CC BY
128
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012 БИОЛОГИЯ Вып. 1
ЭКОЛОГИЯ
УДК 575.174.015.3:582.992
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ РЕДКОГО ВИДА РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ ADENOPHORA LILIFOLIA (Ь.) А. DC.
С. В. Боронникова, Ю. С. Нечаева
Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; SVBoronnikova@yandex.ru; (342)2396229
Технология молекулярно-генетической идентификации и сертификации была апробирована на четырех популяциях редкого реликтового вида растений Пермского края Adenophora Шifolia (Ь.) А. DC. Молекулярно-генетический анализ с использованием двух типов молекулярных маркеров на основе ПЦР позволил выявить сочетания специфических фрагментов ДНК. Составлены молекулярно-генетической формулы, штрихкоды и генетические паспорта популяций, даны рекомендации по сохранению популяционных генофондов этого вида.
Ключевые слова: генетическое разнообразие; полиморфизм; идентификация; паспортизация; ISSR и ГЯАР-маркеры; редкий вид.
Введение
В настоящее время весьма актуальна проблема выбора объектов для сохранения популяционных генофондов редких видов растений, которая может быть решена с использованием молекулярных маркеров и технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации. К числу редких декоративных, имеющих лекарственное значение, видов растений Урала относится Adenophora Шifolia (Ъ.) А. DC. - бубенчик лилиелистный из семейства Сат-рапиіасеае Juss. Вид внесен с категорией 3 (Я, редкий вид) в Красную книгу Пермского края [2008]. Является реликтом [Камелин, Овеснов, Шилова, 1999]. А. ШірНа в Пермском крае находится на границе ареала. В связи с хозяйственным освоением территорий общая численность ценопопуляций А. Шifolia на территории Пермского края за последние 10 лет в среднем сократилась на 15-20% [Красная книга ..., 2008].
Цель работы - провести молекулярно-генетическую идентификацию и паспортизацию четырех ценопопуляций А. Шifolia в Пермском крае и провести отбор ценопопуляций для сохранения генофонда этого вида.
Материалы и методы
Первая ценопопуляция (Ad1) расположена в травяном сосняке на территории историко-
природного памятника (г. Подкаменная) в Кунгур-ском районе Пермского края, вторая ценопопуляция (Ad2) - в березовом редколесье в 2 км на север от с. Енапаево Октябрьского района, третья (Ad3) - в смешанном лесу в 2,5 км на северо-запад от с. Усть-Турка Кунгурского района, а четвертая (Ad4) - на территории парка «Кузьминка» пос. Ильинский Ильинского р-на, являющегося историкоприродным комплексом. Наименьшее географическое расстояние между изученными ценопопуля-циями - 63 км, а наибольшее - 174 км.
Для анализа генетического полиморфизма ДНК A. lilifolia были собраны листья с 35 случайно выбранных особей в каждой популяции на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Выделение ДНК проводили по методике A.M. Torres, N.F. Weeden, A. Martin [1993]. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 720 проб ДНК посредством полимеразной цепной реакции [Молекулярная генетика, 2007] с использованием ISSR-метода (Inter Simple Sequence Repeats) [Zietkiewicz, Rafalski, Labuda, 1994] и IRAP-метода (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) [Kalendar et al., 1999]. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация проведена по методике С.В. Боронниковой [2008]. Для выявления фрагментов ДНК, общих для видов рода Adenophora, выделили ДНК из проростков A. triphylla и провели молекулярногенетический анализ с использованием ISSR- и IRAP-маркеров.
© Боронникова С. В., Нечаева Ю. С., 2012
Результаты и их обсуждение
На первом этапе технологии молекулярногенетической идентификации и паспортизации в избранных для изучениях ценопопуляциях А. Шifolia были собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК и проведен ПЦР-анализ. Кроме этого, геномная ДНК была выделена из проростков двух видов рода Adenophora (А. Шifolia и А. triphylla). На втором этапе разработки технологии в изученных ценопопуляциях А. Шifolia выявлено 56 ISSR- и 149 ШАР-маркеров. Один ISSR
праймер в среднем выявлял 11 маркеров, а один ШАР-праймер - 23,5 маркеров. На третьем этапе технологии были отобраны наиболее информативные для рода Adenohpora ISSR- и ГЯАР-праймеры. На четвертом этапе для особей двух видов рода Adenohpora (А. Шifolia, А. triphylla) выделены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. На пятом этапе идентификационные маркеры ДНК, сочетания которых характерны для ценопопуляций, были представлены в виде молекулярно-генетических формул (таблица).
Молекулярно-генетические формулы популяций А. иЩойа
Популяция Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула
Adi rod Ad r1610iR59; Adr840xio; Adr400^s; Adr370iR96
vid Adlilv1220iR96; Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adlilv440iR56
polimorph Adlilp1100iR57; Adlilp920Mi; Adlilp760iR59; Adlilp670iR56
Ad2 rod Adr840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; Adr420x9
vid Adlilv1050M8; Adlilv920xii; Adlilv 800x9
polimorph Adlilp850Mi; Adlip330Mi; Adlilp500x9
Ad3 rod Adr840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; Adr420x9
vid Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adlilv800x9
polimorph Adlilp700Mi; Adlilp 400xii
Ad4 rod Adr 840xi0; Adr400M8; Adr500Mi; ; Adr420x9
vid Adlilvi050M8; Adlilv920xii; Adliv800x9
polimorph Adlilp750M8; Adlilp600xii
Для паспортизации рода Adenohpora отобрали по 4 фрагмента ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода. Запись фрагмента ДНК в соответствии с предложенной нами ранее методикой молекулярно-генетической паспортизации [Борон-никова, 2008] проводилась с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания нижним индексом праймера. Выявленные фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adenohpora, названы «родовыми» и обозначены первыми буквами названия рода Ad с указателем «г» от «го&> нижним индексом. Полиморфные фрагменты ДНК обозначены индексом «р» от «роИтогрЬ»
На шестом этапе помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетического паспорта популяций использовалась графическая запись в виде штрих-кода (рисунок).
На седьмом этапе рекомендуется составление генетического паспорта популяции. Нами разработана форма генетического паспорта популяции редкого вида растений, избраны общепринятые показатели состояния популяций и генетического разнообразия.
Среди изученных ценопопуляций А. Шifolia типичным генофондом обладает третья ценопопуля-ция (Ad3), так как содержит типичные для региона исследований аллели. К объектам сохранения со специфичными характеристиками генофондов относится ценопопуляция А. Шifolia, расположенная на горе Подкаменной (Ad1), так как содержит наи-
большее число редких, нетипичных для изучаемого региона аллелей. Первая и третья ценопопуля-ции А. Шifolia рекомендуются в качестве объектов для сохранения генетического разнообразия этого вида в Пермском крае.
Заключение
Основным результатом технологии молекулярно-генетической идентификации и паспортизации редких видов растений является механизм обобщения данных молекулярно-генетического анализа посредством выявления идентификационных маркеров. Результаты кластеризации представляются в обобщенном виде молекулярногенетической формулы и штрихкода, вносятся наряду с общепринятыми показателями состояния ценопопуляции и характеристикой ее генетического разнообразия в генетический паспорт. Новый способ записи содержит полную информацию об идентификационном молекулярном маркере, включая вид растения, тип молекулярного маркера, его размер и характеристику исследуемой части генома посредством указания метода анализа полиморфизма ДНК и номера или последовательности праймера. Методика генетической паспортизации на основе ISSR- и ГЯАР-маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации как набора маркеров, так и техники выполнения анализа.
Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация ... Adenophora lilifolia
43
Данная методика может найти применение как при разработке мер охраны и восстановления природных ценопопуляций, так и при идентификации растительного сырья лекарственных растений, яв-Маркер
молекулярной Штрихкод
массы, пн
ляется относительно недорогой и при наличии эффективных 1ЯАР-праймеров пригодна для массового анализа.
1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
№ фрагмента ДНК 1
Обозначение фрагмента Adr 1610ir59
Ad.li.v1220n
Ad.lilp1110iR57
Ad.lilv1050M8
Ad.lilv 930x11 Ad.lilp 920mi Adr 840xi0 Ad. lilp760iR59
700
600
500
400
10
11
12
Ad.lilp670iR56
Ad.lilv 440ir56
Adr 400m8 Adr 370ir96
Штрих-код первой популяции А. Шifolia (Ad1):
Adг - родовые, А(!ШУ- видовые фрагменты ДНК, Ad.lilp - полиморфные фрагменты ДНК
2
9
Для сохранения популяционных генофондов A. lilifolia в Пермском крае рекомендованы третья ценопопуляция (Ad3) с типичным генофондом и первая ценопопуляция (Ad1), обладающая специфическим генофондом.
Работа выполнена в рамках государственного задания на оказание услуг, финансируемых Министерством образования и науки РФ из средств федерального бюджета.
Библиографический список
Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений / Перм. ун-т. Пермь, 2008. 120с. Боронникова С.В. Изучение генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) DC на основе ISSR-маркеров // Генетика. 2009. Т. 45, № 5. С. 652-655.
Красная книга Пермского края / под общ. науч. ред. А.И. Шепеля. Пермь: Кн. мир, 2008. 256 с.
Камелин Р.П., Овеснов С.А., Шилова С.И. Неморальные элементы во флорах Урала и Сибири. Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1999. 83c.
Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под ред. С.В. Боронниковой. Пермь, 2007. 150 с.
Kalendar R. et al. IRAP and REMAP: two new retro-transposon-based DNA fingerprinting techniques // Theor. and Applied Genetics. 1999. Vol. 98. P. 704-711.
Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993. Vol. 5. P. 937-945.
Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. Vol. 20. P. 176-183.
Поступила в редакцию 14.02.2012
The molecular-genetic identification and sertification of rare species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.) А. DC.
S. V. Boronnikova, doctor of biology, professor; SVBoronnikova@yandex.ru; (342)2396229 Y. S. Nechaeva, post-graduate student;Yulianechaeva@yandex.ru Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia,614990
The technology of the molecular-genetic identification and certification was tested on four populations of rare relict species of plants of Perm krai Adenophora lilifolia (L.) А. DC. Molecular-genetic analysis used two types of molecular markers based on PCR revealed a combinations of specific fragments of DNA. Molecular-genetic formula, barcodes and genetic passport of populations were composed, recommendation for the conservation of the gene pool of this species were given.
Key words: genetic diversity; polymorphism; identification; sertification; ISSR and IRAP-markers; rare species.
Боронникова Светлана Витальевна, доктор биологических наук, профессор
Нечаева Юлия Сергеевна, аспирант
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
