Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и Востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов

Нечаева Юлия Сергеевна; Боронникова Светлана Витальевна; Видякин Анатолий Иванович; Пришнивская Яна Викторовна; Юсупов Руслан Равильевич

УДК 575.22:574.3:582.475 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ ХВОЙНЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ НА УРАЛЕ И ВОСТОКЕ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ И ВОЗОБНОВЛЕНИЯ ЛЕСНЫХ РЕСУРСОВ

Р.Р. Юсупов1

1 Пермский государственный национальный исследовательский университет 2 Институт биологии Коми научного центра УрО РАН, г. Сыктывкар

Поступила в редакцию 12.05.2014

Установлены эффективные ISSR-праймеры для выявления генетического полиморфизма для Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. В четырех изученных популяциях P. sylvestris выявлены 117 ISSR-маркеров, а в четырех изученных популяциях L. sibirica - 126 ISSR-маркера. Доля полиморфных локусов (P95) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,949 у P. sylvestris и 0,968 у L. sibirica. Ожидаемая гетерозиготность изученных популяций лиственницы сибирской составила 0,171, а сосны обыкновенной - 0,138. Анализ генетической структуры изученных популяций показал, что популяции P. sylvestris дифференцированы в большей степени (GST=0,567), чем популяции L. sibirica (Gst=0,403). Даны рекомендации для сохранения и возобновления лесных ресурсов с учетом генетического разнообразия и генетической структуры популяций лесообразующих видов хвойных растений.

Ключевые слова: генетический полиморфизм, ISSR-маркеры, генетическая структу-ра,дифференциация, Pinus sylvestris L., Larix sibirica Ledeb.

Актуальной проблемой сохранения лесных ресурсов является учет генетического разнообразия и особенностей генетической структуры популяций видов хвойных растений при отборе деревьев и популяций для восстановления и сохранения лесов [1]. При анализе полиморфизма больших геномов растений, включая и геномы голосеменных растений, важно выявить полиморфные и стабильно воспроизводящиеся при повторных полимеразных цепных реакциях (ПЦР) ДНК-маркеры. Для определения генетической структуры и дифференциации популяций видов хвойных растений активно используются молекулярные маркеры, основанные на микросателлитах [2]. Для молекулярно-генетического анализа впервые был избран метод межмикро-

Нечаева Юлия Сергеевна, младший научный сотрудник. E-mail: yulianechaeva@mail.ru Боронникова Светлана Витальевна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой ботаники и генетики растений, ведущий научный сотрудник. E-mail: SVBoronnikova@yandex.ru Видякин Анатолий Иванович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник. E-mail: les@aiv. kirov. ru

Пришнивская Яна Викторовна, инженер-исследователь

Юсупов Руслан Равильевич, студент

сателлитного анализа (ISSR-Inter Simple Sequence Repeats). Метод основан на использовании ПЦР с одним или несколькими праймера-ми длиной 15-24 нуклеотида. Праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера. В геномах растений количество микросателлитных повторов очень велико, что делает этот метод удобным для генетического анализа [3]. Несмотря на изученность многих аспектов популяционной биологии видов хвойных растений [4-6] генетические ресурсы многих лесообразующих видов хвойных России, включая популяции сосны обыкновенной и лиственницы сибирской, в том числе на Урале и в восточной части Европейской части России, остаются слабоизученными. Эффективность решения задач популяционной биологии многих видов зависит от изученности различных элементов генома и их полиморфизма.

Цель работы: получение качественно новой информации при оценке генетического разнообразия, генетической структуры и дифференциации популяций сосны обыкновенной и лиственницы сибирской с использованием меж-микросателлитного анализа полиморфизма ДНК.

Материал и методика исследования.

Объектами исследований являются восемь популяций двух видов хвойных растений из семейства Pinaceae: сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.). Две популяции P. sylvestris расположены в Республике Коми: около п. Морди-но (Ps_1) и около п. Визинга (Ps_2), а две - в Кировской области в Шабалинском лесничестве (Ps_3) и в Ежихинском лесничестве (Ps_4). Три изученные популяции L. sibirica расположены в Пермском крае: около п. Полазна (Ls_1), около г. Оса (Ls_2) и около г. Очер (Ls_4), а одна популяция L. sibirica - в Сверд-ловской области около п. Билимбай (Ls_3).

Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса [7], модифицированной использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinyl-polypyrrolidone). ДНК была выделена из свежих почек, собранных от каждого дерева индии-видуально. В каждой популяции изучено от 30 до 46 деревьев. Расстояние между деревьями не менее 50 м. Навеска растительного материала составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК P. sylvestris и у 160 проб ДНК L. sibirica с пятью праймерами посредством ПЦР. Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris ампли-фицировано 920 проб ДНК, а у L. sibirica - 800 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл. Эффективность праймеров по выявлению полиморфизма ДНК рассчитывали в соответствии со шкалой 1-5: от низкой (1) до высокой (5) [8]. Каждый праймер индивидуально был анализирован в ПЦР с геномной ДНК исследуемых видов.

Для ПЦР ISSR-методом объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера , 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t° отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52° до 64°С. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизиро-ванной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в

1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA).

Компьютерный анализ полученных данных [9] проведен с помощью программы POPGENE 1.31 и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов (P95), абсолютного числа аллелей (na), эффективного числа аллелей (ne), ожидаемой гетерозиготности (HE). Для описания генетической структуры популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HT) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (HS) в субпопуляции как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля меж-популяционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразде-ленности популяций (GST).

Экспериментальная часть и обсуждение результатов. Протестировано 20 и выявлено 5 наиболее эффективных ISSR-праймеров для каждого из двух исследуемых видов. Лишь два праймера (X10 и CR-215) оказались эффективными (5 баллов) для обоих изученных видов (табл. 1). Установлены по 3 специфических эффективных ISSR-праймера для сосны обыкновенной и для лиственницы сибирской. Для сосны обыкновенной эффективными являются 4 динуклеотидных праймера и один трехнуклео-тидный (в зависимости от числа нуклеотидов в коровом повторе), а для лиственницы сибирской 2 эффективных праймера динуклеотидные, а 3 -тринуклеотидные (табл. 1). В изученных 4 популяциях P. sylvestris выявлены 117 ISSR-марке-ров, а в 4 же популяциях L. sibirica - 126 ISSR-маркеров. Число амплифицированных ISSR-маркеров P. sylvestris варьировало в зависимости от праймера от 13 (праймер M27) до 21 (прайме-ры X10 и CR215) а их размеры - от 150 до 1400 пн. В среднем один ISSR-праймер инициировал у P. sylvestris синтез 16,7 фрагментов ДНК. В изученных же популяциях L. sibirica число ам-плифицированных ISSR-маркеров варьировало в зависимости от праймера в большей степени - от 11 (праймер M3, ISSR8) до 29 (праймер M9); диапазон длин ISSR-маркеров также шире - от 210 до 2240 пн. Один lSSR-праймер у L. sibirica инициировал синтез 17,1 фрагментов ДНК.

Таблица 1. Эффективность ISSR-праймеров для изучения генетического полиморфизма двух видов хвойных растений

ISSR-праймер Эффективность праймера ISSR-праймер Эффективность праймера

для P.sylvestris для L.sibirica для P.sylvestrisis для L.sibirica

M1 (AC)8CG 2 3 ISSR-5 (AG)8CA 2 3

M2 (AC)8CC 4 1 ISSR-6 (AG)8CG 4 3

M3 (AC)8CT 3 5 ISSR-7 (CTC)6C 2 3

M27 (GA)8C 5 2 ISSR-8 (GAG)6C 3 5

M9 (GAC)SAC 2 5 ISSR-9 (ACG)vG 1 4

X10 (AGC)6C 5 5 ISSR-10 (ATG)vC 1 4

X11 (AGC)6G 3 4 CR-212 (CT)8TG 5 2

ISSR-1 (AC)8T 5 4 CR-215 (CA)6GT 5 5

ISSR-3 (TG)8AA 4 1 CR-216 (GA)6GG 3 4

ISSR-4 (TG)8GC 1 1 CR-217 (GT)6GG 1 3

Примечание: эффективность праймеров от 1 (низкая) до 5 (высокая) определена по шкале, предложенной Р.Н. Календарем и С.В. Боронниковой (2007).

Установлено, что доля полиморфных ло-кусов (P95) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,949 у P. sylvestris и 0,968 у L. sibirica (табл. 2). Число полиморфных маркеров в общей выборке P. sylvestris варьировало от 19 до 28, а доля полиморфных локусов (P95) в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,880 до 1,000. Число полиморфных маркеров полиморфизма в общей выборке второго изученного вида растений L. sibirica изменялось от 21 до 35, а доля полиморфных локусов (P95) в зависимости от ISSR-праймера варьировала от 0,917 до 1,000. Ожидаемая гетерозиготность (НЕ) по локусам (один из основных показателей генетического разнообразия на популяционном уровне) выше (табл.

2) в общей выборке L. sibirica (Н^=0,171) по сравнению с P. sylvestris Нё=0,138). Ожидаемая гетерозиготность выше в первой популяции P. sylvestris Нё=0Д86) и ниже в третьей популяции Н=0,088). Этот показатель самый высокий в четвертой популяции L.sibirica (Н^=0,194) и самый низкий во второй популяции L. sibirica (НЕ =0,130). Эффективное число аллелей (ne) оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых в популяции ожидаемая гетерозиготность будет равна фактической [10]. Этот показатель выше (табл. 3) в общей выборке P. sylvestris (ne=1,549) по сравнению с L. sibirica (ne=1,421).

Таблица 2. Генетическое разнообразие популяций P. sylvestris и L. sibirica

По- На общую выборку P. sylvestris На общую

каза за- тели Ps_1 Ps_2 Ps_3 Ps_4 Ls_1 Ls_2 Ls_3 Ls_4 выборку L. sibirica

Р95 0,739 0,827 0,442 0,500 0,949 0,909 0,678 0,769 0,876 0,968

НЕ 0,186 0,183 0,088 0,093 0,138 0,172 0,130 0,190 0,194 0,171

(0,018) (0,018) (0,014) (0,015) (0,016) (0,017) (0,015) (0,017) (0,017) (0,017)

Па 1,556 1,539 1,299 1,325 1,949 1,556 1,452 1,556 1,619 1,968

(0,499) (0,501) (0,460) (0,470) (0,222) (0,499) (0,499) (0,499) (0,488) (0,176)

Пе 1,312 1,308 1,143 1,152 1,549 1,286 1,211 1,315 1,319 1,421

(0,360) (0,359) (0,278) (0,287) (0,351) (0,351) (0,313) (0,348) (0,346) (0,302)

R 7 3 2 4 16 5 7 4 4 20

Примечание: HE - ожидаемая гетерозиготность; na - абсолютное число аллелей на локус; ne - эффективное число аллелей на локус; у всех вышеуказанных параметров в скобках даны стандартные отклонения; R - число редких маркеров, в скобках указана их доля от общего числа фрагментов; популяции P. sylvestris: Ps_1, Ps_2, Ps_3, Ps_4; популяции L.sibirica: Ls_1, Ls_2, Ls_3, Ls_4.

Анализ генетической структуры изученных популяций P. sylvestris показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции (HT) составила 0,317, а в субпопуляциях (Hs) - 0,137. Коэффициент подразделенно-сти популяций P.sylvestris (GST) равен 0,567

(табл. 3). У изученных популяций Ь sibirica показатели, характеризующие генетическую структуру ниже. Так, Нт=0,287, а составил 0,171. Следовательно, и коэффициент подразделенно-сти популяций L. sibirica меньше (С^^0,403).

Таблица 3. Генетическая структура и дифференциация изученных популяций

P. sylvestris и L.Sibirica

ISSR-прай-мер Нуклеотид-ная последовательность (5'- 3') HT Hs GST ISSR-прай-мер Нуклеотид-ная последовательность (5'- 3') Ht Hs GST

X10 (AGC)6C 0,325 (0,024) 0,127 (0,008) 0,565 X10 (AGC)6C 0,297 (0,030) 0,100 (0,006) 0,663

CR-215 (CA)6GT 0,325 (0,026) 0,172 (0,009) 0,472 CR-215 (CA)6GT 0,259 (0,034) 0,176 (0,015) 0,319

M27 (GA)8C 0,295 (0,034) 0,124 (0,007) 0,579 М3 (AC)8CT 0,308 (0,020) 0,211 (0,015) 0,314

ISSR-1 (АС)8Т 0,356 (0,028) 0,143 (0,014) 0,600 ISSR-8 (GAG)6C 0,338 (0,023) 0,146 (0,011) 0,567

CR-212 (CT)8TG 0,290 (0,031) 0,126 (0,012) М9 (GAC)sAC 0,255 (0,020) 0,206 (0,012) 0,191

На общую выборку P. sylvestris 0.317 (0.028) 0.137 (0.010) 0,567 На общую выборку L.sibirica 0,287 (0,025) 0,171 (0,013) 0,403

Примечание: HT — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; Hs — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционно-го разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; Gst — доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

Для характеристики генетической структуры популяций важны редкие, то есть встречающиеся с частотой менее 5% маркеры. В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 16 редких ISSR-маркеров, из которых наибольшее число (R=7) отмечено в популяции Ps_1, а наименьшее (R=2) в популяции Ps_3. В изученных популяциях L. sibirica выявлено 20 редких ISSR-маркеров, при этом их число варьировало в зависимости от популяции от 4 до 7 (табл. 2).

Выводы и рекомендации: для Pinus sylvestris L. и Larix sibirica Ledeb. установлены эффективные ISSR-праймеры для выявления генетического полиморфизма. В 4 изученных популяциях P. sylvestris выявлены 117 ISSR-маркеров, а в 4 изученных популяциях L. sibirica - 126 ISSR-маркеров. Доля полиморфных локу-сов (Р95) высока в изученных популяциях обоих видов: 0,949 у P. sylvestris и 0,968 у L. sibirica. Ожидаемая гетерозиготность изученных популяций лиственницы сибирской составила 0,171, а сосны обыкновенной - 0,138. Анализ генетической структуры изученных популяций показал, что популяции P. sylvestris дифференцированы в большей степени (GS^0,567), чем популяции L. sibirica (GS^0,403).

Для сохранения и возобновления лесных ресурсов с учетом генетического разнообразия для P. sylvestris рекомендуется использовать две популяции из республики Коми (Ps_1 Ps_2), а для L. sibirica - одну популяцию из центральной части Пермского края около п.Полазна (Ls_1). При отборе деревьев для лесовосстановления необходимо учитывать генетическую структуру природных популяций, устойчивое сочетание гомозиготных и гетерозиготных генотипов, а также наличие редких ISSR-маркеров, которые наряду с другими маркерами могут быть использованы и для идентификации популяций, в том числе для генетического контроля происхождения древесины [10, 11].

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России и гранта РФФИ (проект № 12- 04-00062-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Биоразнообразие лиственниц Азиатской России / Отв. ред. С.П. Ефремов, Л.И. Милютин; Рос. академ. наук, Сиб. отд-ние, Ин-т леса им. В.Н. Сукачева. - Новосибирск: Академ. изд-во «Гео», 2010. 159 с.

2. Орешкова, Н.В. Генетическое разнообразие, попу-ляционная структура и дифференциация лиственниц сибирской, гмелина и каяндера по данным SSR-маркеров / Н.В. Орешкова, М.М. Белоконь, С. Жамъянсурен // Генетика. 2013. Т 49. №2. С. 204213.

3. Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski, D. Labuda // Genomics. 1994. V. 20. Р. 176-183.

4. Власенко, В.Э. Лесные сообщества в системе особо охраняемых природных территорий Свердловской области / В.Э. Власенко, ВА. Галако, О.В. Ерохина, Л.А. Пустовалова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. Т. 15. №3(2). С. 814-818.

5. Политов, Д.В. Генетика популяций и эволюционные взаимоотношения видов сосновых (Сем. Pinaceae) Северной Евразии: автореф. дис... д-ра биол. наук. - М.: ИОГен, 2007. 47 с.

6. Видякин, А.И. Популяционная структура сосны обыкновенной на востоке европейской части России: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Екатеринбург: ИЭРиЖ, 2004. 48 с.

7. Rogers, S.O. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant

tissues / S.O. Rogers, A.J. Bendich // Plant Molecular Biology. 1985. V. l. № 19. P. 69-76.

8. Календарь, Р.Н. Анализ молекулярно-генетичес-кого полиморфизма природных популяций редких видов растений Урала с помощью ретротранспозо-нов / Р.Н. Календарь, С.В. Боронникова // Материалы Четвертого Моск. межд. конгр. «Биотехнология состояние и перспективы развития». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Мен-делееева, 2007. Ч.2. 121 с.

9. Молекулярная генетика / под ред. С.В. Боронниковой. Учеб.-метод. пособие. - Пермь: Перм.ун-т., 2007. 150 с.

10. Шереметьева, И.Н. Оценка генетического разнообразия островных и материковых популяций дальневосточной полевки Microtus fortis (Rodentia, сг^tidae): данные RAPD-PCR анализа / И.Н. Шереметьева, Г.Н. Челомина // Биол. исследования на островах северной части Тихого океана. - Владивосток. 2003. № 9. С. 1-18.

11. Боронникова, С.В. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края. Монография. -Пермь: -Перм. гос. нац. исслед. ун-т, 2013. 239 с.

MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF CONIFER PLANTS POPULATIONS IN URALS AND EAST EUROPEAN PART OF RUSSIA FOR CONSERVATION AND REPRODUCTION THE FOREST RESOURCES

1 Perm State National Research University

2 Institute of Biology, Komi Scientific Center, UB RAS, Sykryvkar

?

Selected informative ISSR-primers for two coniferous species: Pinus sylvestris L. and Larix sibirica Ledeb. In four studied populations of P. sylvestris identified 117 ISSR-markers, and in four populations of L. sibirica identified 126 ISSR-markers. The proportion of polymorphous loci is high in both species: 0,949 for P. sylvestris and 0,968 for L. sibirica. Expected heterozygosity in the populations of L. sibirica was 0,171 and in the populations of P sylvestris it was 0,138. The analysis of populations genetic structure showed that populations of P. sylvestris more differentiated (GST=0,567), than the population of L. sibirica (GST =0,403). We made recommendations for conservation and reproduction of forest resources based on the genetic diversity and population structure of studied species.

Key words: genetic polymorphism, ISSR-markers, genetic structure and differentiation of populations, Pinus sylvestris L., Larix sibirica Ledeb.

Yuliya Nechaeva, Minor Research Fellow. E-mail: yulianechaeva@mail.ru Svetlana Boronnikova, Doctor of Biology, Professor, Head of the Botany and Plants Genetics Department, Leading Research Fellow. E-mail: SVBoronnikova@yandex. ru Anatoliy Vedyakin, Doctor of Biology, Leading Research Fellow. E-mail: les@aiv.kirov.ru Yana Prishnivskaya, Engineer-Researcher Ruslan Yusupov, Student