CC BY
46
УДК: 616.24-006.6 : 575.113: 577.31] - 092.4.9
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЭФФЕКТА Д-ГЛЮКУРОНИЛ С5-ЭПИМЕРАЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ РАКА ЛЕГКОГО IN VIVO
Л.А. Мостович1, Т.Ю. Прудникова1, Н.В. Доманицкая1, Н.Е. Вержбицкая2, О.В. Харченко3, Г.И. Непомнящих4, С.В. Айдагулова4, В.И. Рыкова5 ,
Э.В. Григорьева1
Институт молекулярной биологии и биофизики СО рАМН, г. Новосибирск1 Областное патологоанатомическое бюро, г. Кемерово2 Институт физиологии им. Павлова, г. Санкт-Петербург3 Институт региональной патологии и патоморфологии СО рАМН, г. Новосибирск4 Институт цитологии и генетики СО рАН, г. Новосибирск5 630117, г. Новосибирск, ул. тимакова, 2; e-mail: mostovich_l@yahoo.com1
Изучено влияние эктопической экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей мелкоклеточного рака легкого человека у мышей линии SCID. Исследование показало, что экспрессия эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легких U2020 значительно ингибирует рост опухолей у экспериментальных животных, тогда как в растущих опухолях экспрессия эпимеразы почти не наблюдается. С помощью набора реактивов Cancer PathF inder RT Profiler PCR, позволяющего оценить экспрессию 84 генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, был проведен анализ возможных молекулярных механизмов действия эпимеразы in vivo. Результаты показали, что экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы связана с молекулярными путями ангиогенеза и апоптоза. Таким образом, инактивация эпимеразы в растущих экспериментальных опухолях является важным звеном в процессе развития рака, что дает возможность рассматривать D-глюкуронил С5-эпимеразу в качестве потенциального регулятора клеточной пролиферации и роста опухолей и возможную основу для создания новых препаратов для генотерапии мелкоклеточного рака легкого.
Ключевые слова: Д-глюкуронил С5-эпимераза, экспрессия, опухоль, супрессия, молекулярный механизм.
MOLECULAR MECHANISMS OF ANTI-TUMOR EFFECT 0F D-GLUCURONIL-C5-EPIMERASE IN EXPERIMENTAL LUNG CANCER MODELS IN VIVO
L.A. Mostovich1, T. Yu. Prudnikova1, N.V Domanitskaya1, N.E. Verzhbitskaya2, O.V. Kharchenko3, G.I. Nepomnyaschikh4,
S.V. Aidagulova4, V.I. Rykova5, E.V Grigoryeva1 Institute of Molecular Biology and Physics, SB RAMS, Novosibirsk1 Regional Pathologoanatomic Bureau, Kemerovo2 Pavlov Institute of Physiology, St-Petersburg3 Institute of Regional Pathology and Pathomorphology, SB RAMS, Novosibirsk4 Institute of Cytogenetics and Genetics, Novosibirsk5 2, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, e/mail: mostovich_l@yahoo.com1
The effect of ectopic expression of D-glucuronil C5-epimerase gene on the growth of experimental small-cell lung cancer tumors in SCID-line mice was studied. The study showed that epimerase expression in small-cell lung cancer cells U2020 significantly inhibited the tumor growth in experimental animals, whereas epimerase expression was not nearly observed in growing tumors. The analysis of possible molecular mechanisms of epimerase activity in vivo was carried out using the Cancer PathFinder RT Profiles PCR reagent set allowing the assessment of expression of 84 genes involved into carcinogenesis. The results showed relation of D-glucuronil C5-epimerase expression with molecular pathways of angiogenesis and apoptosis. Thus, epimerase inactivation in growing experimental tumors is the important link in the process of cancer development, that makes it possible to consider D-glucuronil C5-epimerase as a potential regulator of cell proliferation and tumor growth and as a basis for producing new agents for genotherapy of small-cell lung cancer.
Key words: D-glucuronil C5-epimerase, expression, tumor, suppression, molecular mechanism.
Д-глюкуронил С5-эпимераза (GLCE) является одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) - сложных белково-углеводных молекул, локализованных на поверхности клеток и во внеклеточном матриксе (ВКМ). ГСПГ играют существенную роль в межклеточных взаимодействиях и взаимодействии клеток с ВКМ, принимают участие в передаче сигнальной информации и механизмах действия факторов роста и других сигнальных молекул [13]. ГСПГ необходимы для нормального клеточного роста и развития, изменения их состава и/или структуры приводят к различным патологическим процессам, в том числе раку [2, 12]. Во многих случаях именно структура углеводных цепей гепарансульфатов (ГС) определяет функциональную активность молекулы протеогликана, и изучение механизма биосинтеза гепарансульфатов является очень актуальной задачей, так как его дефекты будут влиять на структуру и функции всех клеточных ГСПГ [15].
Поскольку D-глюкуронил C5-эпимераза является одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфатов, определяющим все последующие модификации углеводной цепи, нарушение ее функциональной активности и, соответственно, структуры всех синтезируемых клеткой ГС может приводить к различным патологиям. Однако в течение длительного времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза протеогликанов. Было показано его участие в процессах биосинтеза гепарансульфатов [3] и дерматансульфатов [14], изучена субстратная специфичность и проведены исследования кинетических свойств [6] и механизма эпимеризации [7, 8]. Ген D-глюкуронил-C5-эпимеразы был клонирован для легкого быка [9], печени мышей [10] и мышиной мастоцитомы [4], и показано, что его направленное разрушение у мышей приводило к летальному фенотипу с дефектом легких, почек и нарушениями скелета [11]. Хотя эти данные убедительно свидетельствуют о высокой важности D-глюкуронил-C5-эпимеразы для жизнедеятельности организма, до самого последнего времени не проводилось исследований функциональной роли эпимеразы в злокачественных процессах. Нами было высказано предположение о воз-
можном участии D-глюкуронил-C5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации и получены первые данные о снижении уровня экспрессии эпимеразы в опухолях молочной железы человека [1, 5].
В данной работе было изучено влияние эктопической экспрессии гена D-глюкуронил C5-эпимеразы на рост экспериментальных опухолей мелкоклеточного рака легкого человека у мышей линии SCID и проведен анализ возможных молекулярных механизмов действия эпимеразы in vivo.
Материал и методы
Клеточная линия мелкоклеточного рака легкого человека U2020 была получена из Каролинского Института (Стокгольм, Швеция). Клетки поддерживали в среде IMDM, еодержащей 2мМ L-глутамина, 100 ед./пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 % (v/v) телячьей эмбриональной сыворотки в инкубаторе при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5 % CC2. Для анализа получали взвесь клеток по стандартному протоколу с использованием смеси трипсин/ ЭДТА.
Анализ экспрессии GLCE методом
обратно-транскриптазией (ОТ) ПЦР
Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA) в соответствии с инструкцией производителя. Синтез кДНК из
1-2 мкг общей РНК проводили с помощью First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Hanover, MD, USA) согласно инструкции производителя. Мультиплексную ПЦР проводили в амплифика-торе Терцик (ДНК-технология, Россия) в объеме 20 мкл (~200 нг кДНК, 2 мкл 10 х ПЦР-буфера 10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3, 5 пмоль каждого праймера, 0,2 ммоль каждого dNTP и 1 ед. Taq-полимеразы). Условия ПЦР: 95°C - 10 мин, 95°C - 15 сек, 59°C - 15 сек и 72°C - 1 мин с конечной стадией элонгации при 72°C - 10 мин; 32 цикла для GAPDH и 20 для GLCE. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,2 % агарозном геле, для визуализации была использована система «DNA Analyzer» (Москва, Россия). Уровень экспрессии GLCE оценивался как отношение интенсивностей амплифицированных
фрагментов ДНК GLCE и GAPDH (TotalLab Frogramme, Nonlinear Dynamics, UK).
В работе использовали праймеры: GLCE-F, 5'-AAGGGAGACGAGA GGGGAACGAA-3'; GLCE-R, 5'GCCAC-CTTTCTCATCCTGGTTC-3'; GAPDH-F, 5'-GGGCGCCTGGTCACAA-3';GAPDH-R,5'-AAC ATGGGGGCATCAGCAGA-3'.
Количественный ОТ-ПЦР в реальном времени был проведен с использованием BioRad IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (BioRad) и Custom GLCE TaqMan Assay (Applied Biosystems) при следующих условиях: 95°C 3 мин, 40 циклов 95°C 10 сек и 60°C 30 сек. Общий реакционный объем составил 25 мкл. В качестве гена домашнего хозяйства использовали Р-актин. Праймеры ПЦР и TaqMan-зонды: GLCE-F, 5'-TTCCAAAGTCTATGCACAGA-GAGC-3'; GLCE-R, 5'-TCCACATTGTAGCCT-TCAAAAGACA-3'; GLCE-зонд, 5'-FAM-CCCC TATC ACCCCGATGGT-TAMRA-3 '; Р-актин-F, 5'-GGCACCCAGCACAA TGAAG-3', р-актин-R, 5'-GCCGATCCA-CACGGAGTACT-3', р-актин-зонд, 5'-FAM-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMRA-3'.
Рост опухоли in vivo
у мышей линии SCID
Клетки U2020, стабильно трансфецирован-ные плазмидой pETE-Bsd (pETE-U2020) или плазмидой epi-pETE-Bsd (epi-U2020), осаждали при 800 rpm в течение 2 мин, суспендировали в 100 мкл среды IMDM, не содержащей сыворотку, и смешивали с Матригелем согласно инструкции производителя (BD Biosciences, Belgium). Суспензию клеток вводили мышам линии SCID (возраст 6-8 нед) из расчета 2-3 х 106 клеток на животное. Наблюдения за формированием опухолей проводились дважды в неделю в течение 35 дней, выросшие опухоли были использованы для определения уровня экспрессии эпимеразы методами ОТ-ПЦР и иммуногистохимического анализа.
Иммуногистохимический анализ
Иммунохимическое окрашивание парафиновых срезов проводили при помощи системы ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC Standard
Peroxidase Staining Kit (Pierce, США) согласно инструкции производителя. Срезы депарафи-нировали, блокировали и инкубировали 30 мин с первичными антителами (rabbit anti-human epimerase, 1:200), затем 15 мин с вторичными антителами (sheep anti-rabbit, 1:2000) при комнатной температуре. В качестве субстрата использовали ДАБ, окрашивание проводили 5-15 мин при комнатной температуре, промывали буфером, окрашивали гематоксилином в течение 2 мин и анализировали на микроскопе Axiostar Plus (Carl Zeiss).
Анализ возможных молекулярных механизмов биологического эффекта эпимеразы
Для определения возможных механизмов действия гена использовали набор реактивов Cancer PathFinder RT2 Profiler™ PCR Array (SABioscience, Frederick, MD, USA). Суммарную РНК выделяли с использованием RNAqueous Micro Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) согласно инструкции производителя, концентрацию РНК оценивали с помощью набора реактивов Quant-iT Assay Kit для количественного определения РНК на приборе Qubit (Invitrogen, USA), качество оценивали с помощью электрофореза. кДНК была синтезирована из 1-2 мкг общей РНК с использованием набора реактивов First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Hanover, MD). ПЦР в реальном времени проводили в соответствии с руководством пользователя RT2 Profiler PCR Array System, используя SYBR Green PCR Master Mix (Fermentas, Hanover, MD) в iCycler iQ5 Multicolor Detection System (Bio-Rad, USA). Полученные результаты анализировали программой Excel-based PCR Array Data Analysis Software (SABioscience).
Результаты и обсуждение
Для изучения влияния D-глюкуронил-C5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей in vivo иммунодефицитным мышам линии SCID были инокулированы опухолевые клетки мелкоклеточного рака легкого человека U2020, стабильно трансфецированные плазмидой epi-pETE\Bsd (epi-U2020, клоны 4, 7 и 8), способные к экспрессии эпимеразы. В качестве контроля использованы клетки, несущие пустой вектор - pETE-U2020. У группы
мышей, инокулированных клетками ерьи2020. рост опухолей не наблюдался совсем или был медленнее, чем в контрольной группе (рис. 1А). В течение 31-35 дней солидные опухоли были выявлены у 5 из 6 мышей, инокулированных контрольными клетками рЕТЕ-и2020 (контрольные опухоли), тогда как только у 5 из 10 мышей, инокулированных клетками ерьи2020. отмечено образование опухолей, сопоставимых по размеру и скорости роста с контрольными (рис. 1Б).
У остальных мышей в местах инокуляции отмечено наличие опухолеподобного образования, соответствующего по объему исходному количеству введенных опухолевых клеток («опухолевое тельце», ОТ). Нас заинтересовало
такое различие в скорости формирования экспериментальных опухолей, и была поставлена задача сравнить их в плане экспрессии гена эпимеразы и ключевых молекул канцерогенеза. Для этого все опухоли и опухолевые тельца были подвергнуты эксплантации, после чего в них была определена экспрессия эпимеразы методом мультиплексной ОТ-ПЦР Несмотря на то, что исходные клетки обладали эктопическим уровнем экспрессии эпимеразы, сравнимым с уровнем нормальной легочной ткани, во всех опухолевых образцах ерьШ020 экспрессия эпимеразы практически не определялась (рис. 1В). Данные, полученные с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР, были подтверждены количественной ОТ-ПЦР в реальном времени,
Рис. 1. А, Б - влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей у иммунодефицитных мышей
линии SCID
I - экспрессия эпимеразы в экспериментальных опухолях. Электрофореграмма мультиплексной ОТ-ПЦР и относительная экспрессия гена эпимеразы по отношению к GAPDH; К - клетки, использованные для инокуляции; О - выросшие из них опухоли,
ОТ - «опухолевые тельца». Подписи на графике соответствуют дорожкам на электрофореграмме;
Г - иммуногистохимический aнализ экспериментальных опухолей
2S
оценка экспрессии D-глюкуронилC5-эпимерaзы в первичных клетках показала 72Q-96Q молекул эпимерaзы/1000 молекул GAPDH и почти полное отсутствие экспрессии в образцах опухолей. Экспрессия эпимеразы в «опухолевых тельцах» была сравнима с экспрессией в первичных клетках epi-U2Q2Q (рис. 1В). Иммуногистохи-мический анализ также показал наличие экспрессии эпимеразы в «опухолевых тельцах» и ее отсутствие в выросших экспериментальных опухолях epi-U2Q2Q (рис. 1Г).
Полученный результат свидетельствует о том, что D-глюкуронил C5-эпимерaзa обладает свойствами гена-супрессора развития опухоли и ее инактивация является необходимым условием развития экспериментальных опухолей. Чтобы определить возможные молекулярные механизмы противоопухолевого эффекта эпиме-разы для мелкоклеточного рака легкого in vivo, мы использовали систему Cancer PathFinder RT Profiler PCR Array (SABiosciences). Она основана на одновременном определении уровня экспрессии S4 генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза и относящихся к 6 различным
молекулярным механизмам (регуляция клеточного цикла, передача сигнальной информации, апоптоз, ангиогенез, адгезия, инвазия и метаста-зирование). Уровень экспрессии каждого из 84 тестовых генов определяется в экспериментальном и контрольном образцах, и его изменение говорит о возможном участии исследуемого гена (в нашем случае D-глюкуронил С5-эпимеразы) в молекулярном механизме канцерогенеза, связанном с этим тестовым геном.
В данном случае было проведено сравнение относительных уровней экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза, в «опухолевых тельцах» (эпимераза экспрессируется) и выросших экспериментальных опухолях epi-U2020 (эпимераза инактивирована) (рис. 2). Согласно полученным данным, эктопическая экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в клетках epi-U2020 приводила к тому, что их инокуляция мышам SCID не приводила к развитию опухоли. Эти клетки характеризовались повышенной экспрессией генов IGF1 (в 273 раза), HTATIP2 (54 раза), BCL2 (31 раз), TNF (25,7 раза), RB1 (9,2 раза) и TNFRSF6 (8,4 раза).
Рис. 2. Изменение экспрессии генов в «опухолевых тельцах» (группа 1) относительно выросших опухолей ер1-и2020 (группа 2). Диагональ на графике соответствует одинаковой экспрессии гена в экспериментальном и контрольном образцах, параллельные прямые ограничивают зону 2-кратного изменения уровня экспрессии. Верхняя и нижняя части диаграммы - гены, экспрессия которых в «опухолевых тельцах» повышена и понижена (соответственно) по сравнению с выросшими опухолями
Менее выраженная разница (2-4-кратное изменение) была показана для IFNA1 (3,4), IFNB1 (2,5), ITGA1 (3,2), ITGA3 (2,5), SNCG (2,7), NME1 (2,3) и BCL2L1, TGFB1, FGFR2 (2,1). Гены, уровень экспрессии которых в «опухолевых тельцах» был ниже, чем в выросших опухолях (где эпимераза была инактивирована) - CFLAR (27,2 раза), PDGFA (11,8 раза), ITGB5 (7,9 раза), TNFRSF10B (6,7 раза). Менее выраженная разница (в 2-4 раза) наблюдалась для MMP9 (3,9), ANGPT1 (3,6), SERPINE1 (3), THBS1 (2,8), ITGB3 (2,8), p21 (2,7), MET (2,6) и ETS (2,3).
Полученные результаты позволяют высказать предположение, что эктопическая экспрессия эпимеразы в клетках epi-U2020 подавляет развитие опухоли в первую очередь благодаря значительному снижению уровня экспрессии фактора роста сосудов (PDGFA -11,8 раза), изменению экспрессии фактора некроза опухоли TNF (+25,7 раза) и его рецепторов (TNFRSF6 +8,4 раза и TNFRSF10B - 6,7 раза) и повышению экспрессии супрессора клеточной пролиферации RB1 (+9,2 раза). Если учитывать также гены, для которых было показано умеренное (в
2-4 раза) изменение экспрессии в «опухолевых тельцах», можно сделать вывод, что антиопу-холевый эффект D-глюкуронил С5-эпимеразы в первую очередь реализуется через механизм подавления опухолевого ангиогенеза (IGF1, PDGFA, TNF, IFNA1, IFNB1, THBS1, ANGPT1) и в меньшей степени апоптоза (CFLAR, HTATIP2, TNFRSF10B и BCL2).
Таким образом, полученные нами данные о супрессирующем эффекте D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей у мышей SCID дают возможность рассматривать ген D-глюкуронил С5-эпимеразы как новый потенциальный регулятор клеточной пролиферации и роста опухолей и возможную основу для создания новых препаратов для ге-нотерапии мелкоклеточного рака легкого.
Авторы выражают благодарность проф. Е.Р. Забаровскому, В.И. Кашуба и Т. Павловой
(Каролинский Институт, Стокгольм) за помощь в проведении экспериментов, поддержку и обсуждение данной работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ № 09-04-01599а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ещенко Т.Ю., РыковаВ.И., Черпаков А.Е. и др. Экспрессия различных видов протеогликанов в опухолях молочной железы человека // Биохимия. 2007. Т. 72, № 9. С. 1248-1254.
2. Blackball F.H., Merry C.L., Davies E.J. et at. Heparan sulfate proteoglycans and cancer // Br. J. Cancer. 2001. Vol. 85 (8). P. 1094-1098.
3. Campbell P., Hannesson H.H., Sandback D. et al. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate. Purification of the D-glucuronyl C-5 epimerase from bovine liver // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P 26953-26958.
4. Crawford B.E., Olson S.K., Esko J.D. et al. Cloning, Golgi localization, and enzyme activity of the full-length heparin/heparan sulfate-glucuronic acid C5-epimerase // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 21538-21543.
5. Grigorieva E., Eshchenko T., Rykova VI. et al. Decreased expression of human D-glucuronyl C5-epimerase in breast cancer // Int. J. Cancer. 2008. Vol. 122. P. 1172-1176.
6. Hagner-McWhirter A., Hannesson H.H., Campbell P. et al. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate: kinetic studies of the glucuronyl C5-epimerase with N-sulfated derivatives of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide as substrates // Glycobiology. 2000. Vol. 10. P. 159-171.
7. Hagner-McWhirter A., Li J.P., Oscarson S. et al. Irreversible glucuronyl C5-epimerization in the biosynthesis of heparan sulfate // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 14631-14638.
8. Hagner-Mcwhirter A., Lindahl U., Li J. Biosynthesis of heparin/ heparan sulphate: mechanism of epimerization of glucuronyl C-5 // J. Biochem. 2000. Vol. 347. P. 69-75.
9. Li J., Hagner-McWhirter A., Kjellen L. et al. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate. cDNA cloning and expression of D-glucuronyl C5-epimerase from bovine lung // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 28158-28163.
10. Li J.P., Gong F., ElDarwish K. et al. Characterization of the D-glucuronyl C5-epimerase involved in the biosynthesis of heparin and heparan sulfate // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 20069-20077.
11. Li J.P., GongF., Hagner-McWhirter A. et al. Targeted disruption of a murine glucuronyl C5-epimerase gene results in heparan sulfate lacking L-iduronic acid and in neonatal lethality // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278 (31). P 28363-28366.
12. Nadanaka S., KitagawaH. Heparan sulphate biosynthesis and disease // J. Biochem. 2008. Vol. 144. P. 7-14.
13. Ori A., Wilkinson M.C., Fernig D.G. The heparanome and regulation of cell function: structures, functions and challenges // Front. Biosci. 2008. Vol. 13. P 4309^338.
14. Tiedemann K., Larsson T., HeinegardD. et al. The glucuronyl C5-epimerase activity is the limiting factor in the dermatan sulfate biosynthesis // Arch. Biochem. Biophys. 2001. Vol. 391. P. 65-67.
15. Valla S., Li J., Ertesvag H. et al. Hexuronyl C5-epimerases in alginate and glycosaminoglycan biosynthesis // Biochimie. 2001. Vol. 83. P. 819-830.
Поступила 31.01.10
