CC BY
313
УДК 57.021.6:615.214.2
Молекулярный механизм действия Ноопепта - замещенного Pro-Gly-дипептида
Ю. В. Вахитова12*, С. В. Садовников2, С. С. Борисевич2,3, Р. У. Островская1, Т. А. Гудашева1, С. Б. Середенин1
'Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова, 125315, Москва, ул. Балтийская, 8
2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450065, Уфа, просп. Октября, 71
3Уфимский институт химии РАН, 450065, Уфа, просп. Октября, 71 *E-mail: juvv73@gmail.com Поступила в редакцию 16.06.2015 Принята к печати 10.09.2015
РЕФЕРАТ Изучено влияние Ноопепта (этиловый эфир N-фенилацетил^-пролилглицина) на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов (ТФ) в клетках линии HEK293, транзиентно транс-фицированных люциферазными репортерными конструкциями, содержащими сайты связывания ТФ: CREB, NFAT, NF-kB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF-1. Показано, что Ноопепт (10 мкМ) увеличивал ДНК-связывающую активность только HIF-1 и не влиял на активность CREB, NFAT, NF-kB, p53, STAT1, GAS, VDR и HSF1. Выраженность HIF-позитивного эффекта Ноопепта зависела от его концентрации. В условиях стабилизации HIF-1, вызванной индуктором гипоксии СоС12, Ноопепт обеспечивал дополнительное повышение ДНК-связывающей активности HIF-1. Пирацетам (1 мМ) не вызывал значимых изменений ДНК-связывающей активности ТФ. Результаты молекулярного докинга показали, что Ноопепт (L-изомер), а также метаболит Ноопепта - L-изомер N-фенилацетилпролина - способны связываться с активным сайтом пролилгидроксилазы 2. Данные о вызываемом Ноопептом селективном увеличении ДНК-связывающей активности HIF-1 с учетом функциональной значимости генов, активируемых этим фактором транскрипции, объясняют выявленные ранее нейрохимические и фармакологические эффекты Ноопепта, что дает основание рассматривать HIF-позитивный эффект в качестве первичного механизма действия этого дипептида.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА гипоксия, докинг, нейропротекция, Ноопепт, пролилгидроксилаза, транскрипционный фактор HIF-1.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CREB - белок, связывающий сАМР-зависимый элемент (cAMP-responsive element-binding protein); NFAT - ядерный фактор активированных Т-клеток (nuclear factor of activated T-cells); NF-kB - транскрипционный фактор (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells); STAT1 -фактор транскрипции, преобразователь сигналов и активатор транскрипции (signal transducer and activator of transcription); GAS - последовательность, активируемая интерфероном Y (interferon-gamma-activated sequence); VDR - рецептор витамина Д (vitamin D3 receptor); HSF1 - транскрипционный фактор, регулирующий синтез белков теплового шока (heat shock transcriptional factor 1); HIF-1 - фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia-inducible factor 1).
ВВЕДЕНИЕ
Ноопепт (этиловый эфир ^фенилацетил-Ь-пролилглицина) разработан в качестве лекарственного средства в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова. Синтез препарата основан на оригинальной гипотезе пептидного дизайна, согласно которой с использованием соответствующих аминокислот воспроизводятся структуры, близкие к известным психотропным средствам [1]. Непептидным про-
образом Ноопепта был ноотропный препарат Пирацетам. Фармакологическая активность нового соединения оказалась в целом сходной с активностью Пирацетама, однако она проявлялась в дозах в 1000 раз более низких [2, 3]. Кроме того, у Ноопепта более выражены анксиолитические [4] и нейропротектив-ные свойства [5-7].
Клиническое изучение Ноопепта (ЛС 015770) подтвердило обнаруженные в эксперименте его ноотроп-
ные эффекты. У больных с мягкими когнитивными нарушениями цереброваскулярного и посттравматического генеза препарат ослаблял когнитивные нарушения, проявлял анксиолитическое и вегетостаби-лизирующее действие (www.noopept.ru).
Механизм действия Ноопепта изучается со времени его синтеза. Установлено, что препарат усиливает экспрессию NGF и BDNF в гиппокампе [8], проявляет холино-позитивные свойства на поведенческом и нейрональном уровне [9], ослабляет окислительный стресс и усиливает активность антиоксидантных систем [7, 10], вызывает угнетение индуцируемых стрессом киназ pSAPK/JNK и pERKl [11]. Однако изучение первичных взаимодействий Ноопепта более чем со 100 известными ре-цепторными образованиями, выполненное согласно нашему протоколу компанией CEREP (Франция), не привело к ожидаемому выявлению первичных мишеней. Вместе с тем, обнаруженный широкий спектр нейрохимических и фармакологических эффектов Ноопепта определил необходимость дальнейшего поиска его мишеней.
С целью получения более полной информации о мишенях Ноопепта мы проанализировали in vitro влияние препарата на ДНК-связывающую активность фармакологически значимых биомишеней -транскрипционных факторов (ТФ) CREB, NFAT, NF-кВ, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1, HIF-1. Выявив избирательное влияние Ноопепта на HIF-1, мы изучили эффект препарата на активность этого транскрипционного фактора в условиях моделируемой гипоксии in vitro.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культивирование клеток
В работе использовали клетки линии HEK293 (перевиваемые клетки почки эмбриона человека; Российская коллекция клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37°С, 5% CO2 в среде DMEM («Биолот», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США), 2 мМ L-глутамин, 50 мкг/мл гентамицина сульфата, 2.5 мкг/мл амфо-терицина В («ПанЭко», Россия).
Влияние Ноопепта на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов изучали с использованием люциферазных репортерных конструкций, содержащих сайты связывания CREB, NFAT, NF-кВ, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF-1 в соответствии с [12].
Для проведения трансфекций клетки линии HEK293 рассаживали по 4 х 103 клеток в лунки 96-луночных планшетов в 100 мкл среды DMEM
без антибиотика, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамин. Репортерные векторные конструкции, содержащие сайты связывания транскрипционных факторов CREB, NFAT, NF-кВ, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF-1, получены на основе плазмидного вектора pTL-Luc (Panomics, США; несет ген люциферазы Photinus pyralis) [13]. Клетки HEK293 транзиентно трансфи-цировали данными конструкциями с помощью реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen, США) согласно рекомендациям изготовителя. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли средой с антибиотиком (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамин, 50 мкг/мл гентамицина сульфата) и через 18 ч добавляли изучаемые препараты (Ноопепт, 10 мкМ; Пирацетам, 1 мМ). Клетки инкубировали в присутствии Ноопепта или Пирацетама в течение еще 24 ч. Люциферазную активность в клеточных лизатах определяли с помощью набора Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, США) на планшетном анализаторе 2300 EnSpire® Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, США). В качестве внутреннего контроля трансфекции применяли котрансфекцию с плазмидой pRL-TK (Promega, США), кодирующей ген люциферазы Renilla reniformis. Значения люминесценции P. pyralis нормировали по люминесценции R. reniformis в каждом измерении.
Экспериментальное моделирование гипоксии осуществляли с использованием СоС12, который вызывает стабилизацию HIF-1, т.е. является фармакологическим индуктором гипоксии [14]. Люциферазная конструкция для анализа активности HIF-1 содержит четыре копии консенсусной последовательности 5'-ACGTG-3' - сайта связывания белка HIF-1 (конструкция HIF-1-Luc). Клетки, трансфицированные плазмидным вектором HIF-1-Luc, предварительно инкубировали с Ноопептом в течение 8 ч (конечные концентрации 1, 10, 100 мкМ; двукратное внесение через каждые 4 ч), далее вносили индуктор гипоксии CoCl2 в рабочей концентрации 50 мкМ и продолжали совместную инкубацию Ноопепта и CoCl2 в течение 16 ч, после чего люциферазную активность определяли как описано выше.
Статистический анализ
Среднее арифметическое значений, полученных по двум повторам в трех независимых экспериментах, и стандартную ошибку среднего рассчитывали с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft. Inc., США). Экспериментальные группы сравнивали с использованием парного t-критерия Стьюдента для зависимых выборок.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ In silico оценка энергий взаимодействия лиганда и рецептора
Код лиганда Структура лиганда AGFlexX> , кДж/моль1 RMSD2 aghyde, 3 кДж/моль3 LE4
ZINC24800213 -31.8 0.42 -63 0.79 (В)
ZINC1542824_L -17.0 0.48 -44 0.45 (СВ)
ZINC3812682_D -17.5 1.10 -42 0.42 (СВ)
ZINC76075_L % -24.1 0.47 -38 0.53 (В)
PA2_L -27.2 0.55 -49 0.55 (В)
PA2_D -28.2 0.73 -41 0.47 (СВ)
1 ЛGR X - свободная энергия связывания, кДж/моль.
2 RMSD - среднеквадратичное отклонение положения лиганда в активном сайте.
3ЛGHYDE - энергия сродства лиганда с сайтом связывания, кДж/моль.
^Е - эффективность лиганда ^Е = |ЛGHYDE|/N [22, 23], где N - количество тяжелых, т.е. не водородных атомов), при этом эффективность лиганда может быть оценена, как В - высокая эффективность, СВ - эффективность выше средней [22].
Молекулярный докинг
Для построения и валидации модели докинга использовали данные о трехмерной структуре белка-мишени - пролилгидроксилазы 2 (PHD2; hypoxia-inducible factor-L-proline, 2-oxoglutarate:oxygen oxidoreductase [КФ 1.14.11.29]; код PDB: 2G19) -в комплексе с «нативным» ингибитором (код ZINC: 24800213; IC50 1.4 мкМ) [15, 16]. В качестве лигандов рассматривали: Ноопепт и его D-энантиомер (коды ZINC: 1542824 и 3812682 соответственно); метаболит Ноопепта L-N-фенилацетилпролин (код ZINC: 76075), а также стереоизомеры описанного ранее [31] ингибитора пролилгидроксилазы (шифры PA2L
и PA2D) (таблица). Геометрические параметры большинства молекул извлечены из базы данных ZINC [17] или смоделированы с помощью программы ChemCraft v1.7 [18] и оптимизированы методом HF/6-311G(d,p) в программе GAUSSIAN 09 C.01 [19]. Подготовка структур мишени и лигандов к докингу, как и все процедуры докинга, проведены с помощью программы LeadIT 2.1.8 [20]. Все квантово-химиче-ские расчеты проведены на кластерном суперкомпьютере Уфимского института химии РАН.
Область окружения «нативного» ингибитора (ZINC: 24800213) соседними аминокислотными остатками составляет 6.5 Á и содержит Arg383, Tyr310,
Tyr310
л
pe
Рис. 1. Анализ активного сайта фермента пролилги-дролазы 2. А - активный центр, занятый «нативным» лигандом. Б - взаимодействие ингибитора с аминокислотными остатками фермента (докинг-решение)
Tyr303 и Fe2+. Анализ активного центра фермента 2G19 показал, что Arg383 и Tyr329 образуют водородные связи с карбоксильной группой «нативного» ингибитора ZINC 24800213; Tyr310 и Tyr303 формируют л—л-электронное взаимодействие с ароматическими кольцами этого лиганда. Аминокислотные остатки Trp389, Trp258, Met299 и Ile256 образуют гидрофобный карман (рис. 1). При подготовке структуры фермента к процедуре докинга из активного центра удалили все молекулы воды. Редокинг «нативного» лиганда в активный сайт фермента PHD2 точно воспроизводит способ связывания лиганда и фермента, определенный кристаллографически. Среднеквадратичное отклонение составляет 0.44 Á. Подпрограмма FlexX [21] позволяет провести проце-
дуру докинга лигандов (таблица) и оценить энергию связывания лиганда и рецептора в активном сайте. Количество докинг-решений может быть большим, и выбор оптимального решения основывается на минимальном значении энергии связывания в совокупности с минимальным значением среднеквадратичного отклонения (RMSD) позиции лиганда в сайте связывания. Далее выбранная позиция подвергается еще одному этапу расчета: оценке энергии сродства лиганда с сайтом связывания (AGHYDE, кДж/моль) и оценке эффективности лиганда [22, 23]. Подробный алгоритм расчета описан в работе [22]. Отмечается, что оптимальным является использование двух последовательных этапов выбора соединения-лидера среди лигандов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, представленные на рис. 2А, свидетельствуют о том, что инкубация с Ноопептом в концентрации 10 мкМ в течение 24 ч увеличивала ДНК-связывающую активность HIF-1 на 43% и не вызывала статистически значимых изменений ДНК-связывающей активности факторов CREB, NFAT, NF-kB, p53, STAT1, GAS, VDR и HSF1. Как следует из данных, представленных на рис. 3, Ноопепт в концентрации 10 и 100 мкМ увеличивал уровень индукции люциферазы. С использованием препарата сравнения показано, что Пирацетам ни в эквимолярной (10 мкМ, данные не представлены), ни в более высокой концентрации (1 мМ) не вызывает статистически значимых изменений ДНК-связывающей активности изученных транскрипционных факторов (рис. 2Б).
.0
м т О. <и -fr
§ 2 § °
§S
I чР 5 о4 Л X Ф
СП
О
.
>
160 140 120 100 80 60 40 20 0
Т---1--- I - I - I - I -1-1—1--F—--г
NF-kB NFAT STAT1 HIF-1 а р53 CREB GAS VDR HSF1
I i — i — i — i ——r-
NFAT STAT1 HIF-1a р53 CREB GAS
VDR HSF1
Рис. 2. Влияние Ноопепта, 10 мкМ (А) и Пирацетама, 1 мМ (Б) на базальную ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов NF-kB, NFAT, STAT1, HIF-1, p53, CREB, GAS, VDR, HSF1 in vitro. Статистическую значимость различий оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента для зависимых выборок (n = 3, *p < 0.05)
Б
А *
I
т———I———1———г Контроль 1 мкМ 10 мкМ100 мкМ
Базальный уровень активности HIF-1 а
¿1
X
i
СоС12 1 мкМ 10 мкМ100 мкМ
СоС12-индуцируемый уровень активности HIF-1a
Рис. 3. Влияние Ноопепта на базальную и индуцированную активность HIF-1. Группа «контроль» - значения базальной активности Н^-1 в нестимулированных клетках; группа «СоС12» -значения активности Н^-1 в СоС12-стимулированных клетках. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (п = 3; *р < 0.05 по отношению к группе «контроль»; #р < 0.05 по отношению к группе «СоС12»)
На следующем этапе работы анализировали влияние Ноопепта на ДНК-связывающую активность HIF-1 в присутствии фармакологического миметика гипоксии СоС12. В полном соответствии с опубликованными данными на фоне действия CoCl2 наблюдали повышение активности HIF-1. Добавление Ноопепта в концентрации 10 и 100 мкМ приводило к дополнительному увеличению HIF-1-зависимой люциферазной активности (рис. 3). Таким образом, впервые установлено, что Ноопепт обладает способностью увеличивать как базальную, так и индуцированную фармакологическим миметиком гипоксии активность HIF-1 in vitro.
Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF-1), является гетеродимером, состоящим из двух субъединиц - чувствительной к кислороду субъединицы HIF-1a и конститутивно экспрессирующейся HIF-ip. Гипоксия способствует возрастанию уровня HIF-1a, его димеризации с HIF-1P, мобилизации коактива-торов (р300/СВР) и связыванию этого комплекса с элементом HRE (hypoxia-response element) в ре-гуляторных областях генов-мишеней. В нормокси-ческих условиях зависимое от кислорода гидрок-силирование остатков пролина в молекуле HIF-1a пролилгидроксилазами необходимо для связывания компонентом убиквитин-протеин-лигазы Е3 - белком Гиппеля-Линдау (VHL). Убиквитинилированный HIF-1a становится мишенью для деградации 26S протеасомами. В присутствии кислорода остаток аспарагина в С-концевом трансактиваторном домене (C-TAD) HIF-1a гидроксилируется аспарагингидрок-силазой (FIH1, factor inhibiting HIF-1), что блокирует
его взаимодействие с коактиватором транскрипции p300/CBP. Таким образом, при нормоксии PHD и FIH инактивируют HIF-1a, подавляя зависимую от HIF-1 экспрессию генов-мишеней. В условиях гипоксии активность PHD и FIH снижается, что приводит к уменьшению деградации HIF-1a и запуску транскрипции зависимых от него генов [24]. Показано [25], что HIF-1 активирует в общей сложности до 100 генов. На рис. 4 представлены основные мишени HIF-1, к числу которых относятся гены, вовлеченные в процессы ангиогенеза за счет активации фактора роста эндотелия сосудов, усиления синтеза эритропоэтина, активации систем транспорта глюкозы через мембраны, цитопротекции нейротрофическими факторами, нормализации клеточного цикла и метаболизма на уровне митохондрий, в том числе активности ан-тиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы. Совокупность этих эффектов обеспечивает осуществление адаптивной реакции на гипок-сическое воздействие. Наряду с этим HIF-1 влияет на состояние многих нейротрансмиттерных систем -он активирует белок, контролирующий рецепторы ГАМК (GABARBP) [26], повышает активность тиро-зингидроксилазы [27]. Описаны тесные взаимоотношения HIF-1 с холинорецепторами [28].
Как показано в нашей работе, Ноопепт вызывает зависимое от концентрации увеличение базальной ДНК-связывающей активности HIF-1. При стабилизации HIF-1 с помощью СоС12, химического индуктора этого транскрипционного фактора [29, 30], Ноопепт обеспечивает дополнительное нарастание ДНК-связывающей активности HIF-1. Эффект в от-
Цитопротекция нейротрофинами
1
Активация
антиоксидантных Ч-
энзимов
v_ —4
V Ангиогенез
'1=
Рис. 4. Фактор, индуцируемый гипоксией HIF-1, и его мишени. Модифицировано по [35]
ношении HIF-1 специфичен для Ноопепта: классический ноотропный препарат Пирацетам не влияет на активность данного транскрипционного фактора. Ноопепт увеличивает ДНК-связывающую активность только HIF-1, тогда как активность других транскрипционных факторов (CREB, NFAT, NF-kB, p53, STAT1, GAS, VDR и HSF1) не повышается. Поскольку пролилгидроксилаза непосредственно участвует в деактивации HIF-1, а аналоги пролина описаны как эффективные ингибиторы этого фермента [31], можно предположить, что увеличение ДНК-связывающей активности HIF-1 при действии Ноопепта связано с ингибированием этого фермента.
Сопоставление структуры ингибиторов пролил-гидроксилазы, представленных в работе Ma и соавт. [31], и метаболитов Ноопепта позволяет сделать вывод о сходстве соединения РА2 (бензилоксикарбо-нилпролин) с N-концевым фрагментом молекулы Ноопепта - N-фенилацетилпролином (таблица) [32, 33]. Следует принять во внимание, что диапазон концентраций, в которых РА2 угнетает пролилгидрок-силазу (K = 2.38 мкМ, EC50 = 3.17 мкМ) [31], близок к выявленному нами уровню эффективных концентраций для Ноопепта.
Согласно результатам молекулярного докинга Ноопепт и L-изомер N-фенилацетилпролина связываются с активным центром пролилгидроксилазы
с эффективностью, сопоставимой с эффективностью Ь-изомера РА2L (таблица). Качественная оценка эффективности лиганда оценивается как высокая. Ь-стереоизомер ^фенилацетилпролина в активном сайте фермента формирует водородные связи с А^383 и Туг329, а молекула PA2L координируется атомами кислорода вокруг атома железа (рис. 5). Интересно отметить, что фармакологически неактивный О-изомер Ноопепта имеет более низкую энергию связывания. Таким образом, можно предположить, что Ноопепт и его метаболит - Ь-изомер ^фенилацетилпролина, могут связываться с активным сайтом пролилгидроксилазы 2 и, возможно, ингибировать ее ферментативную активность. Очевидно, что для окончательного заключения требуется экспериментальное изучение действия Ноопепта и его метаболита на активность пролилги-дроксилазы. Дополнительного изучения также требует возможное взаимодействие Ноопепта с аспара-гингидроксилазой.
Возвращаясь к вопросу о взаимодействии Ноопепта с Н№-1 (при отсутствии такого взаимодействия у Пирацетама), следует отметить, что Ноопепт сконструирован в качестве дипеп-тидного аналога Пирацетама. Однако эффективные дозы Ноопепта на три порядка меньше, чем у Пирацетама [2]. Новый препарат и его непептидный
Туг310
Туг329 76075
Рис. 5. Результаты молекулярного докинга: расположение лигандов в активном сайте про-лилгидроксилазы (водородные связи показаны пунктирной линией)
РА2 L
прообраз различаются и по спектру фармакологической активности. Так, Ноопепт облегчал все фазы процессинга информации, а Пирацетам влиял преимущественно на начальные фазы [1]. Ноопепт проявляет выраженные нейропротективные свойства, тогда как у Пирацетама они, в зависимости от оцениваемого показателя, либо слабо выражены [7, 34], либо отсутствуют [35]. С фармакологических позиций такие различия должны иметь в своей основе особенности механизма действия, к которым можно отнести обнаруженный нами эффект взаимодействия Ноопепта с НГР-1.
Независимо от деталей указанного взаимодействия важно, что этот пролинсодержащий дипеп-тид повышает активность Н№-1. Известно, что активация системы рассматривается в настоящее время как один из основных механизмов нейропро-текции при гипоксии, ишемии мозга, нейродегене-ративных заболеваниях [24, 36]. В ходе многолетнего изучения именно эти состояния определили в качестве фармакологических мишеней действия Ноопепта на широком наборе соответствующих экспериментальных моделей.
Вслед за способностью Ноопепта повышать выживаемость животных в условиях гипербарической гипоксии [37], выявленной в самом начале изучения этого дипептида, было показано, что он уменьшает величину очага ишемического повреждения мозга на моделях циркуляторной гипоксии, например, кортикального фотоиндуцированного тромбоза [6] и перевязки среднемозговой артерии [5]. Способность Ноопепта ослаблять выраженность окислительного стресса установлена как на нейрональных культурах различного типа: зернистых клетках мозжечка [35], культуре кортикальных нейронов абортированных плодов с диагностированным синдромом Дауна [7], культуре РС12 [38] и культуре SH-SY5Y [39], так и в условиях целого организма в эксперименте на мозговой ткани и плазме крови крыс [40].
Способность усиливать активность супероксиддис-мутазы и каталазы показана как в эксперименте [10], так и в клинических условиях [34].
На моделях болезни Альцгеймера выявлена способность Ноопепта не только устранять проявления когнитивного дефицита [41], но и оказывать нейро-протективное действие, приводящее к ослаблению нарушений окислительных процессов и кальциевого гомеостаза, усилению нейрогенеза, предупреждению агрегации тау-белков, вызванной фрагментом Р-амилоида25 35 [38], устранению дефицита NGF и BDNF на фоне введения в желудочки мозга диа-бетогенного токсина стрептозотоцина [42]. Ноопепт способен уменьшать цитотоксический эффект агрегированного а-синуклеина на клеточной модели паркинсонизма [39]. Все эти многочисленные эффекты могут быть объяснены активацией транскрипционного фактора НГР-1.
За последние годы нами показано, что Ноопепт оказывает антидиабетическое действие на модели стрептозотоцинового диабета [43]. Этот факт трактовался нами как результат многофакторного метаболического действия препарата - ослабления свойственного диабету дефицита антиоксидант-ных систем и нейротрофических факторов, усиленной продукции провоспалительных цитокинов [44]. Полученные в настоящей работе результаты привлекли наше внимание к данным о роли Н№-1 в развитии патологических процессов при сахарном диабете. Так, сообщается о способности инсулина нарушать образование Н^-1 и о роли дефицита этого фактора в развитии сахарного диабета типа 1 и 2, а также его осложнений [45]. Нарушение функции систем транспорта глюкозы GLUT1 и GLUT3 через клеточные барьеры, наблюдаемое при дефиците Н№-1, способствует развитию резистентности к инсулину как при болезни Альцгеймера, так и при сахарном диабете [46]. Доказано участие Н№-1 в экспрессии инкретинов - важнейших факторов цитопротекции
Р-клеток поджелудочной железы [47]. Совокупность этих данных позволяет предположить, что в реализации антидиабетического эффекта Ноопепта, в том числе в выявленной нами недавно способности этого препарата повышать уровень инкретина - глюкаго-ноподобного пептида-1 (ГПП-1) [44], участвует его Н^-1-позитивный эффект.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в настоящей работе данные о способности эффективного ноотропного и нейропротек-тивного препарата Ноопепт вызывать увеличение ДНК-связывающей активности Н№-1 позволяют по-новому трактовать широкий спектр его действия, а именно, считать, что Н№-1-позитивный эффект препарата можно рассматривать как первичный механизм его действия. Уточнение молекулярных механизмов, лежащих в основе Н^-1-позитивного действия Ноопепта, безусловно, требует дальнейшего исследования, но наличие этого эффекта, несомнен-
но, имеет важное значение, поскольку позволяет объяснить практически все известные на сегодняшний день эффекты Ноопепта и, возможно, других биологически активных Рго^1у-пептидов. Эти данные предоставляют дополнительные доказательства в пользу современных представлений о важной роли компонентов Н№-1-зависимого сигнального пути и запускаемых этим транскрипционным фактором компенсационных процессов в механизмах нейро-протекции. •
Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель», Уфа) и УНУ «КОДИНК».
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ (НШ 5923.2014.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гудашева Т.А. // Вестн. РАМН. 2011. № 7. С. 8-16.
2. Seredenin S.B., Voronina T.A., Gudasheva T.A., Ostrovskaya R.U., Rozantsev G.G., Skoldinov A.P., Trofimov S.S., Halikas J., Garibova T.L. Biologically active N-acylprolyldipeptides having antiamnestic, antihypoxic effects. Patent 5.439.930 USA. 1995.
3. Gudasheva T.A., Voronina T.A., Ostrovskaya R.U., Rozantsev G.G., Vasilevich N.I., Trofimov S.S., Kravchenko E.V., Skoldinov A.P., Seredenin S.B // Eur. J. Med. Chem. 1996. V. 31.
P. 151-157.
4. Ostrovskaya R.U., Seredenin S.B., Voronina T.A., Moloda-vkin G.M., Gudasheva T.A. // In Animal models in biological psychiatry / Ed. Kalueff A.V. N.-Y.: Nova Sci. Publ. Inc., 2006. P. 165-182.
5. Гаврилова С.А., Ус К.С., Островская Р.У., Кошелев В.Б. // Эксп. клин. фармакология. 2006. Т. 69. № 4. С. 16-18.
6. Ostrovskaya R.U., Romanova G.A., Barskov I.V., Shanina E.V., Gudasheva T.A., Victorov I.V., Voronina T.A., Seredenin S.B. // Behav. Pharmacol. 1999. V. 10. P. 549-553.
7. Pealsman A., Hoyo-Vadillo C., Seredenin S.B., Gudasheva T.A., Ostrovskaya R.U., Busciglio J. // Int. J. Dev. Neurosci. 2003. V. 21. P. 117-124.
8. Островская Р.У., Гудашева Т.А., Цаплина А.П., Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Ямиданов Р.С., Середенин С.Б. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2008. Т. 146. № 9. С. 309-312.
9. Островская Р.У., Мирзоев Т.Х., Фирова Ф.А., Трофимов С.С., Гудашева Т.А., Греченко Т.Н., Гутырчик Е.Ф., Баркова Е.Б. // Эксп. клин. фармакология. 2001. Т. 64. № 2. С. 11-14.
10. Менджерицкий А.М., Лысенко А.В., Демьяненко С.В., Прокофьев В.Н., Гудашева Т.А., Островская Р.У. // Нейрохимия. 2003. Т. 20. № 4. С. 281-286.
11. Островская Р.У., Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Ямиданов Р.С., Садовников С.В., Капица И.Г., Середенин С.Б. // Эксп. клин. фармакология. 2010. Т. 73. № 12. С. 2-5.
12. Phippard D., Manning A.M. // Methods Mol. Biol. 2003. V. 225. P. 19-23.
13. Салимгареева М.Х., Садовников С.В., Фарафонтова Е.И., Зайнуллина Л.Ф., Вахитов В.А., Вахитова Ю.В. // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. № 2. С. 219-225.
14. Piret J.P., Mottet D., Raes M., Michiels C. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2002. V. 973. P. 443-447.
15. Rose P.W., Prlic A., Bi C., Bluhm W.F., Christie C.H., Dutta S., Green R.K., Goodsell D.S., Westbrook J.D., Woo J., et al. // Nucl. Acids Res. 2015. V. 43. P. 345-356. http://www.rcsb.org/
16. McDonough M.A., Li V., Flashman E., Chowdhury R., Mohr C., Lienard B.M., Zondlo J., Oldham N.J., Clifton I.J., Lewis J., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 26. P. 9814-9819.
17. Irwin J.J., Shoichet B.K. // J. Chem. Inform. Model. 2005. V. 45. P. 177-182.
18. Zhurko G.A., Zhurko D.A. // ChemCraft. v. 1.7. 2013.
19. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Scalmani G., Barone V., Mennucci B., Petersson G.A., et al. // Gaussian 09, Revision C.01, Gaussian Inc., Wallingford CT, 2010.
20. Claussen H., Dramburg I., Gastreich M., Hindle S., Kaemper A., Kramer B., Lilienthal M., Mueller G., Rarey M., Wefing S., et al. // LeadIT. V. 2.1.8 BioSolveIT CmbH, 2014.
21. Rarey M., Kramer B., Lengauer T., Klebe G. // J. Mol. Biol. 1996. V. 261. P. 470-489.
22. Schneider N., Hindle S., Lange G., Klein R., Albrecht J., Briem H., Beyer K., Claußen H., Gastreich M., Lemmen Ch., Rarey M. // J. Comput Aided Mol. Des. 2012. V. 26. P. 701-723.
23. Kuntz I.D., Chen K., Sharp K.A., Kollman P.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. №. 18. P. 9997-10002.
24. Semenza G. // Cell. 2012. V. 148. № 3. P. 399-408.
25. Zheng H., Fridkin M., Youdim M. // Persp. Med. Chem. 2015. V. 7. P. 1-8.
26. Park S.H., Kim B.R., Lee J.H., Park S.T., Lee S.H., Dong S.M., Rho S.B. // Cell Signal. 2014. V. 26. № 7. P. 1506-1513.
27. Schnell P.O., Ignacak M.L., Bauer A.L., Striet J.B., Paulding W.R., Czyzyk-Krzeska M.F. // J. Neurochem. 2003. V. 85. № 2. P. 483-491.
28. Hirota K., Ryo Fukuda R., Takabuchi S., Kizaka-Kondoh S., Adachi T., Kazuhiko Fukuda K., Semenza G.L. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 40. P. 41521-41528.
29. Epstein A.C., Gleadle J.M., McNeill L.A., Hewitson K.S., O'Rourke J., Mole D.R., Mukherji M., Metzen E., Wilson M.I., Dhanda A., et al. // Cell. 2001. V. 107. № 1. P. 43-54.
30. Yuan Y., Hilliard G., Ferguson T., Millhorn D.E. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 18. P. 15911-15916.
31. Ma X., Wang X, Cao J., Geng Z., Wang Z. // PLoS One. 2014. V. 9. № 4. e95692.
32. Бойко С.С., Жердев В.П., Дворянинов А.А., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Воронина Т.А., Розанцев Г.Г., Середенин С.Б. // Эксп. клин. фармакология. 1997. Т. 60. № 2. С. 101-104.
33. Gudasheva T.A., Boyko S.S., Akparov V.Kh., Ostrovskaya R.U., Skoldinov S.P., Rozantsev G.G., Voronina T.A., Zherdev V.P., Seredenin S.B. // FEBS Lett. 1996. V. 391. P. 149-151.
34. Федорова Т.Н., Ус К.С., Островская Р.У. // Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 1. С. 69-73.
35. Андреева Н.А., Стемальшук Е.В., Исаев Н.К., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Викторов И.В. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2000. Т. 130. № 10. С. 418-421.
36. Zhang Z., Yan J., Chang Y., ShiDu Yan S., Shi H. // Curr. Med. Chem. 2011. V. 18. № 28. P. 4335-4343.
37. Фирова Ф.А. Спектр нейротропной активности оригинального замещенного пролил-дипептида ГВС-111: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М.: Ин-т фармакологии РАМН, 1994.
38. Ostrovskaya R.U., Vakhitova Y.V., Kuzmina U.Sh., Salimga-reeva M., Zainullina L.F., Gudasheva T.A., Vakhitov V.A.,
Seredenin S.B. // J. Biomed. Sci. 2014. V. 21. P. 74-82.
39. Jia X., Gharibyan A., Ohman A., Liu Y., Olofsson A., Morozo-va-Roche L.A. // J. Mol. Biol. 2011. V. 414. P. 699-712.
40. Лысенко А.В., Ускова Н.И., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А. // Эксп. клин. фармакология. 1997. Т. 60. № 3. С. 15-18.
41. Ostrovskaya R.U., Gruden M.A., Bobkova N.A., Sewell R.D.E., Gudasheva T.A., Samokhin A.N., Seredenin S.B., Noppe W., Sherstnev V.V., Morozova-Roche L.A. // J. Psycho-pharmacol. 2007. V. 21. P. 611-619.
42. Островская Р.У., Цаплина А.П., Вахитова Ю.В., Салим-гареева М.Х., Ямиданов Р.С. // Эксп. клин. фармакология. 2010. Т. 73. № 1. С. 2-6.
43. Островская Р.У., Озерова И.В., Гудашева Т.А., Капица И.Г., Иванова Е.А., Воронина Т.А., Середенин С.Б. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2013. Т. 156. № 9. С. 317-321.
44. Островская Р.У., Золотов Н.Н., Озерова И.В., Иванова Е.А., Капица И.Г., Тарабан К.В., Мичунская А.Б., Воронина Т.А., Гудашева Т.А., Середенин С.Б. // Бюл. эксп. биол. и мед. 2014. Т. 157. № 3. С. 321-327.
45. Cheng K., Ho K., Stokes R., Scott C., Lau S.M., Hawthorne W.J., O'Connell P.J., Loudovaris T., Kay T.W., Kulkarni R.N., et al. // J. Clin. Invest. 2010. V. 120. № 6. P. 2171-2183
46. Liu Y., Liu F., Iqbal K., Grundke-Iqbal I., Gong C.X. // FEBS Lett. 2008. V. 582. P. 359-364.
47. van de Velde S., Hogan M.F., Montminy M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 41. P. 16876-16882.
