CC BY
34
УДК 581.6:614.777:574.635 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРМЫ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ НАЯДЫ МЕЛКОЗУБЧАТОЙ В МОДЕЛЬНЫХ ГИДРОЭКОСИСТЕМАХ
© 2014 Г.С. Быкова, И.Ф. Шаталаев, А.В. Воронин
Самарский государственный медицинский университет
Поступила в редакцию 29.04.2014
В работе представлены данные о структурной организации и активности молекулярных форм малатде-гидрогеназы (МДГ) наяды мелкозубчатой (Najas microdon) в модельных образцах сточных вод, загрязненных фенолом и пирокатехином. Рассмотрена возможность использования динамики активности МДГ наяды мелкозубчатой в мониторинге гидроэкосистем.
Ключевые слова: водный макрофит, очистка воды, фенол, пирокатехин, малатдегидрогеназа
В настоящее время распространенными загрязнителями водных объектов окружающей среды становятся лекарственные вещества. Основные источники - загрязненные воды химико-фармацевтических предприятий, бытовые стоки, а также стоки животноводческих комплексов. В числе лекарственных препаратов, наиболее часто упоминающихся в научных публикациях, антибиотики, анальгетики, регуляторы липидного обмена, антибактериальные и стероидные препараты. Их избыточные количества в воде отрицательно сказываются на деятельности различных систем организма [1, 2]. Лекарственные вещества в составе загрязненных вод поступают на очистные сооружения, как в неизменной, так и в метаболизированной формах. Технологическая вода фармацевтических производств может содержать не только сами лекарственные вещества, но и исходные вещества, и полупродукты органического синтеза. Фенолы и их производные являются одними из ключевых компонентов сточных вод фармацевтических предприятий и относятся к высокоопасным веществам. В технологии синтеза лекарственных препаратов широко представлены одноатомные и многоатомные фенолы, нафтолы и их производные (салициловая кислота, п- и м-аминофенолы и др.). Так, из салициловой кислоты получают ацетилсалициловую кислоту, которая сегодня используется в количествах больших, чем любое другое лекарственное средство. В медицинской практике в качестве лекарственных субстанций применяются фенол, тимол, резорцин [3].
В настоящее время наряду с традиционными методами биологической очистки для доочистки загрязненных вод используются высшие водные
Быкова Галина Сергеевна, старший преподаватель кафедры химии фармацевтического факультета. Email: galina_bp@bk.ru
Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета. E-mail: shata-laev@list.ru
Воронин Александр Васильевич, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры химии фармацевтического факультета. E-mail: dimmu2000@mail.ru
растения. В литературных источниках отмечают перспективы использования для этой цели фито-массы наяды мелкозубчатой (Najas microdon), которая относится к числу полностью погруженных водных макрофитов [4]. Для оценки функционального и физиологического состояния биологического объекта в ряде случаев используют показатели активности и структурной организации тех или иных ферментов метаболизма. Одним из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) является малатдегидрогеназа (МДГ, L-малат: НАД-оксидо-редуктаза; К.Ф. 1.1.1.37). МДГ катализирует окисление (дегидрирование) яблочной кислоты (L-малата) до щавелевоуксусной (оксалоацетата) в присутствии кофактора НАД+ [5]. Данные об изменении состава и активности фермента позволяют судить о скорости функционирования цикла Креб-са и могут служить характеристикой функционального состояния водного макрофита, применяемого для очистки загрязненных вод.
Цель работы: исследовать структурные особенности и динамику относительной активности молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой в процессе очистки модельных образцов загрязненных вод с различным содержанием фенола и пирокатехина.
Материал и методы. В модельных исследо-ваних использовали фитомассу наяды мелкозубчатой (Najas microdon), культивированной в лабораторных условиях. После удаления фоновых загрязнений наяду мелкозубчатую помещали в водные растворы фенола или пирокатехина с концентрациями 10, 30 и 50 мг/л из расчета 5,0 г фитомассы на 1 л раствора. Отбор проб растительной массы проводили в течение нескольких суток с интервалом 24 часа. В качестве контроля использовали фитомассу наяды без инкубации в растворах фенола и пирокатехина.
Ферментные образцы получали следующим образом: фитомассу наяды промывали дистиллированной водой для удаления фоновых загрязнений, удаляли избытки влаги с помощью бумажного фильтра, взвешивали 0,3 г фитомассы, дезинтегрировали в фарфоровой ступке с 0,5 мл охлажденного до 4 С 1/15 М фосфатного буфера pH 7,2 в
Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 16, №5(2), 2014
течение 5 мин. Дезинтеграт количественно переносили в колбу, добавляли 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера pH 7,2 и тритон X100 в конечной концентрации 20 мг/мл. Колбу помещали на магнитную мешалку для солюбилизации фермента на 1 час. Гомогенат центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Полученные образцы хранили в замороженном виде не более 6 суток. В суперна-танте определяли молекулярные формы МДГ методом электрофореза в плоских блоках 7,5% по-лиакриламидного геля. Анализируемые образцы смешивали с 40% раствором сахарозы в соотношении 2:1; 0,5 мл полученной смеси наносили на линию старта. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер с pH 9,2. Электрофорез проводили в течение первого получаса при величине тока 5,0 мА/см, а затем 10 мА/см на одну кювету с гелем до момента окончания электрофореза.
Выявление молекулярных форм МДГ проводили с помощью феназинметасульфат-тетразолие-вой реакции. Инкубационная среда: НАД водный раствор (1 мг/мл) - 30,0 мл; нитросиний тетразоли-евый водный раствор (1 мг/мл) - 22,2 мл; натрия малат водный раствор (1М) рН 7,0 - 21,0 мл;
феназинметасульфат водный раствор (1 мг/мл) -5,1 мл; 0,2 М трис-НС1 буфер рН 7,1 - 21,0 мл; вода дистиллированная - 70,2 мл. Гелевые блоки заливали инкубационным раствором в чашках Петри, инкубировали при 37°С в течение 12 часов. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих зон. Относительную активность каждой зоны в образцах определяли методом прямой денси-тометрии на анализаторе фореграмм АФ-1 (ПО «Львовприбор»).
Результаты и обсуждение. В сериях экспериментов при инкубации наяды мелкозубчатой в модельных образцах загрязненных вод, содержащих фенол и пирокатехин с концентрациями 10, 30 и 50 мг/мл установлено, что МДГ выявляется в виде двух активных зон с относительной электрофо-ретической подвижностью 0,83 (МДГ-1) и 0,67 (МДГ-2). Основная активность фермента локализована в области МДГ-2, активность МДГ-1 менее выражена. Результаты исследования относительной активности молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой в процессе изъятия фитомассой фенола и пирокатехина на различных этапах инкубации при различных концентрациях загрязнителя представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Состав и относительная активность молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой, инкубированной в загрязненной фенолом воде
Время инкубации, сутки Относительная активность, %
10 мг/л 30 мг/л 50 мг/л
МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2
Контроль 2,3 97,7 2,3 97,7 2,3 97,7
1 1,2 98,8 8,1 91,9 1,1 98,9
2 1,3 98,7 4,2 95,8 5,5 94,5
3 2,3 97,8 2,3 97,7 7,5 92,5
6 1,3 98,7 6,5 93,5 17,0 83,0
Таблица 2. Состав и относительная активность молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой, инкубированной в загрязненной пирокатехином воде
Время инкубации, сутки Относительная активность, %
10 мг/л 30 мг/л 50 мг/л
МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2
Контроль 3,8 96,2 3,8 96,2 3,8 96,2
1 1,3 98,7 4,5 95,5 4,5 95,5
2 11,3 88,7 4,0 96,0 2,6 97,4
3 9,5 90,5 1,3 98,7 12,3 87,7
6 17,3 82,7 12,8 87,2 9,5 90,5
МДГ относится к числу довольно хорошо изученных ферментов. Она представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм. По литературным данным у большинства исследованных объектов обнаружены две формы МДГ: митохондриальная и цито-плазматическая. Первая функционирует в рамках цикла Кребса, а вторая может играть роль челночного механизма среди субклеточных компонентов, участвовать в автотрофной фиксации С02 у высших растений, в кислотном метаболизме в тканях растений и других метаболических путях.
В растительных тканях МДГ найдена также в гли-оксисомах, пероксисомах и микросомах [5, 6]. Поскольку изоферменты являются носителями определенных функций в метаболизме, то они могут быть факторами идентификации этих функций. В проведенных экспериментах установлена высокая чувствительность фермента к изменению концентрации и продолжительности воздействия токсиканта. При инкубации фитомассы наяды мелкозубчатой в модельных образцах загрязненных вод с концентрацией фенола 10 мг/мл наблюдали минимальную активность МДГ-1 по сравнению с МДГ-
2 в течение всех шести суток, за исключением третьих суток, когда был отмечен небольшой подъем активности МДГ-1 до уровня таковой в контрольном образце. При концентрации фенола 30 мг/мл наблюдали более, чем трехкратное увеличение активности МДГ-1 в первые сутки по сравнению с контрольным опытом, затем плавное снижение до контрольной к третьим суткам и рост таковой к шестому дню эксперимента до уровня, превышающего контрольный в 3 раза. При экспонировании фитомассы наяды в модельных образцах загрязненных вод с концентрацией фенола 50 мг/мл отмечен стабильный рост относительной активности МДГ-1 до максимального значения, превышающего на шестые сутки более чем в семь раз относительную активность МДГ-1 контрольного образца.
Инкубация в модельных образцах загрязненных вод с содержанием пирокатехина 10 мг/мл, более токсичного для фитомассы наяды, чем одноатомный фенол, привело к увеличению относительной активности МДГ-1 с минимального значения в первые сутки до пятикратного увеличения по сравнению с контролем на шестой день эксперимента. При повышении содержания пирокатехина до 30 и 50 мг/мл наблюдали увеличение активности МДГ-1 уже в первые сутки, при этом максимум активности установлен на шестой день при 30 мг/мл и на третий день - при 50 мг/мл.
Выводы:
1. Получены данные о структурной организации, степени гетерогенности и активности МДГ наяды мелкозубчатой (Najas microdon) в модельных образцах сточных вод. МДГ наяды мелкозубчатой представлена в виде двух молекулярных форм - МДГ-1 и МДГ-2. Увеличение активности
молекулярных форм МДГ в процессе очистки вод, содержащих фенол и пирокатехин, указывает на мобилизацию цикла Кребса в ключевом фрагменте.
2. Установлена высокая чувствительность фермента к действию токсикантов. Результаты исследования могут быть положены в основу методов оценки физиологического, функционального состояния водного макрофита и биомониторинга гидроэкосистем.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Watkinson, A.J. The occurrence of antibiotics in an urban watershed: From wastewater to drinking water / A.J. Watkinson, E.J. Murby, D.W. Kolpin, S.D. Cos-tanzo // Sci. Total Environ.: An International Journal for Scientific Research into the Environment and its Relationship with Man. 2009. 407, №8. С. 2711-2723.
2. Gobel, A. Occurence and sorption behavior of sulfon-amides, macrolides, and trimethoprim in activated sludge treatment / A. Gobel, A. Thomsen, C.S. Mcardell et al. // Environ. Sci. and Technol. 2005. V. 39, №11. P. 3981-3989.
3. Вартанян, Р. С. Синтез основных лекарственных средств. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. 845 с.
4. Быкова, Г. С. Водный макрофит наяда мелкозубчатая в доочистке сточных вод / Г.С. Быкова, И.Ф. Шаталаев, А.В. Воронин // Известия СНЦ РАН. Т. 13. №1(8). С. 2048-2052.
5. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. - М.: Мир, 1982. 1120 с.
6. Юдина, Р.С. Генетика и феногенетика малатдегид-рогеназы растений // Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14, № 2. С. 243-254.
MOLECULAR FORMS OF THE NAJAS MICRODON MALATE DEHYDROGENASE IN THE MODEL HYDROECOSYSTEMS
© 2014 G.S. Bykova, I.F. Shatalayev, A.V. Voronin
Samara State Medical University
In work data on structural organization and activity of Najas microdon malate dehydrogenase (MDG) molecular forms in model exemplars of sewage polluted by phenol and pyrocatechol are submitted. Possibility of use the dynamics of Najas microdon MDG activity in monitoring of hydroecosystems is considered.
Key words: water macrophyte, water purification, phenol, pyrocatechol, malate dehydrogenase
Galina Bykova, Senior Teacher at the Chemistry Department at
Pharmaceutical Faculty. E-mail: galina_bp@bk.ru
Ivan Shatalaev, Doctor of Biology, Professor, Head of the Chemistry
Department at Pharmaceutical Faculty. E-mail: shatalaev@list.ru
Alexander Voronin, Candidate of Pharmacy, Associate Professor at
the Chemistry Department at Pharmaceutical Faculty. E-mail:
dimmu2000@mail.ru
