CC BY
78
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
УДК 616.348/.351-006.04-092:612.336.31]-078:577.21.08
Нгуен Н.Т.1, Вафин Р.Р.1,2, Ржанова И.В.1, Колпаков А.И.1, Гатауллин И.Г.3,4, Тюлькин С.В.5,
Синягина М.Н.1, Григорьева Т.В.1, Ильинская О.Н.1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИз МИКРООРГАНИЭМОВ С ВНУТРИЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ИНВАЗИЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ
КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ
1ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Минобрнауки РФ, 420008, Казань, Российская Федерация; 2ФГБНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАН, Казань, 420059, Казань, Российская Федерация; 3ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» Министерства здравоохранения Республики Татарстан, 420002, Казань, Российская Федерация; 4ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, 420012, Казань, Российская Федерация; 5ФГБУ Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория Россельхознадзора РФ, 420087, Казань, Российская Федерация
Факультативно аэробные гетеротрофные бактерии, выделенные со слизистой оболочки прямой кишки больных колоректальным раком в зоне злокачественной опухоли и с прилежащей нормальной слизистой оболочки, подвергали молекулярно-генетическому исследованию. Видовую принадлежность бактерий определяли на основании культурально-морфологических признаков и данных секвенирования локуса 16S rRNA. Микроорганизмы с внутри-эпителиальной инвазией в слизистую оболочку прямой кишки идентифицированы как представители адгезивно-инвазивной (AIEC) подгруппы Escherichia coli и вида Klebsiella pneumoniae. Молекулярный анализ по генетическим детерминантам, контролирующим адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности, показал, что некоторые изоляты бактерий обладали способностью продуцировать токсины с потенциальным канцерогенным действием, в частности, колибактин и цитотоксический некроти-зирующий фактор 1. У определенного вида бактерий, выделенных с малигнизированного и нормального эпителия толстой кишки одного и того же пациента, различий в проанализированных генах факторов токсигенности не выявлено. Ключевые слова: колоректальный рак; Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; колибактин; цитотоксический некроти-зирующий фактор 1; идентификация; ПЦР; секвенирование.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-13-18
Микрофлора кишечника человека вносит существенный вклад в процесс возникновения и развития колорек-тального рака. Ассоциированные с микробным сообществом механизмы канцерогенеза включают генотоксиче-ское действие ряда бактериальных токсинов, таких как колибактин, цитолетальный растягивающий токсин fcytolethal distending toxin - CDT), цикл-ингибирующий фактор (cycle inhibiting factor - CIF), цитотоксический некротизирующий фактор 1 (cytotoxic necrotizing factor 1 - CNF1) [1, 2]. Вышеперечисленные токсины способны продуцировать различные виды микроорганизмов. Так, колибактин, приводящий к онкогенным мутациям вследствие двухспиральных разрывов в ДНК, вырабатывают, помимо некоторых штаммов Escherichia coli, также представители видов Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes и Citrobacter koseri, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae [3].
Значительный массив данных свидетельствует о способности адгезивно-инвазивных штаммов E. coli колони-
Для корреспонденции: Ильинская Ольга Николаевна, e-mail: Olga. Ilinskaya@kpfu.ru
Corresponding author: Il'inskaya Ol'ga Nikolaevna, e-mail: Olga. Ilinskaya@kpfu.ru
зировать слизистую оболочку толстого кишечника больных колоректальным раком [2, 4]. Кроме того, показано, что у 48% больных колоректальным раком численность условно-патогенной микрофлоры повышена, при этом среди членов микробного сообщества кишечника у 13,5% пациентов идентифицированы K. pneumoniae, у 7,6% -Enterobacter spp., у 3,8% - Citrobacter spp. [5], - то есть бактерии, способные к синтезу генотоксичных метаболитов [3]. В связи с этим вполне обоснованным выглядит предположение, что молекулярная основа эпидемиологической связи между колоректальным раком и K. pneumo-niae, активно колонизирующей слизистую оболочку кишечника [6] и продуцирующей колибактин [7], обусловлена канцерогенными свойствами колибактина [3].
В данной работе проведен молекулярно-генетический анализ факультативно аэробных бактерий, выделенных из биоптатов малигнизированного и прилегающего нормального эпителия прямой кишки, полученных во время операционного вмешательства от больных колоректаль-ным раком. Целью исследования явилось выявление и сравнение генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую и токсигенную активности, у доминирующих изолятов E. coli, ассоциированных с нормальным и онкотрансформированным эпителием толстого кишечника.
Материал и методы
Исследовали 6 образцов микробных культур, выделенных на мясопептонном агаре от 3 больных колоректальным раком, попарно, как из злокачественной опухоли слизистой оболочки прямой кишки (образцы Tru26o, Shi1o, Ef15o), так и из нормальной слизистой оболочки (образцы Tru26n, Shi1n, Ef15n). Отбор биоптатов осуществляли в соответствии с разрешением Этического комитета Казанской государственной медицинской академии (протокол № 4 от 7 мая 2009 г.). Биоптат инкубировали 1 ч в 1 мл стерильного физиологического раствора при 37°С, затем 100 мкл раствора высевали на мясопептонный агар и выращивали до появления колоний. Геномную ДНК из культур микроорганизмов выделяли с применением набора "ДНК-сорб Б", (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Образцы хранили при -20°С. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплифи-каторе MJ Mini Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Детекцию результатов ПЦР-анализа осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере TBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (1 = 310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
Перечень используемых в работе олигонуклеотидных праймеров
№ Локус Название олигонуклеотидных праймеров, их последователь- ПЦР-продукт Ссыл-
пп. гена ность и длина (н.) (п.н.) ка
1 16S rRNA ITS-F: 5'-GATTAGATACCCTGGTAG-3' (18 н.) ITS-R: 5'-AGTCACTTAACCATACAACCC-3' (21 н.) 1215 [8]
2 papC papC-F: 5'-CGTTCGCCGGGTATCGTTTCTCAG-3' (24 н.) papC-R: 5'-CCCGTTCCCCAGCGATTTGTCAC-3' (23 н.) 724 [9]
3 papH papH-F: 5'-TTAAAGATAATCGGGTCAT-3' (19 н.) papH-R: 5'-GGAATCAGAGAAAAGGTT-3' (18 н.) 858 [9]
4 afa afa-f: 5'-GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC-3' (25 н.) afa-r: 5'-CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG-3' (25 н.) 750 [10]
5 eae Eae-f: 5'-TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT-3' (23 н.) Eae-r: 5'-GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG-3' (24 н.) 482 [11]
6 bfpA bfpA_114F: 5-GTCTGCGTCTGATTCCAATA-3 (20 н.) bfpA_521R: 5'-TCAGCAGGAGTAATAGC-3' (17 н.) 408-414 [12]
7 hlyA hlyA-F: 5'-GCATCATCAAGCGTACGTTCC-3' (21 н.) hlyA-R: 5'-AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT-3' (22 н.) 534 [13]
8 lthB LT-f: 5-ACGGCGTTACTATCCTCTC-3' (19 н.) LT-r: 5'-TGGTCTCGGTCAGATATGTG-3' (20 н.) 273 [11]
9 sta STa-1: 5'-GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA-3' (28 н.) STa-2: 5'-AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA-3' (28 н.) 190 [14]
10 stx VTcom-f: 5'-GAGCGAAATAATTTATATGTG-3' (21 н.) VTcom-r: 5'-TGATGATGGCAATTCAGTAT-3' (20 н.) (294) 518 [11]
11 pks pks-f: 5'-ATTCGATAGCGTCACCCAAC-3' (20 н.) pks-r: 5'-TAAGCGTCTGGAATGCAGTG-3' (20 н.) 2119 [2]
12 cnf1 CNF-1s: 5'-GGGGGAAGTACAGAAGAATTA-3' (21 н.) CNF-1as: 5'-TTGCCGTCCACTCTCACCAGT-3' (21 н.) 1112 [2]
13 cdtB-I CDT-I-s: 5'-CAATAGTCGCCCACAGGA-3' (18 н.) CDT-I-as: 5'-ATAATCAAGAACACCACCAC-3' (20 н.) 411 [2]
14 cdtB-IV CDT-IV-s: 5'-CCTGATGGTTCAGGAGGCTGGTTC-3' (24 н.) CDT-IV-as: 5'-TTGCTCCAGAATCTATACCT-3' (20 н.) 350 [2]
15 cif cif-int-s: 5'-AACAGATGGCAACAGACTGG-3' (20 н.) cif-int-as: 5'-AGTCAATGCTTTATGCGTCAT-3' (21 н.) 383 [2]
Выявление генетических детерминант, контролирующих адгезивную (papC, papH, afa, eae, bfpA), гемолитическую (hlyA) и токсигенную (lthB, STa, Stx, pks, cnfl, cdtB, cif) активности, проводили с использованием праймеров, выбранных в соответствии с данными литературы преимущественно для генодиагностики E. coli и представленных в табл. 1.
В работе использовали реактивы для молекулярно-био-логических исследований производства ООО "ДНК-синтез" (Россия), НПО "СибЭнзим" (Россия) и Applied Biosystems (США).
Секвенирование продуктов амплификации локусов 16S rRNA, pks и cnf1 проводили на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100" (Applied Biosystems, США). Секвенированные последовательности локусов 16S rRNA, pks и cnf1 выравнивали в соответствии c опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями ряда референтных штаммов микроорганизмов, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83).
Результаты и обсуждение
Проверка обсемененности биоптатов выявила, что количество факультативно аэробных гетеротрофов, плотно ассоциированных с тканью слизистой прямой кишки, невелико, и соответствует величине до 80 ко-лониеобразующих единиц на биоптат среднего размера (около 1-8 мм3). На основании морфологических и культуральных признаков выделенных бактериальных культур 3 пары типичных изолятов от 3 пациентов были идентифицированы как E. coli. Секвенирование локуса 16S rRNA 6 исследованных изолятов на предмет видо-
Таблица 1 вой идентификации подтвердило принадлежность Tru26n, Shilo, Shiln, Ef15o к E. coli. Сравнение идентификационных SNP-позиций в анализируемых локусах 16S rRNA исследуемых образцов микробных культур и референтных штаммов E. coli (ABU 83972, UT189, UM146, BL21) и K. pneumoniae (KPNIH33) выявило наличие двойных пиков флуоресценции в позициях 459-460 и 507-508 для образцов Tru26o и Ef15n (рис. 1), что позволяет сделать вывод о том, что эти образцы представляют собой смешанную культуру микроорганизмов E. coli и K. рneumoniae, растущую в тесной ассоциации.
Числовые значения SNP-позиций в анализируемых ло-кусах 16S rRNA были заданы последовательностью прайме-ра ITS-F: 5'-GATTAGATACCC-TGGTAG-3 (позиции 1-18), также использованного в качестве сиквенсного олигонуклео-тида.
Два пика флуоресценции, накладывающихся один на другой в позициях 459-460 и 507-508 для образцов Tru26o и Ef15n, являются наглядной демонстрацией того, что каждый из них представляет собой именно смешанную культуру (см. рис. 1).
При анализе маркерных генов, продукты которых могут вносить вклад в канцерогенез, было обнаружено, что образцы Tru26o, Shi1o, Shi1n давали положительный сигнал амплификации по локусу кодирующего колибактин pks--гена (рис. 2).
Образец смешанной культуры Ef15n также первоначально генерировал специфичный ампликон локуса pks-гена. Однако выделенная из смешанной чистая культура E. coli (Ef15n*) утеряла это свойство - ее ДНК уже не приводила к амплификации данного ПЦР-продукта (см. рис. 2, трек 6), что свидетельствует о принадлежности pks-гена к геному K. рneumoniae - второго ассоциата этой смешанной культуры.
Секвенирование специфичного ПЦР-продукта длиной 2119 п.н. и последующее выравнивание соответствующих последовательностей ДНК выявило, что образцы Shi1o и Shi1n имели идентичную друг с другом структуру анализируемого локуса pks-гена, отличную всего на одну синонимическую нуклеотидную замену (SNP-позиция 1041) с референтными штаммами E. coli ABU 83972, UTI89 и UM146 (рис. 3).
Нуклеотидная последовательность локуса pks-гена образца смешанной культуры Tru26o, принадлежащая геному K. pneumoniae, была схожа с соответствующими последовательностями референтных штаммов видов K. pneumoniae (штамм KPNlH33), а также C. koseri (штамм ATCC BAA-895) и E. aerogenes (штамм EA1509E), для которых тоже характерно наличие pks-гена (см. рис. 3). Выделенный же из этой смешанной культуры изолят E.
Рис. 1. SNP-позиции в анализируемых локусах 16S rRNA E. coli и K. рneumoniae.
Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР с праймерами pks-f + pks-r (амплификация локусаpks-гена E. coli и K. pneumoniae). Обозначения: 1) Tru26o; 2) Tru26n; 3) Shilo; 4) Shiln; 5) Ef15o; 6) Ef15n+; 7) ОКО.
coli (Tru26o*), подобно Ef15n*, не обладал способностью продуцировать колибактин.
Образцы E. coli Shi1o и Shi1n имели положительный сигнал амплификации по локусу cnfl-гена (цитотоксический некротизирующий фактор 1), что было подтверждено секвенированием специфичного ПЦР-продукта длиной 1112 п.н. (рис. 4).
Данные образцы имели идентичную друг с другом, а также с референтным штаммом E. coli ABU 83972 структуру анализируемого локуса cnfl-гена, установленную в результате выравнивания соответствующих секвениро-ванных последовательностей ДНК (рис. 5).
Таким образом, из 6 изолятов E. coli и двух K. pneumoniae (полученных при разделении смешанных культур Tru26o и Ef15n) оба изолята K. pneumoniae и 2 изолята E. coli способны к синтезу колибактина, причем именно эти два изолята E. coli могут также синтезировать цитотоксический некротизирующий фактор 1.
По результатам ПЦР-анализа во всех исследованных
Рис. 3. SNP-позиции в анализируемых локусах pks-гена E. coli, K. pneumoniae, C. koseri и E. aerogenes.
Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР с праймерами CNF-ls+CNF-las (амплификация локуса cnfl -гена E. coli).
Обозначения: 1) Tru26o; 2) Tru26n; 3) Shilo; 4) Shiln; 5) Ef15o; 6) Ef15n;
7) ОКО.
бактериях не выявлено носителей ни одного из перечисленных генов: papC, papH, afa, eae, bfpA, hlyA, lthB, sta, stx, cdtBI, cdtBIV и cif.
Сводный результат молекулярно-генетического анализа бактерий, выделенных от больных колоректальным раком, представлен в табл. 2.
Отсутствие сигнала амплификации по ряду анализированных локусов исключило принадлежность исследуемых бактерий к энтеропатогенной (EPEC), энтеротоксигенной (ETEC), энтерогеморрагической (EHEC), шигатоксиген-ной (STEC) и уропатогенной (UPEC) подгруппам E. coli. Отметим, что по наличию генов факторов токсиген-
ности, проанализированных нами, бактерии из образцов малигнизированного и нормального эпителия слизистой оболочки толстой кишки одного и того же пациента не различаются, хотя между культурами, выделенными от разных пациентов это различие зафиксировано (см. табл. 2). На основании полученных результатов сделаны следующие выводы: 1. Выделенные от больных ко-лоректальным раком микроорганизмы, обладавшие выраженной внутриэпителиальной инвазией в слизистую оболочку прямой кишки, идентифицированы как представители адгезивно-инвазивной (AIEC) подгруппы E. coli и вида K. pneumoniae.
2. Молекулярным анализом выделенных микробных культур установлено присутствие в слизистой оболочке прямой кишки больных колоректальным раком изолятов -продуцентов токсинов канцерогенного действия, таких как колибактин и цитотоксический некротизирующий фактор 1, являющихся патогенетическими онкомаркерами.
3. Факт выявления у всех исследованных пациентов колибактин-продуцирующих изолятов, будь то Es-cherichia coli или Klebsiella pneumoniae, согласуется с эпидемиологической связью идентифицированных микроорганизмов с возникновением колоректально-го рака, что необходимо учитывать при дальнейшем совершенствовании схем диагностических и мониторинговых исследований в отношении данной онкологии.
Благодарности
Работа выполнена в соответствии с Программой повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета с использованием оборудования МЦКП КФУ (ID RFMEFI59414X0003).
This work was performed within the Russian Government Program of Competitive Growth of Kazan Federal University using equipment of Interdisciplinary Center of KFU (ID RFMEFI59414X0003).
Рис. 5. SNP-позиции в анализируемых локусах сп/1 -гена Е. соН.
Таблица 2
Сводный результат молекулярно-генетического анализа изолятов микроорганизмов, выделенных от больных колоректальным
раком
Вид Изолят Анализируемые локусы генов
16S rRNA pap C pap H afa eae bfpA hlyA lthB sta stx cnfl pks cdtB I cdtB IV cf
K. pneumoniae E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli
K. pneumoniae E. coli
Tru26o Tru26o* Tru26n Shi1o Shi1n Ef15o Ef15n Ef15n*
+ + + + + + + +
Обозначение: «+» - наличие анализируемого локуса гена; «-» - его отсутствие.
+
+
Сведения об авторах
Нгуен Тхи Нга (Nguyen Tkhi Nga) - аспирант каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: nn7189@gmail.com
Вафин Рамиль Ришадович (Vafin Ramil' Rishadovich) - д-р биол. наук, гл. науч. сотр. ФГБНУ "Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства" РАН; научный консультант каф. микробиологии института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: vafin-ramil@mail.ru
Ржанова Ирина Владимировна (Rzhanova Irina Vladimirovna) - аспирант каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: rzhanova.i.v@mail.ru
Колпаков Алексей Иванович (Kolpakov Aleksey Ivanovich) - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: ljoscha@mail.ru
Гатауллин Ильгиз Габдуллович (Gataullin Il'giz Gabdullovich) - д-р мед. наук, проф., член-корр. АН РТ, проф. каф. онкологии, радиологии и паллиативной медицины ГБОУ ДПО "Казанская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ; врач-онколог ГАУЗ "Республиканский клинический онкологический диспансер" Министерства здравоохранения Республики Татарстан. E-mail: ilgizg@list.ru
Тюлькин Сергей Владимирович (Tyul'kin Sergey Vladimirovich) - канд. с.-х. наук, зав. отд. вирусологии и генно-молекулярной диагностики ФГБУ "Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория" Россельхознадзора. E-mail: tulsv@mail.ru
Синягина Мария Николаевна (Sinyagina Mariya Nikolaevna) - науч. сотр. НИЛ "Омиксные технологии" Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: marias25@mail.ru Григорьева Татьяна Владимировна (Grigor'eva Tat'yana Vladimirovna) - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. НИЛ "Омиксные технологии" Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ. E-mail: tatabio@inbox.ru
Ильинская Ольга Николаевна (Il'inskaya Ol'ga Nikolaevna) - д-р биол. наук, проф., академик АН РТ, зав. каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Минобрнауки РФ; e-mail: olga. Ilinskaya@kpfu.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Кутихин А.Г., Брусина, Е.Б., Попова Ю.А., Южалин А.Е., Жи-вотовский А.С., Брико Н.И. Связь микрофлоры толстого кишечника с возникновением колоректального рака. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2012; 4: 44-52.
2. Raisch J., Buc E., Bonnet M., Sauvanet P., Vazeille E., de Vallee A. et al. Colon cancer-associated B2 Escherichia coli colonize gut mucosa and promote cell proliferation. World J. Gastroenterol. 2014; 20 (21): 6560-72.
3. Putze J., Hennequin C., Nougayrede J.P., Zhang W., Homburg S., Karch H. et al. Genetic structure and distribution of the colibactin genomic island among members of the family Enterobacteriaceae. Infect. and Immun. 2009; 77 (11): 4696-703.
4. Swidsinski A., Khilkin M., Kerjaschki D., Schreiber S., Ortner M., Weber J. et al. Association between intraepithelial Escherichia coli
and colorectal cancer. Gastroenterology. 1998; 115 (2): 281-286.
5. Старостина М.А., Афанасьева З.А., Губаева М.С., Ибрагимова Н.Р., Сакмарова Л.И. Биоценоз кишечника у больных колорек-тальным раком. Практическая медицина. 2012; 66 (6): 97-9.
6. Hennequin C., Forestier C. OxyR, a LysR-type regulator involved in Klebsiella pneumonia mucosal and abiotic colonization. Infect. and Immun. 2009; 77 (12): 5449-57.
7. Lai Y.C., Lin A.C., Chiang M.K., Dai Y.H., Hsu C.C., Lu M.C. et al. Genotoxic Klebsiella pneumonia in Taiwan. PLoS One. 2014; 9 (5). Available at: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0096292
8. Magray M.S., Kumar A., Rawat A.K., Srivastava S. Identification of Escherichia coli through analysis of 16S rRNA and 16S-23S rRNA internal transcribed spacer region sequences. Bioinformation. 2011; 6 (10): 370-1.
9. Красноперова Ю.Ю., Асеинова Р.В. Некоторые молекулярно генетические механизмы взаимоадаптации штаммов Escherichia coli до и после сокультивирования с простейшими Blastocystis hominis. Вестник новых медицинских технологий. 2009; 16 (1): 12-4.
10. Liu P., Soupir M.L., Zwonitzer M., Huss B., Jarboe L.R. Association of antibiotic resistance in agricultural Escherichia coli isolates with attachment to quartz. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77 (19): 6945-53.
11. Tobias J., Vutukuru S.R. Simple and rapid multiplex PCR for identification of the main human diarrheagenic Escherichia coli. Microbiol. Res. 2012; 167 (9): 564-70.
12. Lacher D.W., Steinsland H., Blank T.E., Donnenberg M.S., Whittam T.S. Molecular evolution of typical enteropathogenic Escherichia coli: clonal analysis by multilocus sequence typing and virulence gene allelic profiling. J. Bacteriol. 2007; 189 (2): 342-50.
13. Hegde A., Ballal M., Shenoy S. Detection of diarrheagenic Escherichia coli by multiplex PCR. Indian J. Med. Microbiol. 2012; 30 (3): 279-84.
14. Kim Y.J., Kim J.H., Hur J., Lee J.H. Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes. Can. J. Vet. Res. 2010; 74 (1): 59-64.
Поступила 16.04.15
REFERENCES
1. Kutikhin A.G., Brusina E.B., Popova YuA., Yuzhalin А.Е., Zhivo-tovskiy А^., Briko N.I. Association of the colonic microflora with the occurrence of colorectal cancer. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. Aktual'nye voprosy. 2012; 4: 44-52. (in Russian)
2. Raisch J., Buc E., Bonnet M., Sauvanet P., Vazeille E., de Vallee A. et al. Colon cancer-associated B2 Escherichia coli colonize gut mucosa and promote cell proliferation. World J. Gastroenterol. 2014; 20 (21): 6560-72.
3. Putze J., Hennequin C., Nougayrede J.P., Zhang W., Homburg S., Karch H. et al. Genetic structure and distribution of the colibactin genomic island among members of the family Enterobacteriaceae. Infect. andImmun. 2009; 77 (11): 4696-703.
4. Swidsinski A., Khilkin M., Kerjaschki D., Schreiber S., Ortner M., Weber J. et al. Association between intraepithelial Escherichia coli and colorectal cancer. Gastroenterology. 1998; 115 (2): 281-286.
5. Starostina M.A., Afanas'eva Z.A., Gubaeva M.S., Ibragimova N.R., Sakmarova L.I. Colon biocoenosis in patients with colorectal cancer. Prakticheskaya meditsina. 2012; 66 (6): 97-9. (in Russian)
6. Hennequin C., Forestier C. OxyR, a LysR-type regulator involved in Klebsiella pneumonia mucosal and abiotic colonization. Infect. and Immun. 2009; 77 (12): 5449-57.
7. Lai Y.C., Lin A.C., Chiang M.K., Dai Y.H., Hsu C.C., Lu M.C. et al. Genotoxic Klebsiella pneumonia in Taiwan. PLoS One. 2014; 9 (5). Available at: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0096292
8. Magray M.S., Kumar A., Rawat A.K., Srivastava S. Identification of Escherichia coli through analysis of 16S rRNA and 16S-23S rRNA internal transcribed spacer region sequences. Bioinformation. 2011; 6 (10): 370-1.
9. Krasnoperova Yu.Yu., Aseinova R.V. The some moleculo-genetic mechanisms of interaction strains Escherichia coli before and after joint growth with the parazits Blastocystis hominis. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2009; 16 (1): 12-4. (in Russian)
10. Liu P., Soupir M.L., Zwonitzer M., Huss B., Jarboe L.R. Association of antibiotic resistance in agricultural Escherichia coli isolates with attachment to quartz. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77 (19): 6945-53.
11. Tobias J., Vutukuru S.R. Simple and rapid multiplex PCR for identification of the main human diarrheagenic Escherichia coli. Microbiol. Res. 2012; 167 (9): 564-70.
12. Lacher D.W., Steinsland H., Blank T.E., Donnenberg M.S., Whittam T.S. Molecular evolution of typical enteropathogenic Escherichia coli: clonal analysis by multilocus sequence typing and virulence gene allelic profiling. J. Bacteriol. 2007; 189 (2): 342-50.
13. Hegde A., Ballal M., Shenoy S. Detection of diarrheagenic Escherichia coli by multiplex PCR. Indian J. Med. Microbiol. 2012; 30 (3): 279-84.
14. Kim Y.J., Kim J.H., Hur J., Lee J.H. Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes. Can. J. Vet. Res. 2010; 74 (1): 59-64.
Received 16.04.15
MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF MICROORGANISMS WITH INTRAEPITHELIAL INVASION ISOLATED FROM PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER
1 Nguyen N. T., 12Vafin R. R, 'Rzhanova I. V., 'Kolpakov A. I, 34 Gataullin I. G, 5Tyulkin S. V.,1 Sinyagina M. N., 'Grigoryeva T. V., 'Ilinskaya O. N.
1 Kazan (Volga region) Federal University, Ministry of Education
and Science of the Russian Federation, Kazan, Russia; 2 Tatar Research Institute of Agriculture, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia; 3Tatarstan Regional Clinical Cancer Center, Ministry of Health of the Republic of Tatarstan, Kazan, Russia; 4 Kazan State Medical Academy, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kazan, Russia; 5 Tatar Trans-regional Veterinarian Laboratory, Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance (Rosselkhoznadzor), Kazan, Russia
The facultative aerobic bacteria isolated from the mucosa of rectum in patients with colorectal cancer in the zone of malignant tumor and neighboring normal mucosa was studied using molecular-genetic methods. The species attribution of bacteria was implemented using the cultural-morphological analysis and sequencing of the 16S rRNA locus. The microorganisms with the intraepithelial invasion to rectal mucosa isolated were identified as representatives of the adherent-invasive (AIEC) subgroup of Escherichia coli and species Klebsiella pneumonia. The molecular analysis by genetic determinants controlling adhesive, hemolytic, and toxigenic activity revealed that some bacterial isolates were able to produce toxins with potential can-cerogenic activity (e.g., colibactin and cytotoxic necrotic factor I). Certain bacterial species isolated from malignant and normal rectum epithelium of the same patient demonstrated no difference between analyzed factors of toxigenicity.
Key words: colorectal cancer, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, colibactin, cytotoxic necrotic factor I, identification, PCR, sequencing.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-13-18
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.861.2:579.22].083.1
Корниенко М.А.1, Копыльцов В.Н.1, Шевлягина Н.В.2, Диденко Л.В.2, Любасовская Л.А.
Припутневич Т.В.3, Ильина Е.Н.1
СПОСОБНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ К ОБРАЗОВАНИЮ БИОПЛЕНОК И ИХ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА
1ФГБУН «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России, Москва, 119435, Малая Пироговская, 1а; 2ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; 3ФГУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ, 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Актуальность изучения стафилококков обусловлена тем, что они вызывают тяжелые инфекционные заболевания: инфекции мягких тканей, эндокардит, сепсис, синдром токсического шока и пищевые отравления. Коагулазоположительный Staphylococcus aureus является основным возбудителем госпитальных инфекций. Он обладает большим количеством факторов патогенности, которые хорошо изучены. Среди коагулазо-отрицательных стафилококков (КОС) клиническое значение имеют S. haemolyticus и S. epidermidis, приводящие к инфекционным процессам у пациентов с ослабленной иммунной системой. Механизмы патогенности КОС изучены недостаточно.
Целью данной работы являлась оценка потенциальной патогенности клинических штаммов КОС по способности к образованию биопленок и характеру взаимодействия с клетками человека, на примере культуры НТ-29. В исследование включены: лабораторный штамм S. aureus АТСС 29213, и клинические штаммы S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1, выделенные из аутопсийного материала новорожденных детей. В данной работе была проведена визуальная оценка образования биопленки каждым штаммом и проанализировано их воздействие на клеточную линию НТ-29. Оба вида КОС образовывали биопленки быстрее, чем S. aureus. При инкубации клеток НТ-29 с изучаемыми штаммами стафилококков через 2 ч наблюдали адгезию бактерий на поверхности клеток. Наиболее ярко выраженно адгезия проявлялась у S. aureus АТСС 29213 и S. haemolyticus SH39. Через 3 ч инкубации под воздействием S. aureus АТСС 29213 и S. haemolyticus SH39 происходила деструкция монослоя клеток НТ-29. Через 24 ч инкубации все три изучаемых штамма вызывали деструкцию монослоя клеток НТ-29. Максимальный токсический эффект на клетки НТ-29 оказывал штамм S. haemolyticus SH39. Совокупные данные свидетельствует о наличии у штамма S. haemolyticus SH39 факторов патогенности, молекулярная природа которых требует дальнейшего исследования.
Ключевые слова: Staphylococcus; биопленки; сканирующая электронная микроскопия; НТ-29.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-18-25
Введение
Стафилококки различных видов могут вызывать такие инфекционные процессы как поражение мягких тканей, эндокардит, остеомиелит, сепсис, пневмонию, синдром токсического шока и пищевые отравления [1, 2], что обусловливает важность их исследования. Общий показатель смертности от бактериемии, вызванной стафилококками, колеблется от 11 до 43% [3]. Среди представителей рода Staphylococcus коагулазоположительный Staphylococcus aureus является основным возбудителем инфекций. Эти бактерии обладают широким набором различных факторов вирулентности и патоген-ности, которые обеспечивают их адгезию и инвазию, формирование биопленок, продукцию токсинов, и способствуют подавлению иммунного ответа человека [4]. Частота послеоперационных осложнений, вызванных метициллин-устойчивыми S. aureus, достигает 33% [5]. Среди коагулазо-отрицательных стафилококков (КОС) клиническое значение имеют виды Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus haemolyticus, приводящие к инфекционным процессам у пациентов с ослабленной иммунной системой [6]. КОС выявляют у 30% пациентов хирургических стационаров, их обнаружение часто ассоциировано с длительным использованием катетеров [7, 8]. Наиболее подвержены КОС инфекциям новорожденные дети [8-12]. Однако по сравнению с S. aureus о факторах вирулентности и патогенности КОС известно существенно меньше [13]. В этой связи целью настоящего исследования являлась оценка потенциальной вирулентности и патогенности клинических штаммов КОС, изолированных из аутопсийного материала новорожденных детей.
3
