CC BY
99
ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
УДК 575.1::576.3
Г.Н. Артемов1’2, Г.М. Абылкасымова3, В.Н. Стегний1,2
1Особое структурное подразделение «Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета» (г. Томск) 2Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск) 3Институт общей генетики и цитологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (г. Алма-Ата, Казахстан)
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАЙОНА ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМ К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ ТРОФОЦИТОВ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ Anopheles КОМПЛЕКСА «maculipennis»
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», 2009-2013 гг. (ГК № П801; № П1702, № 02.740.11.0278), АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)»
(проект № 2.1.1/774) и при финансовой поддержке РФФИ «Научная работа молодых ученых из стран СНГ в российских научных организациях» моб_снг_ст 2011 г. (грант № 11-04-90911).
Проведен сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке трофоцитов пяти видов малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis». Методом флуоресцентной in situ гибридизации изучали локализацию ДНК, гомологичной району прикрепления XL хромосомы Anopheles messeae Fall., на хромосомах близкородственных видов. Показано, что район прикрепления XL хромосомы An. messeae является гетерохроматическим и соответствует топологии fi-гетерохроматина. Выявлено, что ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae локализуется в интеркаляр-ных районах и прицентромерном гетерохроматине хромосом малярийных комаров комплекса «maculipennis», а также в прицентромерном а-гетерохроматине у An. maculipennis и An. messeae. Показаны различия изучаемых видов по распределению ДНК, гомологичной последовательностям района прикрепления XL хромосомы An. messeae, на хромосомах близкородственных видов. Обсуждается вопрос возникновения районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке.
Ключевые слова: пространственная организация ядра; районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке; гетерохроматин; малярийные комары; Anopheles.
Введение
Проблема пространственной организации интерфазного ядра изучается уже более 125 лет [1] и остается до сих пор актуальной [2-4]. Гены, хромосомные сегменты и геном как целое упорядочены в трехмерном простран-
стве ядра [5]. Этот порядок обеспечивается взаимодействием хромосом с ядерной оболочкой и друг с другом [6]. Малярийные комары являются исключительно удобным объектом для изучения хромосомо-мембранных отношений, так как близкородственные виды этих насекомых различаются по пространственной организации хромосом в ядрах трофоцитов яичников [7]. Наибольший интерес представляет изучение молекулярной организации районов хромосом, взаимодействующих с ядерной оболочкой. Выяснение природы контактов хромосом с оболочкой ядра позволит получить представление о закономерностях формирования и функционирования хроматина во внутриядерном пространстве.
Флуоресцентная in situ гибридизация ДНК отдельных районов хромосом, полученной с помощью микродиссекции, с хромосомами близкородственных видов малярийных комаров успешно применяется для оценки реорганизации последовательности ДНК районов прикрепления хромосом в филогенезе [8-10]. Ранее был проведен подобный анализ ДНК прицентромерного района хромосомы 2R Anopheles atroparvus Thiel., имеющего факультативные связи с оболочкой ядра [8], и района прикрепления 2L хромосомы An. beklemishevi Steg. et Kab. [9, 11]. В этих работах было показано, что районы прикрепления хромосом, которые находятся в прицентромерных районах, имеют общие последовательности ДНК с прицентромерными районами хромосом близкородственных видов, причем вне зависимости от их способности образовывать жесткий контакт с ядерной оболочкой. Можно сделать вывод, что исследованные прицентромерные районы хромосом содержат консервативные повторы, характерные для прицентромерных районов как таковых, а не только для районов прикрепления хромосом к оболочке ядра.
Цель настоящего исследования - выяснить, имеет ли район прикрепления XL хромосомы An. messeae Fall. общие последовательности с районами прикрепления хромосом других видов малярийных комаров комплекса «maculipennis». XL хромосома An. messeae образует контакт с ядерной оболочкой посредством района 2b-c, который расположен в середине плеча [7]. Район 2b-c локализуется на периферии ядра и образует «отростки», контактирующие с ядерной оболочкой, которые можно наблюдать на полудавленных препаратах ядер трофоцитов (рис. 1, на вклейке) и с использованием метода 3D-FISH ДНК района 2b-c с ядрами трофоцитов An. messeae (рис. 2, на вклейке).
Изучение последовательности ДНК района 2b-c интересно тем, что он не является прицентромерным. Поэтому становится возможным провести анализ района, ответственного за контакт с ядерной оболочкой, «в чистом виде», исключив последовательности, характерные для прицентромерного гетерохроматина. В данной работе исследовали локализацию ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae на хромосомах близкородственных видов малярийных комаров, что позволило судить о реорганизации ДНК районов хромосом, принимающих участие в пространственной организации хромосом в ядре.
Материалы и методики исследования
В качестве материала для исследования использовали малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis». Самки An. messeae и An. beklemishevi были собраны в пос. Коларово (Томская область) и в с. Тегульдет (Томская область), самки An. maculipennis Mg. и An. melanoon Hackett. собраны в окрестностях г. Адлер (Краснодарский край), а самки An. atroparvus были взяты из лабораторной культуры.
Приготовление препаратов хромосом. Для приготовления воздушно-сухих препаратов политенных хромосом яичники самок малярийных комаров фиксировали в растворе Карнуа (96%-ный этанол с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1). Препараты готовили по стандартной методике [12]. Фолликулы яичников малярийного комара выдерживали 5 мин в 50%-ной пропионовой кислоте на предметном стекле. Затем материал накрывали покровным стеклом и раздавливали. Препарат опускали в жидкий азот, покровное стекло удаляли. После этого осуществляли проводку в этиловом спирте с возрастающей концентрацией (50, 70, 96%) по 5 мин в каждом при -20°С. Препараты высушивали при комнатной температуре.
Флуоресцентная in situ гибридизация. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) применяется для определения локализации на хромосомах исследуемой последовательности ДНК. Исследуемую ДНК (ДНК-зонд) «окрашивают» с помощью флуоресцентного красителя, денатурируют и гибридизуют с ДНК воздушно-сухих препаратов хромосом, распластанных на предметных стеклах. ДНК-зонд гибридизуется с ДНК хромосом по принципу комплементарности и выявляется при анализе с использованием люминесцентного микроскопа. В качестве ДНК-зонда в работе использована ДНК, полученная с помощью микродиссекции из района прикрепления XL хромосомы к оболочке трофоцитов An. messeae. Для его приготовления использовали модифицированный нуклеотид тетрамелилродамин-5-дУТФ (TAMRA, ЗАО «Биосан», Россия). FISH с таким зондом позволяет опустить этап детекции, так как флуорохром уже связан с модифицированным нуклеотидом. В данной работе использовали стандартный протокол FISH [13] с модификациями, приведенными ниже.
Введение метки в ДНК. Введение метки в ДНК проводили в 25 циклах ПЦР в режиме: денатурация 94°С - 1 мин; отжиг 56°С - 1,5 мин; элонгация цепей при 72°С - 2 мин; с завершающей элонгацией цепей при 72°С - 8 мин. Состав ПЦР-смеси: 10 тМ Трис НС1; 50 mM KC1, рН 8,3; 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 100 мкМ дТТФ; 100 мкМ тетраметилродамин-5-дУТФ; 2 мкМ праймера MW6 (ООО «СибЭнзим-М», Россия), 5 мМ MgCl2 и 1,5 ед. Taq ДНК полимеразы. Полученный зонд промывали в 96%-ном этаноле 12 ч при -20°С, а далее - в 70%-ном этаноле при комнатной температуре 10 мин в присутствии 1:10 объема ПЦР смеси ацетата натрия 3 М с последующим высушиванием при 52°С в твердотельном термостате. Осадок зонда смешивали с гибридизационной смесью.
In situ гибридизация. Воздушно-сухие препараты промывали три раза в буферном растворе 2*SSC (37°C, по 5 мин в каждом), проводили по серии этиловых спиртов возрастающей концентрации (70, 80, 96%) и высушивали при комнатной температуре. Далее препараты подвергались обработкой пепсином (200 мкг/мл) в кислой среде (10 мМ HCl) 10 мин при 37°С, после чего следовали отмывка в двух сменах 1*PBS и дегидратация в серии спиртов возрастающей концентрации. На препараты наносили ДНК-зонд в гибридизационной смеси (50%-ный формамид, 10%-ный декстрансульфат натрия, 1%-ный Tween 20, 2*SSC) из расчета 15 мкл на один препарат. Препараты помещали на ночь в гибридизационную камеру «Termobrite» с режимом работы: денатурация 5 мин при 72°С и гибридизация 15 ч при 37°С.
Отмывку препаратов от лишнего зонда осуществляли в трех сменах 50% -ного формамида в 2*SSC при 42°С с покачиванием по 5 мин в каждой. Далее препараты помещали последовательно в 2*SSC, 2*SSC с 0,1%-ным Tween 20, две смены 0,2*SSC при 42°С и 0,1*SSC при 60°С по 5 мин в каждом. Препараты дегидратировали в этиловом спирте с возрастающей концентрацией (70, 80, 96%). Окраску хроматина осуществляли с помощью DAPI. Препараты анализировали на люминесцентном микроскопе AxioImager Z1 («Zeiss», Германия), фиксацию и обработку изображений проводили с использованием программного обеспечения AxioVision Rel. 4.7 («Zeiss», Германия).
Результаты исследования и обсуждение
Исследование локализации ДНК, гомологичной последовательностям
района прикрепления XL хромосомы An. messeae, на хромосомах малярийных комаров комплекса «maculipennis»
Была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ДНК района 2b-c XL хромосомы An. messeae (ДНК-пробы), полученной с помощью микро-диссекции, с политенными хромосомами трофоцитов An. messeae и близкородственных видов An. atroparvus, An. beklemishevi, An. maculipennis и An. melanoon.
XL хромосома. В популяциях An. messeae с большой частотой встречается, а в западной части ареала преобладает парацентрическая инверсия в левом плече X хромосомы - XL0 [14]. Эта инверсия распространена как в гетерозиготном (XL01), так и в гомозиготном (XL00) состояниях, причем показано, что инверсионный полиморфизм популяций малярийного комара имеет адаптивный характер [14, 15]. Примечательно, что инверсия в XL хромосоме захватывает район прикрепления к ядерной оболочке и переносит его из середины плеча к центромере. У особей An. messeae, гомозиготных по инверсии, положение района прикрепления XL хромосомы аналогично таковому у эволюционно исходного An. atroparvus. Было обнаружено, что гомологичные исследуемой последовательности ДНК локализованы также
в прицентромерном районе вблизи к гетерохроматическому правому плечу хромосомы и инверсией переносятся в середину плеча (рис. 3, на вклейке).
Таким образом, in situ гибридизация ДНК-пробы со стандартным вариантом XL хромосомы An. messeae и гомозиготным по инверсии демонстрирует изменение положения данного района. Причем ДНК-проба гибридизу-ется с прицентромерным как ß-, так и a-гетерохроматином XL хромосомы An. messeae.
Подобные результаты были получены при гибридизации ДНК-пробы с XL хромосомой других видов малярийных комаров комплекса «maculipennis» (рис. 4, на вклейке).
Сигнал был обнаружен в XL хромосоме у всех изучаемых видов, вероятно, в районах, гомейологичных району 2b-c XL хромосомы An. messeae. Высокая интенсивность сигнала свидетельствует о сходстве последовательностей ДНК этих районов и района 2b-c An. messeae. В прицентромерном районе XL хромосомы также наблюдали локализацию ДНК-пробы из района 2b-c XL хромосомы An. messeae. Сигнал был обнаружен у An. atroparvus, An. Ъeklemishevi и An. melanoon только в ß-гетерохроматине, у An. maculipennis так же, как и у An. messeae, сигнал в прицентромерном районе был слабым, но локализовался как в ß-, так и a-гетерохроматине. Высокая интенсивность сигнала в районе интеркалярного гетерохроматина свидетельствует о том, что «эволюция» XL хромосомы в комплексе «maculipennis» не происходила путем хромосомных перестроек, по крайней мере, вовлекающих районы, го-мейологичные изучаемому 2b-c An. messeae.
Районы XL хромосом, ответственные за крепление к оболочке ядра у изучаемых видов, имели сходные последовательности с районом 2b-c An. messeae, однако интенсивность сигнала различалась. Хотя специальной количественной оценки интенсивности сигнала не проводилось, во всех экспериментах наиболее яркие сигналы были обнаружены в районах, гомейологичных району 2b-c An. messeae, и районе прикрепления XL хромосомы An. atroparvus (прицентромерный район). Непростая ситуация возникла с идентификацией сигнала в районе прикрепления XL хромосомы An. Ъeklemishevi. Гибридизация с этим районом выявлена не во всех экспериментах и была чрезвычайно слабой. Это свидетельствует о том, что гомология ДНК района 2b-c An. messeae и района прикрепления XL An. Ъeklemishevi либо имеет место (лишь в отношении отдельных малопредставленных у An. Ъeklemishevi последовательностей), либо отсутствует полностью.
Сигнал в прицентромерном a-гетерохроматине XL хромосом можно было обнаружить только у An. messeae и An. maculipennis. Обнаружение сигнала в блоках a-гетерохроматина является типичным для указанных видов и обсуждается ниже.
Таким образом, у всех изучаемых видов, в том числе и у An. messeae, в XL хромосоме было обнаружено два флуоресцентных сигнала - в прицен-тромерном районе и в середине плеча (у An. atroparvus два сигнала). Такое
же распределение сигналов было отмечено у An. melanoon, XL хромосома которого не имеет жестких контактов с оболочкой ядра.
Хромосома 2. У большинства изучаемых видов хромосома 2 не имеет связи с ядерной оболочкой, но у An. Ъeklemishevi хромосома 2 образует контакт с оболочкой ядра в прицентромерной области, и на давленых препаратах правое и левое плечи отделены друг от друга [16]. Обнаружена гомология ДНК-пробы с прицентромерным районом хромосомы 2 всех видов (рис. 5, на вклейке).
При этом происходило мечение как прицентромерного ß-гетерохроматина, так и a-гетерохроматина. a-гетерохроматин в прицентромерных районах выражен у An. maculipennis и An. messeae наиболее сильно; он представлен довольно крупными блоками, и гибридизация происходила именно с ними, в то время как у An. Ъeklemishevi и An. melanoon таких сигналов не выявлено. Следует отметить также интенсивное мечение прицентромерного ß-гетерохроматина, наиболее ярко выраженное у An. atroparvus, а также в виде ярких отдельных сигналов у An. melanoon, An. Ъeklemishevi и в меньшей степени у An. maculipennis и An. messeae. Кроме того, сигналы были обнаружены по всей длине обоих плеч хромосомы 2 всех видов.
Хромосома З. В трофоцитах самок всех изучаемых видов хромосома 3 крепится к оболочке ядра, и на препаратах плечи этой хромосомы разобщены [16]. В результате FISH ДНК-пробы района 2b-c XL хромосомы в при-центромерном районе правого плеча хромосомы 3 пометились тяжи района 32d, которые отвечают за прикрепление этой хромосомы к оболочке ядра у всех видов комаров комплекса «maculipennis» (рис. 6, на вклейке). В при-центромерной области этой хромосомы были также обнаружены сигналы, среди которых следует отметить сигналы в районе, находящемся дистальнее a-гетерохроматического блока района 32d у An. melanoon, An. atroparvus и An. Ъeklemishevi. У An. maculipennis и An. messeae таких сигналов обнаружено не было. Однако следует отметить, что лишь у видов An. maculipennis и An. messeae гибридизация происходила с a-гетерохроматическим блоком района 32d, в то время как у остальных видов сигнала в этом районе не выявлено.
В левом плече хромосомы 3 был обнаружен сигнал в прицентромерном районе 33 а-с (рис. 7, на вклейке), которым плечо крепится к ядерной оболочке. Следует отметить, что сигналы имеют место и в районах интерка-лярного гетерохроматина. Причем часть из них можно было наблюдать в районах интеркалярного a-гетерохроматина у An. Ъeklemishevi, An. atroparvus, An. melanoon и An. maculipennis. В то время как у An. Ъeklemishevi и An. atroparvus отмечен сигнал в маркерном районе 35b, у An. maculipennis и An. melanoon - в характерном гетерохроматическом блоке района 34b. Однако следует отметить, что в районах прикрепления 3L хромосомы ни An. melanoon, ни An. maculipennis сигнала обнаружено не было.
Флуоресцентная in situ гибридизация ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae с хромосомами того же вида и видов комплекса
Рис. 1. Локализация тяжей хроматина, контактирующих с оболочкой в районе 2Ь-с XL хромосомы трофоцитов Ап. твззвав (указаны стрелками):
N - ядрышко; С - центромера. Масштабная линейка 20 мкм
Рис. 2. Ядра трофоцитов Ап. твззвав. красная область - пространственное положение района 5а XL хромосомы, зеленая - 2Ь-с XL хромосомы
V
г
«с
ТАМ Я А
К
л'
т
2Ь-с
*
2Ь-с
ТАМ Я А
Рис. 3. Локализация ДНК района 2Ь-с Ап. тезвеае на стандартном варианте ХЬ хромосомы (ХЫ1) и гомозиготе по инверсии (ХЬОО) у малярийного комара Л?;, отєіієяє; стрелками указана локализация флуоресцентного сигнала. Масштабная линейка 20 мкм
ТАМИЛ ТАМИЛ ТАМИЛ
2Ь-с
т. . С г 5Ь * 1 4 ♦;с 5а-Ь г «г С т 5а
ТАМИЛ ТАМИЛ ТАМИЛ
2Ь-с
Iе Т 5Ь * 1 4 * І*С і ч иг с т
5а-Ь 5а
а б В
* ТАМИЛ ТАМИЛ
С
С
1 г
Ф ТАМКЛ ТАМИЛ
4 .
^ С А 4е
1
_ Г д
Рис. 4. Локализация ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Л?;, тежеае на ХЬ хромосоме малярийных комаров комплекса «тасиїіретт»: а - ХЬ Ап. теээеае', 6 - ХЬЛи. Мгораппів', в - ХЬЛи. Ьекіетіяііел’і', г - ХЬЛи. тасиИрептв', д - ХЬЛи. теїапоогг, здесь и далее на рисунках стрелками показана локализация флуоресцентного сигнала, стрелки синего цвета указывают на сигналы в районах прикрепления хромосом; стрелками со звездочкой показан сигнал в а-гетерохроматическом районе; С - центромера. Масштабная линейка 20 мкм
Ф* % ТАМ КА
21. Т / 2К
Г ГАМ КА
ъ ЭАР1
21' т Т / 2К
а
ТАМ Я А
2К
->
2Ь
ТАМ И А БАРІ
\ 2К
21 б
<-
21 ч'и
*-
21 /
2И
тамка
0ЛР1
* т
в
\
21
ТАМКЛ ■ ТЛМКЛ
2Я
ТАМ И А
ЭАР1
ТАМ И А
ОАРІ
2К
21<
«ч
<ч
>г
д
ТАМПА ТАМ КА с 3211 ТАМПА ТАМПА ТАМПА
V ¿4.
# /Я 32(1
32<1 с Ш ^ 1 <“ -» 4 С ьГ
Ф 71 «- Ч .• & г
\ 71 *32(1 С
ТАМПА ТАМ КА с ^ ТАМПА ТАМПА ТАМПА
щ яг ^ - V X 1 и 32(1
32(1 С <- \ % ^
* $*•** 7 •<- с
\ 32*1 I
а б В Г д
ТАМПА * ^ 33с 7 * Т { С ТАМПА 35Ь а/? т! Щ с
ТАМПА ^ X., Т 1' с а ТАМПА 35Ь Н %-с б
ТАМПА ТАМИЛ ТАМИЛ
.35Ь
*
\ 4 4 4 чг \, __ ^*мь
с V
^ Т т ^
у*“ 1 с \
X * с
ТАМПА ТЛМИА ТАМПА ОЛР1
,35Ь
< \ 4 4-4 \ ^*34Ь
, , с
^ Т г ^
. 33с " с «ч
(В г Д
«maculipennis» показала, что этот район характеризуют последовательности прежде всего прицентромерного гетерохроматина. На данном этапе исследования можно сделать вывод о том, что, вероятно, район 2Ь-с является гетерохроматическим, что подтверждается работами по локализации высокопо-вторенной ДНК на хромосомах Ап. messeae [17, 18]. Ранее отмечалось, что район 2Ь-с имеет морфологию, обычную для Р-гетерохроматина [16].
Предположение о том, что район 2Ь-с Ап. messeae характеризуется последовательностями, типичными только для районов прикрепления хромосом, не подтвердилось, так как:
1. Примерно одинаковую картину гибридизации ДНК-пробы наблюдали со всеми хромосомами разных видов вне зависимости от их отношения к ядерной оболочке. XL хромосома Ап. melanoon и хромосома 2 Ап. messeae, Ап. maculipennis, Ап. аігорагуш и Ап. melanoon не образуют жестких контактов с оболочкой ядра, но имеют аналогичное распределение сигнала, что и хромосомы, взаимодействующие с ядерной оболочкой.
2. У Ап. Ъeklemishevi в районе прикрепления XL хромосомы, а также в районах прикрепления 3L хромосомы у Ап. maculipennis и Ап. теїапооп, не было обнаружено выраженных сигналов.
Вероятно, ДНК района прикрепления XL хромосомы Ап. messeae образуют повторенные последовательности разных классов, среди которых есть универсальные для гетерохроматических районов и те, которые определяют положение XL хромосомы в пространстве.
Очевидно, что в состав района 2Ь-с входят последовательности, характерные для Р-гетерохроматина. Однако гибридизация зонда была обнаружена также и с а-гетерохроматиновыми блоками, которые расположены в левом плече хромосомы 2 и правом плече хромосомы 3, что показано в результате эксперимента FISH ДНК-пробы с хромосомами Ап. maculipennis и Ап. messeae. Важным результатом эксперимента является иллюстрация различия в локализации гетерохроматических районов у разных видов комплекса «maculipennis» (рис. 8).
Рис. 8. Изменение количества сайтов консервативных последовательностей ДНК в филогенезе малярийных комаров комплекса «maculipennis»: в скобках -количество сигналов, полученных в результате FISH ДНК района 2b-c An. messeae с хромосомами соответствующих видов малярийных комаров.
Схема видообразования по Стегнию [17] с изменениями
Было выявлено, что согласно схеме видообразования [17] происходило уменьшение количества сайтов, содержащих последовательности ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae. Так, у стволового видаАп. atroparvus можно наблюдать 28 сайтов включения метки, у гомосеквентных An. melanoon и An. maculipennis - 20 сайтов, а у An. messeae - лишь 14 сайтов.
Причем можно предположить, что у An. maculipennis и An. messeae одновременно с элиминацией (или уменьшением) количества консервативных последовательностей в интеркалярном гетерохроматине происходит их накопление (либо образование de novo) в прицентромерном а-гетерохроматине хромосом 2, 3R и XL (рис. 9).
Рис. 9. Изменение количества сайтов консервативных последовательностей ДНК в а-гетерохроматине в филогенезе малярийных комаров комплекса «maculipennis»: в скобках - количество сигналов в а-гетерохроматических районах, полученных в результате FISH ДНК района 2b-c An. messeae с хромосомами соответствующих видов малярийных комаров. Схема видообразования по Стегнию [17] с изменениями
Такой вывод становится более убедительным, если учитывать, что у An. atroparvus, An. melanoon, An. beklemishevi указанное на рис. 9 количество сигналов соответствует только тем, которые расположены в интеркалярном а-гетерохроматине. Таким образом, район 2b-c, как показал анализ, соответствует Р-гетерохроматину не только морфологически, но и по последовательностям ДНК, видимо, эволюционно консервативным.
Сравнительный анализ ДНК районов прикрепления XL хромосомы An. messeae и 2L хромосомы An. beklemishevi, а также прицентромерного района 2R хромосомы An. atroparvus
Ранее с помощью микродиссекции были получены ДНК-пробы районов 15d An. beklemishevi [9, 11] и 14с An. atroparvus [8, 19]. Хромосома 2 у An. beklemishevi крепится к оболочке ядра, и оба плеча на препаратах разобщены. Из прицентромерного района 2L плеча была взята ДНК-проба, и из нее был приготовлен ДНК-зонд. С использованием этого ДНК-зонда была проведена FISH с хромосомами An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus. Та же работа была проведена и с прицентромерным районом 2R хромосомы An. atroparvus, которая образует факультативные контакты с оболочкой ядра. Так как в описываемых работах анализировали районы прикрепления
хромосом трофоцитов малярийного комара комплекса «maculipennis», интересно провести сравнение результатов упомянутых работ с результатами исследования района 2Ь-с Лп. messeae. Результат сравнения ДНК-проб районов 15гї Лп. Ъeklemishevi, 14с Лп. а^орагуш и 2Ь-с Лп. messeae на хромосомах Лп. Ъeklemishevi, Лп. messeae и Лп. atroparvus проиллюстрирован в таблице.
Локализация ДНК районов 15d Ап. beklemishevi, 14с Ап. beklemishevi и 2Ь-с Ап. messeae на хромосомах Ап. beklemishevi, Ап. messeae и Ап А^орап>ш
Вид Хромосома ДНК районов хромосом
15d Ап. Ъeklemishevi 14с Ап. аїгорагуш 2Ь-с Ап. messeae
2 . ^ В -с ХЬ Р-ПГХ Р-ПГХ Р-ПГХ, ДР
2Ь РП (Р-ПГХ) - РП (Р-ПГХ), ДР
2R РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
3R РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
3Ь РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
ё К ХЬ Р-ПГХ Р-ПГХ РП, Р-ПГХ, а-ПГХ
2Ь Р-ПГХ а-ПГХ Р-ПГХ, а-ПГХ
2R ДР Р-ПГХ Р-ПГХ
3R РП (Р-ПГХ),а-ПГХ РП (Р-ПГХ),а-ПГХ РП (Р-ПГХ), а-ПГХ
3Ь РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
3 £ і К ХЬ РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР РП (Р-ПГХ), ДР
2Ь Р-ПГХ Р-ПГХ Р-ПГХ, ДР
2R Р-ПГХ Р-ПГХ Р-ПГХ, ДР
3R РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
3Ь РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ) РП (Р-ПГХ), ДР
Примечание. ПГХ - прицентромерный гетерохроматин; РП - район прикрепления; ДР -другие районы.
ДНК изучаемых районов, как правило, локализовалась в Р-гетерохро-матине Лп. atroparvus и Лп. Ъeklemishevi, а также в Р-гетерохроматине и а-гетерохро-матиновых блоках Лп. messeae. Гомология района 2Ь-с XL хромосомы Лп. messeae с прицентромерными районами говорит о том, что в его состав входят повторяющиеся последовательности ДНК, которыми изобилует прицентромерный гетерохроматин. Кроме того, у изучаемых районов сходная картина распределения сигнала на хромосомах близкородственных видов, что является еще одним подтверждением гетерохроматической природы района 2Ь-с Лп. messeae. Однако локализация ДНК-пробы 2Ь-с Лп. messeae, взятой из района интеркалярного гетерохроматина, отличалась от локализации ДНК-проб района 15d Лп. Ъeklemishevi и 14с Лп. а^орагуш, которые были выделены из прицентромерных районов хромосом. Отличие последовательностей из района 2Ь-с Лп. messeae заключается в локализации их вдоль плечей хромосом наряду с прицентромерным гетерохроматином.
В результате гибридизации ДНК районов прицентромерного гетерохроматина 2L хромосом An. beklemishevi и 2R An. atroparvus и хромосомой An. messeae не было выявлено гомологии с районом прикрепления XL хромосомы. Однако гибридизация ДНК-пробы района 2b-c XL хромосомы An. messeae дала положительный результат. Эти данные еще раз подтверждают сложность организации последовательности ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae, в состав которого, вероятно, входят последовательности разных классов и с разной копийностью.
Заключение
Таким образом, последовательность ДНК района 2b-c не является принципиально отличной от других районов, имеющих морфологию ß-гетерохроматина, в том числе хромосом, не имеющих контактов с оболочкой ядра. Морфологическое сходство этого района с ß-гетерохроматином по-литенных хромосом лежало в основе гипотезы происхождения этого района [15, 20]. Ранее предполагалось, что эволюционно исходным инверсионным вариантом является тот, у которого район 2b-c расположен в прицентромер-ной области. Однако эксперименты FISH ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae с хромосомами близкородственных видов показывают, что у предковых видов и даже представителя неарктической ветви комплекса An. beklemishevi гомейологичный району 2b-c район всегда находится в середине плеча XL хромосомы.
Таким образом, возникновение у An. messeae хромосомы с районом прикрепления, расположенным в центральной части плеча, было вызвано реорганизацией самой последовательности ДНК и не связано с хромосомными перестройками. Возникновение районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров комплекса «maculipennis» могло быть вызвано перемещением мобильных элементов, содержащих SAR/ MAR-последовательности ДНК. SAR/MAR-последовательности ДНК, которые стабилизируют хроматиновые петли в интерфазном ядре и участвуют в прикреплении их к ядерному каркасу [21]. Следовательно, эти участки ДНК имеют непосредственное отношение к формированию внутриядерной архитектуры. Помимо стабилизации хроматиновых петель, SAR/MAR также участвуют в процессах инициации репликации, транскрипции, репарации и сплайсинга [21].
В литературе отмечают, что некоторые мобильные элементы, такие как MITE, способны перемещать SAR/MAR-последовательности [22]. Появление района прикрепления XL хромосомы в середине плеча могло быть связано с перемещением мобильных элементов из районов прикрепления хромосом 2 или 3 предкового вида, которые захватывали последовательности, связывающие белки оболочки. Более того, такое перемещение могло бы произойти в пределах одной XL хромосомы, когда район прикрепления,
расположенный у центромеры, являлся донором функциональных элементов, участвующих в контакте. «Старый» район прикрепления мог утратить свое значение и перестать функционировать, в то время как «новый», расположенный в середине плеча, принял на себя его функции. Описанная гипотеза возникновения de novo районов прикрепления хромосом подтверждается данными о молекулярно-генетической структуре района 2b-c, в котором найдены мобильные элементы и SAR/MAR-последовательности [18]. Однако в настоящий момент существует очень мало информации о молекулярной организации районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке, что не позволяет делать окончательных выводов не только о том, как возникли, но и том, как функционируют эти районы.
Литература
1. Rabl C. Über Zellteilung // Morphologisches Jahrbuch. 1885. P. 214.
2. Cremer T., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in
mammalian cells // Nature Reviews Genetics. 2001. Vol. 2, № 4. P. 292-301.
3. Meaburn K.J., Misteli T.J. Locus-specific and activity-independent gene repositioning during
early tumorigenesis // The Journal of Cell Biology. 2008. Vol. 180, № 1. P. 39-50.
4. Mahy N.L., Perry P.E., Bickmore W.A. Gene density and transcription influence the localiza-
tion of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH // The Journal of Cell Biology. 2002. Vol. 159, № 5. P. 753-63.
5. Steffensen D.M. Chromosome architecture and the interphase nucleus: Data and theory on
the mechanism differentiation and determination // Chromosomes Today. Amsterdam : Elsevier, 1977. Vol. 6. P. 247-253.
6. Куличков В.А., Жимулев И.Ф. Анализ пространственной организации геномов Drosoph-
ila melanogaster на основе данных по эктопической конъюгации политенных хромосом // Генетика. 1976. Т. 12, № 5. С. 81-89.
7. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе маля-
рийных комаров // Доклады АН СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231-1234.
8. Грушко О.Г., Шарахова М.В., Шевченко А.И. и др. Характеристика и сравнитель-
ный анализ ДНК из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Anopheles atroparvus V. Tiel (Culicidae, Diptera) // Генетика. 2004. Т. 40, № 10. С. 1325-1334.
9. Стегний В.Н., Сайджафарова А.О., Артемов Г.Н., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б.
Сравнительный анализ молекулярного состава прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом малярийных комаров рода Anopheles (CULICIDAE, DIPTERA) // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2007. № 1. С. 96-105.
10. Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярно-цитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы Drosophila melanogaster // Цитология. 2008. Т. 50, № 12. С. 1044-1049.
11. Сайджафарова А.О., Артемов Г.Н., Карамышева Т.В. и др. Молекулярно-цитогенетическое изучение ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L у малярийного комара Anopheles beklemishevi (Culicidae, Diptera) // Генетика. 2009. Т. 45, № 1. С. 59-63.
12. Kumar V., Cornel A.J., Mukabayire O. In situ hybridization to Anopheles polytene chromosomes // Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. London : Chapman and Hall, 1997. P. 337-345.
13. Lichter P., Ledbetter S.A., Ledbetter D.H., Ward D.C. Fluorescence in situ hybridization with Alu and L1 polymerase chain reaction probes for rapid characterization of human chromosomes in hybrid cell lines // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, № 17. P. 6634-6638.
14. Стегний В.Н. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae. IV. Стационарность частотного распределения инверсий по ареалу вида // Генетика. 1983. Т. 19, № 3. С. 466-473.
15. Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск : Изд-во Томского ун-та, 1991. 137 с.
16. Стегний В.Н. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция. Новосибирск : Изд-во Новосиб. ун-та, 1993. 111 с.
17. Стегний В.Н. Генетические основы эволюции малярийных комаров. I: Хромосомные филогенетические связи // Зоологический журнал. 1981. Т. 60, вып. 1. С. 69-77.
18. Артемов Г.Н., Стегний В.Н. Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis» // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2010. Т. 10, № 2. С. 123-131.
19. Grushko O.G., Sharakhova M.V., Stegnii V.N., Sharakhov I.V. Molecular organization of heterochromatin in malaria mosquitoes of the Anopheles maculipennis subgroup // Gene. 2009. № 448. P. 192-197.
20. Шарахова М.В., Стегний В.Н., Тимофеева О.В. Полиморфизм прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов яичников в природных популяциях малярийного комара Anopheles messeae Fall. // Генетика. 1997. Т. 33, № 2. С. 281-283.
21. Girod P.A., Nguyen D.Q., Calabrese D. et al. Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells // Nat. Methods. 2007. Vol. 4, № 9. P. 747-753.
22. Avramova Z., Tikhonov A., Chen M., Bennetzen J.L. Matrix attachment regions and structural colinearity in the genomes of two grass species // Nucleic Acids Res. 1998. № 26. P. 761-767.
Поступила в редакцию 03.08.2011 г.
Tomsk State University Journal of Biology. 2011. № 4 (16). P. 157-169
Gleb N. Artemov 12, Gulnar M. Abilkasimova3, Vladimir N. Stegniy1, 2
1Research Institute of Biology and Biophysics of Tomsk State University, Tomsk, Russia 2Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia 3Institute of General Genetics and Cytology, Alma-Ata, Kazakhstan
MOLECULAR-CYTOGENETIC ANALYSIS OF CHROMOSOME ATTACHMENT REGIONS TO NURSE CELLS NUCLEAR ENVELOPE IN Anopheles MALARIA MOSQUITOES OF «maculipennis» SUBGROUP
The interphase nucleus spatial organization has been a current problem. Internucleus architecture is provided by interactions of chromosomes with nuclear envelope and each other. Malaria mosquitoes are extremely useful for nucleus architecture investigation because their close related species differ by nurse cells chromosomes spatial
organization. The goal of our research is comparative analysis of DNA of XL chromosome attachment region of Anopheles messeae Fall. and chromosomes attachment regions sequence of «maculipennis» subgroup malaria mosquitoes (An. atroparvus Thiel., An. beklemishevi Steg, et Kab., An. maculipennis Mg. u An. melanoon Hackett.). XL chromosome An. messeae is connected with nuclear cover by region that is located in the middle of the chromosome arm. The benefit of this work is researching a region that is not pericentromeric. Therefore, the attachment region DNA analysis without pericentromeric region sequences (per se) is possible. DNA from XL chromosome attachment region of An. messeae nurse cells was separated with the help of microdissection and subsequent DOP-PCR amplification. Fluorescent in situ hybridization of this DNA with «maculipennis» subgroup malaria mosquitoes chromosomes revealed that XL chromosome attachment region of An. messeae contains the sequences including pericenromeric heterochromatin. We propose, decreasing the number of sites contained DNA from XL chromosome attachment region of An. messeae during subgroup forming. Moreover, in An. maculipennis u An. messeae conservative sequences decreasing in intercalary heterochromatin its accumulation can occur in chromosomes 2, 3R and XL pericentric a-heterochromatin.
The sequences of XL chromosome attachment region of An. messeae and other mosquitoes chromosome regions with ß-heterochromatin morphology, including chromosome without attachment regions, do not differ significantly. Probably, XL chromosome attachment region of An. messeae consists of repeated sequences of different classes: universal for heterochromatic regions and taking part in XL chromosome spatial organization. Homeiological to XL chromosome attachment region of An. messeae regions are located in the middle of the chromosome arm in ancestral species and even ne-arctic specimen - An. beklemishevi always. Therefore, An. messeae XL chromosomes with the attachment region in the middle of arm appearance are not connected with chromosomes rearrangements (e.g. inversion) but could be initiated through the DNA sequences reorganization. The transposition of transposable elements, containing SAR/ MAR sequences, is one of the ways to create new chromosome attachment regions to nuclear envelope.
Key words: nucleus spatial organization; chromosome attachment regions to the nucleus envelope; heterochromatin; malaria mosquitoes; Anopheles.
Received August 3, 2011
