообразование в монослое характерно для других фибриллообразующих белков - миозина и тубулина. По коллагену такие исследования не проводили, однако склонность к образованию фибрилл в растворе у коллагена выше, чем у этих белков.
Образование связанных двумерных структур коллагена на поверхности воды подтверждается расчетами модулей упругости в областях жидкорастянутого (до плато) и жид-коконденсированного (после плато) состояния. В табл. 2 приведены рассчитанные модули эластичности £0 (е0 = ёп/ё1пА) и соотношения ёп/ёГ, показывающие вклад поверхностной концентрации в изменение двумерного давления для всех изученных изотерм при разных рН подложки. При всех значениях рН в областях жидкорастяну-того и жидкоконденсированного состояния найдены довольно большие значения модулей эластичности (от 12 до 40 мН/м), при этом при больших поверхностных концентрациях (после плато на изотермах двумерного давления) примерно в 2.5 раза выше, что свидетельствует о большем числе контактов между молекулами и фибриллами коллагена. Модуль эластичности в области после
Рис. 4. Изотермы двумерного давления (п - А): 1 - сжатия, 2 -растяжения монослоев коллагена на границе вода - воздух при рН 6.0 и разных степенях сжатия монослоя. Растяжение из области : а - плато, б - коллапса. Концентрации наносимого коллагенового раствора С = 8.6-10 и 8.6-10 М
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные
явления в белковых системах. М., 1988.
2. Ямпольская Г.П., Измайлова В.Н., Разникова Г.П., Нусс П.В.
// Изв. Академии наук. Сер. физ. 1995. 59. Р. 109.
3. Слуцкий Л.И., Симхович Б.З. // Успехи современной биологии.
1980. 89. С. 58.
4. Lee Robert E., Davison Peter F. // Experimental eye research.
1981. 32. Р. 737.
5. Ellis S.C., Pankhurst K.G.A. // Nature. 1949. 163. Р. 600.
6. Ellis S. C., Pankhurst K. G. A. // Transactions of the Faraday
Society. 1954. 50. Р. 82.
7. Clark S.G., Holt P.F. // Transactions of the Faraday Society.
1957. 53. Р. 1509.
8. Ellis S.C., Pankhurst K.G.A. Interaction of tanning materials with
collagen monolayers. // Discussions of the Faraday Society. 1954. 16. Р. 170.
9. Nakamura Makoto, Kawato Kazuko, Matuura Ryohei // Memoirs
of the Faculty of Science. Kyushu University. Ser. C. Chemistry. 1978. C10. Р. 183.
10. Polatnick Jerome, La Tessa A. J., Katzin H. M. // Biochim. biophys. acta. 1957. 26. Р. 365.
11. Keeley F.W., Morin J.D., Vessely S. // Experimental eye research. 1984. 39. Р. 533.
12. Birk David E., Silver Frederick H. // Internal J. Biolog. Macromolec. 1983. 5. Р. 209.
13. Borcherding Maxine S., Blacik L.J., Sittig R.A., Bizzell James W., Breen M., Weinstein H.G. // Experimental eye research. 1975. 21. Р. 59.
14. Quantock Andrew J., Meek Keith M. // Biophysical Journal. 1988. 54. Р. 159.
15. Young Robert D. // Journal of Cell Science. 1985. 74. Р. 95.
16. Демин Ю.А., Шарлей Т.М. // Криобиология. 1988. С. 43.
17. Демин Ю.А., Юрченко Т.Н., Шарлей Т.М. Влияние охлаждения на биологические объекты. Харьков, 1990. С. 38.
18. Слуцкий Л.И., Шелекетина И.И. // Вопросы медицинской химии. 1959. 5. С. 466.
19. Авдеев В. Г. // Вопросы медицинской химии. 1977. 23. С. 562.
Поступила в редакцию 02.04.98
