CC BY
70
Н. П. Евлампиева, А. В. Добродумов, О. В. Окатова, Э. Коттэ
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИЛИЗИНОВ ДЕНДРИТНОЙ АРХИТЕКТУРЫ
Введение. Дендримерная, или дендримероподобная, архитектура полимерных молекул имеет ряд преимуществ в сравнении с полимерами традиционной линейной структуры, поскольку позволяет в значительно большей степени контролировать топологию, объём, форму, гидродинамические размеры и поверхностные свойства макромолекул. В последние годы число полимеров, молекулы которых обладают дендритной архитектурой, постоянно росло за счёт синтеза дендримеров новой химической структуры и создания дендритных аналогов известных полимеров. Актуальность подобных преобразований макромолекулярной архитектуры во многом связана с запросами современных нано- и биотехнологий, требующих полного контроля свойств на уровне отдельных молекул. При синтезе дендримеров подобные задачи специальным образом решаются за счёт процедур защиты от случайных процессов, и поэтому сама стратегия синтеза позволяет задавать необходимую топологию и получать макромолекулы необходимой плотности, массы и формы [1]. Но эти параметры, как правило, трудно контролировать для статистически свёрнутых цепей линейных макромолекул. Отмеченные выше тенденции проявились и в области синтеза биомолекул, в частности в области синтеза синтетических полиаминокислот и полипептидов, которые имеют широчайшее применение в современной медицине, фармакологии, косметологии и пищевой промышленности.
В представляемой работе исследовано гидродинамическое поведение поли-Ь-лизи-нов новой дендритной архитектуры, синтез которых был разработан французскими химиками [2]. Особенностями методики синтеза этих биополимеров является использование неточечного центра ветвления и стратегии формирования генераций по принципу графт-присоединения. Каждая генерация является исходной для синтеза последующей генерации. Отмеченные особенности синтеза позволили авторам методики классифицировать полученные образцы как дендриграфты поли-Ь-лизина (ДПЛ) [2]. Схематично структура исследованных образцов приведена на рис. 1, где каждая точка соответствует одной лизиновой единице.
Были исследованы четыре последовательных генерации ДПЛ в двух водных буферных системах и апротонном растворителе — диметилформамиде методами вискозиметрии [3], поступательной изотермической диффузии [3], тейлоровской дисперсии [4] и 1Н ЯМР [5]. В задачи работы входило определение коэффициентов поступательной диффузии и гидродинамических размеров молекул ДПЛ в разных растворителях, определение скейлинговых соотношений между гидродинамическими характеристиками ДПЛ и их молекулярной массой, а также сопоставление гидродинамических свойств ДПЛ и дендримеров сходной химической структуры.
Экспериментальная часть. Поступательную диффузию макромолекул в разбавленных растворах можно изучать различными методами, однако только для частиц сферической формы (к которым можно отнести дендримероподобные молекулы) обычно наблюдается совпадение измеряемых коэффициентов поступательной диффузии Б [6]. В работе использованы два традиционных метода — поступательной диффузии
© Н. П. Евлампиева, А. В. Добродумов, О. В. Окатова, Э. Коттэ, 2011
CO;
G1
G3
G4
Рис. 1. Химическая структура молекул ДЛП первой (G1), второй (G2), третьей (G3) и четвёртой (G4) генераций в схематичном представлении: каждая точка соответствует группе
-NH—GH— (GH2)4-NH2 -0=0
в диффузометре Цветкова [3] и 1Н ЯМР в градиенте напряженности магнитного поля [5], а также один менее известный — метод тэйлоровской дисперсии [4]. Обращение к последнему связано с возможностью одновременно с измерением коэффициентов D определять среднее число лизиновых групп в молекулах ДПЛ по интенсивности поглощения в УФ-области, что позволяла делать использованная методика. Исследование методом тейлоровской дисперсии проведено в фосфатном буфере при рН = 4,5 и ионной силе 0,6M. Протонный ЯМР в растворах ДПЛ в тяжёлой воде с добавлением соли D2O + 0,2M NaCl исследовали на импульсном ЯМР-спектрометре Bruker Avance 300, измерения были проведены в интервале температур 298-315 K (рис. 2). Поступательную изотермичесую диффузию в диффузометре Цветкова изучали в растворах ДПЛ в ДМФ при 298 К. На рис. 3 приведены зависимости дисперсии о2 диффузионных кривых от времени t, из наклона которых определяли коэффициенты D.
Коэффициент поступательной дифузии D использовали для определения гидродинамического диаметра dh молекул, поскольку для частиц сферической формы справедливо соотношение Стокса—Эйнштейна (см. [3])
dh
кТ 3n^oD ’
(1)
Рис. 2. 1H ЯМР спектр ДПЛ третьей генерации в D2O + 0,2М МаС1: максимум спектра при 4,26 м.д. соответствует протонам группы -СО—СН—ГШ-
I
максимум при 3,13 м.д. группе -СН2 —NH—СО-; максимум при 2,93 м.д. относится к концевым группам —СН2 — NH+; остальные максимумы относятся к алифатическим группам —(СН2)П—; температурную зависимость основных сигналов при 2,93 м.д. и 4,26 м.д. использовали для определения коэффициентов самодиффузии молекул ДПЛ
Рис. 3. Зависимость дисперсии диффузионной кривой а2 от времени для ДПЛ разных генераций в ДМФ при концентрации 0,04х 10~2 г-см~3 и Т = 298 К, номер прямой соответствует номеру генерации:
значение дисперсии было определено методом максимальной ординаты и площади под диффузионной кривой [3]
где к — постоянная Больцмана; Т — абсолютная температура; по — вязкость растворителя.
Характеристическую вязкость [п] растворов ДПЛ определяли только в D2O + + 0,2М ^С1 при 298 К в вискозиметре Оствальда, в котором время течения растворителя составляло 120,5 ± 0,05 с.
Результаты и их обсуждение. В таблице приведены коэффициенты поступательной диффузии Б и рассчитанные по формуле (1) гидродинамические размеры молекул ДПЛ, полученные разными методами в двух водных растворителях и ДМФ.
Степень полимеризации (N), коэффициент поступательной диффузии (_0) и гидродинамический диаметр (^) молекул ДПЛ в разных растворителях
Номер генерации
1 2 3 4
м* 8 48 123 365
Диметилс юрмамид (ДМФ)
Б** х 107, см2с 1 35,4 32,7 22,0 12,3
йи х 108, см 15,5 16,8 24,9 44,6
D2O+0,2M Ш01
£)*** х 107, см2с 1 17,30 9,92 6,23 4,77
йи х 108, см 21,0 36,7 58,4 77,6
«4(Б20 + 0,2М ШС1) (ДМФ) 1,4 2,2 2,3 1,8
Фосфатный буфер****
В* х 107, см2с 1 20,98 11,3 7,06 5,86
гі/г х 108, см 20,6 39,2 61,2 73,8
* Число мономерных единиц лизина в составе образцов определено методом тейлоровской диспер-
сии.
** Определено методом поступательной диффузии в диффузометре Цветкова.
*** Определено 1Н ЯМР.
**** Растворитель приготовлен растворением в дистиллированной воде 50 г • л~1 соли ^РО^^а+ (рН = 4,5, ионная сила 0,6М).
ДПЛ, как и линейные полилизины, являются поликатионами, поскольку в водной среде каждая их аминогруппа приобретает положительный заряд за счёт протонирования. Изучение гидродинамических свойств ДПЛ в фосфатных буферах различного состава в интервале рН от 4,5 до 7 при вариации ионной силы показало отсутствие заметной зависимости размеров молекул ДПЛ от природы противоионов, их концентрации и рН среды [7]. Полученные нами данные подтверждают это свойство молекул ДПЛ. Как следует из таблицы, в буферном растворителе D2O + 0,2М ^С1 и в фосфатном буфере более сложного состава гидродинамический диаметр молекул ДПЛ имеет близкие значения для всех генераций. Причём определённое нами значение хорошо соответствует полученным ранее оценкам размеров этих молекул в других водных системах [7]. Таким образом, в заряженном состоянии в условиях полного подавления полиэлектролитного эффекта размеры молекул ДПЛ близки и практически не зависят от состава растворителя. Факт постоянства размеров молекул ДПЛ в заряженном состоянии также свидетельствует и об однородности состава образцов ДПЛ, поскольку коэффициенты диффузии, по которым оценивали размеры молекул, были определены различными экспериментальными методами, базирующимися на разных типах усреднения измеряемых параметров.
В то же время размеры молекул ДПЛ в ДМФ существенно отличаются от их размеров в водных растворителях. Приведённое в таблице отношение показывает, что молекулы всех генераций ДПЛ в ДМФ примерно в два раза компактнее, чем в буферных растворителях.
Одной из очевидных причин такого различия следует признать то, что в ДМФ молекулы ДПЛ не заряжены, поскольку ДМФ является для них апротонным растворителем. Отталкивание одноименно заряженных групп ДПЛ в водных средах должно
приводить к увеличению их молекулярных размеров в сравнении с условиями в ДМФ, где электростатическое отталкивание аминогрупп отсутствует.
Однако для ДПЛ можно указать и ещё на одну причину их компактизации в ДМФ, специфическую для молекул данной архитектуры.
Как следует из химической структуры первой генерации ДПЛ (см. рис. 1), «ядро» рассматриваемых молекул представляет собой цепь, состоящую из восьми единиц L-лизина. Для таких стереорегулярных цепей характерны спиральные конформации, которые обычно более свёрнуты и легче реализуемы в незаряженном состоянии полиэлектролита [3]. Таким образом, спирализацию «ядра» поли-L-лизина в составе молекул ДПЛ в ДМФ можно рассматривать как дополнительный механизм, отвечающий за компактизацию этих молекул в незаряженном состоянии.
Общая тенденция для молекул дендримеров, имеющих заряженные концевые группы, изменять конформацию и положение своих концевых групп в зависимости от заряда на этих группах, была предсказана теоретически для дендримеров с одно- и двухточечным центром ветвления [8]. Методом молекулярной динамики показано, что если заряд концевых групп уменьшается, то возможно проникновение концевых групп в дендритную матрицу, что должно сокращать размеры молекул дендримеров [8]. Однако для классических дендримеров типа диамибутановых (DAB) или полиамидо-аминовых (PAMAM) [1, 9, 10], имеющих топологию, сходную с рассмотренной в работе [8], не было отмечено столь существенного изменения размеров молекул в разных растворителях, как было обнаружено для ДПЛ. Более того, например, для дендримеров разных генераций РАМАМ по результатам исследования методом малоуглового нейтронного рассеяния был сделан вывод об инвариантности их размеров относительно рН-усло-вий [11].
Таким образом, дендриграфты поли-L-лизина, в отличие от классических дендри-меров с одно- или двухточечным центром ветвления, проявляют существенную зависимость молекулярных размеров от свойств растворителя. Ядро второй и последующих генераций ДПЛ, если сравнивать их с DAB или PAMAM, не есть точечный центр. Графтированная структура «ядра» ДПЛ диктует иную топологическою организацию их молекул. В отличие от классических дендримеров ДПЛ более асимметричны и не обладают столь регулярной структурой. Другими словами, дендриграфты не так совершенны, как дендримеры. Более того, можно отметить, что в сравнении с DAB или РАМАМ, концевые группы которых в основном сосредоточены на периферии дендритной матрицы, концевые аминогруппы ДПЛ могут находиться и внутри молекул. Это может быть причиной внедрения противоионов буферных растворов внутрь молекул ДПЛ, что тоже может способствовать увеличению их размеров в водных средах.
Обобщая сказанное, сделаем заключение, что дендриграфты полилизина можно считать одной из наиболее эластичных дедритных матриц среди тех, которые уже нашли сегодня применение в биотехнологиях. Установленная в данной работе способность ДПЛ молекул в два раза изменять свои размеры при переходе от ДМФ к водным растворителям может быть использована для эффективного инкапсулирова-ния/декапсулирования малых молекул в фармакологии, для разработки новых вакцин и т. п.
Для полимеров, составляющих гомологическую серию, всегда важно иметь соотношения, связывающие их характеристики с молекулярной массой, — соотношения Марка—Куна—Хаувинка или скейлинговые соотношения [3]. Во-первых, определение скей-линговых соотношений в разных растворителях всегда полезно с практической точки зрения, а во-вторых, такие соотношения могут быть сопоставлены с аналогичными
ln D -4 -
ln [n]
1,2
- 0,4
■5
6
Рис. 4- Зависимости коэффициента поступательной диффузии (Д) в разных растворителях и характеристической вязкости [п] в D2O+0,2M МаС1 от молекулярной массы (М) для образцов ДПЛ в двойном логарифмическом масштабе
• D2O + 0,2M NaCl
3
4
5
ln M
соотношениями для дендримеров, что может быть полезно для выявления специфических свойств дендригафтов в сравнении с дендримерами.
На рис. 4 в логарифмическом масштабе приведены зависимости коэффициентов поступательной диффузии Б и характеристической вязкости [п] от М молекул ДПЛ в двух растворителях. Молекулярную массу ДПЛ разных генераций рассчитывали с учётом массы лизина 128 г • моль-1 и средней степени полимеризации N, определённой для исследованных образцов методом тейлоровской дисперсии (см. таблицу). Из представленных графических построений получены скейлинговые соотношения для коэффициентов поступательной диффузии
Показатели степени в соотношениях (2) близки по величине, отличие имеет порядок экспериментального разброса. Такое совпадение показателей степени в соотношениях Марка—Куна—Хаувинка в разных растворителях позволяет предполагать возможность гомотетичного изменения молекул ДПЛ при изменении среды. Но эта гипотеза нуждается в подтверждении другими методами, так как гидродинамика не может дать однозначной информации о форме молекул, основываясь только на данных об их поступательной диффузии. Можно отметить, что такой тип изменения показателя степени у М в скейлинговых соотношениях (2) в столь разных по свойствам растворителях сильно отличается от линейных по структуре полимеров, для которых показатель степени очень чувствителен к термодинамическому качеству растворителя и, как правило, значительно (иногда в разы) меняется при переходе от одного растворителя к друго-
Если же сопоставить полученные для ДПЛ соотношения (2) с соответствующими соотношениями для дендримеров, например PAMAM в метаноле [9, 13], PAMAM, модифицированного карбогидратными концевыми группами [14], или DAB, модифицированного концевыми лактозными группами [15] в водных растворителях, то можно заключить, что показатели степени в них близки и варьируются от 0,25 до 0,37 [13-15]. Можно сказать, что эта характеристика для разной структуры дендримеров в разных растворителях практически всегда близка к 0,3. Учитывая, что значение показателя 0,33 в скейлинговом соотношении для коэффициента поступательной диффузии было теоретически предсказано для гомогенных непроницаемых сфер [12], можно сделать
D = 4,12 • 10~5М-°,30±°,07 (ДМФ),
D = 2,24 • 10~5М-°,35±°,03 (D2O + 0,2M NaCl).
(2)
му [3, 12].
заключение о том, что дендриграфты и дендримеры ведут себя сходным образом в поступательной диффузии.
Для молекул, гидродинамические свойства которых описываются моделью однородных непроницаемых частиц сферической формы, теория [12] предсказывает, что в соотношении Марка—Куна—Хаувинка для характеристической вязкости [n] ~ Ma скейлинговый индекс должен быть равен нулю. Однако в реальности для многих дендримеров и их производных a = 0, и, более того, иногда зависимость [n] от молекулярной массы в ряду генераций одного дендримера может быть даже немонотонной [1].
Для исследованного ряда генераций ДПЛ в D2O + 0,2M NaCl характеристическая вязкость увеличивалась с увеличением номера генерации. Было получено скейлинговое соотношение
[n] = 2,01 • M 0-12±0-01. (3)
Явное противоречие в гидродинамических свойствах дендримеров, молекулы которых в растворе при поступательном движении ведут себя подобно непроницаемым сферам, но в то же время иначе проявляют себя в отношении вязкостных свойств, обычно принято рассматривать как проявление гибкости молекулами дендритной структуры и доказательством того факта, что дендримеры всё-таки скорее макромолекулы, чем наночастицы [1].
В заключение отметим, что гидродинамические свойства исследованных образцов ДПЛ различных генераций можно считать полностью подобными свойствам высокомолекулярных дендримеров, имеющих диссоциирующие или протонирующиеся в водных растворах концевые группы. Несмотря на различия в химической структуре, дендриграфты полилизина и такие дендримеры, как производные DAB- или PAMAM демонстрируют очень сходное поведение в поступательном трении и в вязком течении растворов, которое зависит не только от поступательного, но и вращательного трения молекул.
Зависимость размеров молекул дендриграфтов от свойств растворителя, о которой речь шла вначале, можно рассматривать как наиболее значительное их отличие от дендримеров. Полезно привести также следующее сопоставление: размеры молекул ДПЛ в ДМФ (см. таблицу) соответствуют размерам классической матрицы РАМАМ той же генерации (например, в метаноле; см. [13]), но при этом их молекулярные массы различаются более чем вдвое. Следовательно, матрица ДПЛ в ДМФ является более плотной, чем РАМАМ, и может быть более эффективным инкапсулятором низкомолекулярных соединений.
Литература
1. Dendrimers and Other Dendriric Polymers / ed. by J. M. J. Frechet, D. A. Tomalia. West Sussex, UK, 2001. 688 p.
2. Collet H., SouaidE., Cottet H. et al. An expenditious multigram-scale synthesis of lysine dendrigraft polymers by aqueous N-carboxyanhydride polycondensation // Chem. Eur. J. 2010. Vol. 16. P. 2309-2316.
3. Цветков В. Н. Жёсткоцепные полимерные молекулы. Л., 1986. 379 с.
4. Cottet H., BironJ.-Ph., CipelletiL. et al. Determination of individual diffision coefficients in evolving binary mixtures by Taylor dispersion analysis // Anal. Chem. 2010. Vol. 82. P. 1793-1802.
5. Hrovat M. I., Wade C. G. NMR pulsed gradient diffusion measurements // J. Magn. Res. 1981. Vol. 44. P. 62-75.
6. Нефёдов П. П., Лавренко П. Н. Транспортные методы в аналитической химии. Л., 1981. 232 с.
7. Cottet H., Martin M., Papillaud A. et al. Determination of dendrigraft poly-L-lysine diffusion coefficients by Taylor dispersion analysis // Biomacromolecules. 2007. Vol. 8. P. 3235-3243.
8. LyulinS. V., Darinskii A. A., LyulinA. V., Michels M. A. J. Computer simulation of the dynamics of neutral and charged dendrimers // Macromolecules. 2004. Vol. 37. P. 4676-4685.
9. ToppA., Bauer B. J., Tomalia D. A., Amis E. J. Effect of solvent quality on the molecular dimensions of PAMAM dendrimers // Macromolecules. 1999. Vol. 32. P. 7232-7237.
10. RamziA., Scherrenberg R., JoostenJ. et al. Structure-properties ralations in dendritic polyelectrolyte solutions at different ionic strength // Macromolecules. 2002. Vol. 35. P. 827-833.
11. Nisato G., IvkovR., Amis A. J. Size invariance of polyelectrolyte dendrimers // Macromolecules. 2000. Vol. 33. P. 4172-4176.
12. Флори П. Статистическая механика цепных молекул. М., 1971. 440 с.
13. Павлов Г. М., Корнеева Е. В., Roy R. Сравнительное изучение гидродинамических ха-
рактеристик молекул исходных полиамидоаминов и лакто-полиамидоаминовых дендриме-ров // Журн. прикл. химии. 2000. Т. 73. № 11. С. 1886-1889.
14. Павлов Г. М., ЭррингтонН., Хардинг С. Е. и др. Молекулярные и структурные характеристики лактодендримеров на основе полиамидоамина // Высокомолек. соед. (A). 2001. Т. 43. С. 118-124.
15. Pavlov G. M., Korneeva E. V., JumelK. et al. Hydrodynamic properties of carbohydrate-
coated dendrimers // Carbohydr. Polym. 1999. Vol. 38. P. 195-202.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
