CC BY
586
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГЕПАТИТА С (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР)
В обзоре приведены обобщенные литературные данные о структурной организации генома вируса гепатита С; функциональном значении протеинов, кодированных различными зонами вирусной РНК. Особое внимание уделено высокой генетической изменчивости и вариабельности вирусного генома. Рассмотрены современные возможности противовирусного лечения хронического гепатита С. Описаны наиболее широко применяемые молекулярно-генетические методы диагностики гепатита С. Описана диагностическая значимость качественного обнаружения РНК, определения вирусной нагрузки и генотипирования вируса гепатита С в клинической практике и для решения вопросов эпидемиологического надзора за этой инфекцией. Обзор предназначен для специалистов Роспотребнадзора, врачей клинической лабораторной диагностики, эпидемиологов, вирусологов, инфекционистов, студентов медицинских и биологических вузов.
Ключевые слова: строение генома вируса гепатита С, генотипы/субтипы вируса гепатита С, молекулярно-генетические методы диагностики.
Т.Н. Быстрова, Ю.В. Михайлова,
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»
Быстрова Татьяна Николаевна -e-mail: gepatit-bystrova@yandex.ru
The generalized literary data on the structural organization of a genome of a virus of hepatitis C are provided in the review; functional value of the proteins coded by various zones of virus RNA. The special attention is paid to high genetic variability and variability of a virus genome. Modern opportunities of antiviral treatment of chronic hepatitis C are considered. Most widely applied molecular and genetic methods of diagnostics of hepatitis C are described. The diagnostic importance of high-quality detection of RNA, definition of virus loading and genotyping of a virus of hepatitis C in clinical practice and for the solution of questions of an epidemiological surveillance behind this infection is described. The review is intended for specialists of Rospotrebnadzor, clinical laboratory diagnosticians, epidemiologists, virologists, infectiologists, students of medical and biological schools.
Key words: structural organization of a genome of a virus of hepatitis C, genotypes and subtypes of hepatitis C virus, molecular and genetic methods of diagnostics
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы гепатита С (ГС) обусловлена весомым социально-экономическим ущербом и эпидемической значимостью этого заболевания, повсеместным распространением, тяжестью течения, высокой частотой неблагоприятных исходов инфекции, активным вовлечением в эпидемический процесс лиц репродуктивного и трудоспособного возраста. По оценкам экспертов Европейской ассоциации по изучению болезней печени (Париж, 2005) более 500 млн человек в мире инфицированы ГС, до 5 млн проживает в РФ. Только хронической формой инфекции страдают 150-170 млн жителей планеты [1, 2]. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что именно хронические (ХГС) и латентные варианты ГС определяют основную часть эпидемического процесса, социальную значимость и прогноз данной инфекции [1]. Учитывая чрезвычайную сложность структуры эпидемического процесса и многофакторность его разви-
тия, закономерности течения этой инфекции в полной мере не раскрыты до настоящего времени.
На течение инфекционного процесса ГС в постоянно изменяющихся социальных и природных условиях большое влияние оказывает значительная генетическая гетерогенность вируса [3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]. Сравнение молекулярной вариабельности изолятов, выявляемых в разных популяционных группах на конкретной территории, может использоваться для нужд эпидемиологического надзора и в клинической практике. Несмотря на международные усилия по созданию серологических тест-систем для выявления маркеров инфекции, в настоящее время нет равно чувствительных иммунологических тестов к различным генотипам вируса гепатита С (ВГС). Такая ситуация диктует необходимость использования молекулярно-генетических методов для изучения циркуляции различных генетических вариантов ВГС, установления источников инфекции, изучения путей передачи,
прогнозирования эволюционных изменении эпидемиологической ситуации для предотвращения дальнейшего распространения ГС.
1. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ГС - антропонозная вирусная инфекция с гемоконтакт-ным механизмом передачи возбудителя, под которым понимают передачу вируса с кровью и другими биологическими жидкостями при обязательном повреждении кожных покровов или слизистых оболочек. Механизм заражения ГС реализуется с помощью искусственных (различные медицинские и немедицинские манипуляции, связанные с нарушением кожных покровов и слизистых оболочек) и естественных (вертикальный, половой и контактно-бытовой) путей передачи инфекции [13]. В последние годы отмечено снижение доли искусственных путей передачи, в том числе инфицированных при внутривенном введении наркотиков, а также рост доли естественных путей, обеспечивающих сохранение ВГС как биологического вида [14, 15]. ГС-инфекция характеризуется первичной гепатотропностью, полиморфизмом клинических проявлений (феномен «айсберга»), длительным бессимптомным течением, исключительно высокой частотой хронизации (до 75-83%) с возможным переходом в цирроз (у 26-35% лиц с ХГС) и первичный рак печени (у 30-40% больных циррозом). Источниками заражения вирусом служат больные различными формами инфекции (преимущественно с бессимптомным течением). Частота выявления лиц с наличием антител к ВГС (анти-ВГС) в крови в разных регионах РФ заметно варьирует (от 0,7-1,1 до 4,5%). Около 17-25% больных острым ГС (ОГС) выздоравливают спонтанно. Наиболее интенсивно в эпидемический процесс вовлекаются лица в возрасте 18-29 лет [13, 16, 17]. В последние годы отмечен значительный рост заболеваемости у лиц 30-39 лет, что может быть связано с ростом полового пути передачи, а также с естественным переходом больных в более старшую возрастную группу [1, 2]. Что касается социально-профессионального состава больных ГС, то в эпидемический процесс наиболее активно вовлечены неработающие лица, учащиеся ПТУ и техникумов, студенты вузов [13]. К группам высокого риска инфицирования ВГС относятся: лица, употребляющие психоактивные препараты, особенно внутривенно; медицинские работники, имеющие контакт с кровью (прежде всего сотрудники хирургических, реанимационных отделений, гемодиализа, клинико-диагностических лабораторий); дети, родившиеся от больных различными формами ГС; члены семей таких больных; пациенты, получающие множественные парентеральные манипуляции; лица коммерческого секса [13, 17, 18].
2. ВИРУС ГЕПАТИТА С
История открытия вируса
Ранее ГС обозначали как «вирусный гепатит ни-А, ни-В», передающийся парентерально (термин предложен С. Файнстоуном в 1974 году). В 1977 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила его в предложенную тогда номенклатуру вирусных гепатитов, что значительно ускорило этиологическую расшифровку «гепатита ни-А, ни-В». Применение новых молекулярно-биологиче-ских методов исследования позволило М. Houghton в 1988 г. клонировать и секвенировать геном вируса, что определило быструю разработку диагностических препаратов для определения маркеров ВГС. А в 1989 г. К.Чу с коллегами установили, что возбудителем является РНК-содержащий вирус, обладающий оболочкой. Авторы назвали его «вирусом гепатита С» [4, 19]. Исходя из этих данных и физико-химических свойств возбудителя был сделан принципиально важный вывод о возможной принадлежности ВГС к семейству Flaviviridae, роду Hepacivirus [5, 20]. Затем удалось идентифицировать вирус-специфические белки (NS3 - К.Чу, 1989; NS4 - Д.Куо, 1989). В последствие на их основе были созданы коммерческие радиоиммунологические и иммуноферментные тест-системы. А в 1990 г. Э. Уайнер с соавт. разработали метод идентификации генома вируса в сыворотке крови на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью Саузернблота [4].
Строение вириона
По данным Le с соавт. нуклеокапсид вируса имеет форму икосаидра диаметром 50 нм с липидной оболочкой, включающей белковые структуры - выступы высотой 6-8 нм (рис. 1) [20]. Применение поли- и моноклональных антител к Е1-протеину ВГС позволило S. Wotanabe с соавт. локализовать эти белки на оболочке вируса. Для заражения ГС, по сравнению с гепатитом В, необходима большая инфицирующая доза, поскольку концентрация вирусных частиц при ГС не превышает 4lg на 1 мл крови. Они чаще ассоциированы с липопротеинами низкой плотности или находятся в составе иммунных комплексов. От чего зависит величина плавучей плотности частицы вируса [19].
РИС. 1.
Схема строения вириона вируса гепатита С.
Структурная организация генома вируса и кодированные им белки
Нуклеокапсид вируса содержит однонитевую линейную молекулу РНК позитивной полярности длиной 9,4-9,5 тысяч нуклеотидов (рис. 2). В геноме выделяют две зоны: кодирующая структурные белки расположена у 5'-области РНК, кодирующая неструктурные (функциональные) - у З'-области. Одна открытая рамка считывания кодирует полипротеин длиной 3008-3037 а.о., который процесси-руется комбинацией вирусных протеиназ и протеиназ клетки-хозяина. На 5'- и З'-концах генома вируса находится нетранслируемый регион (5'- и З'-NTR) [12, 19, 20].
5'- и З'-некодирующие регионы (5'-, З'-NTR)
Протяженность 5'-NTR РНК ВГС составляет около 340 нуклеотидов. Функция этого участка заключается в инициации трансляции. Специфически связываясь с рибосомами (благодаря наличию внутреннего рибосомального сайта связывания (IRES)) и факторами трансляции клетки-хозяина, он направляет рибосому к инициирующему кодону (AUG) в позиции 342, после чего начинается синтез полипротеина [20, 21].
В 3'-NTR-части РНК ВГС выделяют три отдела: первый -протяженностью в 28-42 нуклеотида, второй - содержащий поли-и-/поли-А-тракт, и третий - терминальный, высококонсервативный участок протяженностью в 98
нуклеотидов [20]. По аналогии с другими флавивирусами можно предположить, что этот участок играет определенную роль в репликации вируса и упаковке нуклеиновой кислоты в вирусную частицу. Наличие в 3'-NTR-регионе РНК ВГС различных изолятов высококонсервативного участка нуклеиновых кислот определяет интерес к этому участку в связи с перспективой разработки эффективных лекарственных препаратов [19, 21].
Соге-регион и кодированные им белки
Участок РНК ВГС, примыкающий к 3'-концу 5'-NTR-региона, протяженностью в 573 нуклеотида, кодирует белок, формирующий капсид вируса (С, или Core). Его С-терминальный регион является необходимым для правильной укладки попипептидной цепи [22]. Выявлено три формы С-белка. Полноразмерная (р21) с молекулярной массой 21 кДа и усеченная (р19), которые обнаружены в мембране эндоплазматического ретикулума. Форма (р16) С-белка, обнаруженная в ядрышках инфицированных гепатоцитов [19, 21]. Он может оказывать влияние на человеческие онкогены, задействованные в развитии гепато-клеточной карциномы у пациентов с ХГС путем супрессии отдельных генов клетки-хозяина. Считается, что С-белки р16 и р21 разнонаправленно влияют на транскрипционную активность опухолевого репрессора р53: первый блокирует, а второй усиливает ее. Таким образом, специфически
ъ
с
¡о
5'NTR
ü
I SPP У SP О NS2-3 pro I NS3 ргоМА
? ш И д л л л
Е1
Е2
NS2
N33
NS4 AI В
NS5 _А_В_
р7
юп
capsid envelope channe|
serine- v NS3-protease \ cofactor
replication
3'NTR
cysteine- NTPase/ protease h el i case
RdRp
Viral assembly
й
J
host factors
RNA replication
РИС. 2.
Организация генома вируса гепатита С (Suzuki T. et aL, 2007): SSP - посттрансляционное расщепление сигнальной пептидазой (SP), RdRp - РНК-зависимая РНК-полимераза.
подавляется апоптоз инфицированных клеток [20]. Кроме того, капсидный белок играет основную роль в индукции митохондриальной дисфункции [23].
На своей поверхности С-белок несет различные высококонсервативные В-клеточные эпитопы, существование которых чрезвычайно важно для выявления анти-ВГС в процессе лабораторной диагностики инфекции. Core-белок обладает способностью связываться с вирусной РНК, а также выполняет регуляторную роль в репликации вируса [19, 21, 24].
Е1- и Е2-регионы и кодированные ими белки
В данном регионе РНК ВГС регистрируется значительная генетическая изменчивость и содержится информация о белках оболочки вируса, участвующих в проникновении вируса в клетку, в развитии иммунитета и ускользании от иммунного ответа организма за счет отбора мутантов, способных уклоняться от действия нейтрализующих антител [19, 20]. Кроме того, на мышиной модели показано, что участок Е1-Е2 совместно с Core ускоряет опухолеобра-зование, блокируя способность клеток к апоптозу [25].
Зоны генома Е1 и Е2 кодируют белки с молекулярной массой 31 и 70 кДа соответственно. Имеются две формы белка Е2: gp70A (E2) и gp70B (E2-p7). Последний в структуре вируса не обнаружен, предполагается его участие в высвобождении вновь синтезированного вириона вируса из инфицированной клетки [19, 20]. Белки Е1 и Е2 сильно гликозилированы и содержат С-терминальный гидрофобный домен, функционирующий как мембранный якорь. Их созревание происходит при удалении С-концевой последовательности сигнальными пептидаза-ми клетки [24]. Установлено, что при отсутствии белка Е2 происходит нарушение пространственной структуры обо-лочечного белка Е1 [19].
Неструктурный регион РНК, кодированные им белки и их функции
В неструктурной зоне, расположенной ближе к З'-концу РНК ВГС, выделяют участки NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B. В отличие от других флавивирусов, в РНК ВГС отсутствует первая зона, кодирующая неструктурные белки (NS1), а к Е2-региону примыкает зона NS2 (рис. 2). Большинство белков, кодированных неструктурными зонами РНК ВГС, необходимо для репликации вируса [19, 20]. Антитела, вырабатываемые на неструктурные белки, не обладают полноценными протективными свойствами в отношении ВГС вследствие его высокой генетической вариабельности [24, 26, 27].
NS2 протеин является трансмембранным белком с молекулярной массой 23 кДа [19]. Его С-конец смотрит в просвет цистерн эндоплазматического ретикулюма, N-конец - в цитозоль. Этот белок является цинк-зависимой аутопротеазой, разрезающей NS2 и NS3 белки [20].
NS3 протеин, с молекулярной массой 70 кДа, выполняет несколько различных функций: является сериновой про-теазой (амино-терминальная часть), отщепляя от полипротеина все остальные неструктурные белки (NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A и NS5A/NS5B); обладает хели-казной и нуклеотидтрифосфатазной активностью [19, 20]. При репликации вируса NS3 белок связывается с поли-U последовательностью на З'-конце вирусного генома своим РНК-связывающим доменом и затем происходит раскручивание двунитевой РНК. Одновременно идет гидролиз дезоксирубонуклеотидтрифосфатов, осуществляемый другим доменом NS3 [20]. P. Brun et al. (2010) в своей работе показал, что NS3 протеаза может ингибировать сигнальные пути трансдукции врожденного иммунитета. Белок способен специфически взаимодействовать с каталитической субъединицей клеточной протеинкиназы А, участвующей в передаче клеточных сигналов, влияя на переход клетки в состояние неконтролируемого роста. C другой стороны, взаимодействие NS3 с иммунной системой может влиять на течение заболевания либо со спонтанным очищением от вируса, либо развитием хронической инфекции [20, 28].
В NS4 регионе выделяют две зоны - NS4A и NS4B, которые кодируют два гидрофобных белка с молекулярными массами 8 и 26 кДа [19, 20]. NS4A протеин является кофактором для NS3 протеазы, образуя с NS3 белком единый комплекс и выполняя функцию якоря, удерживающего на мембране ядра клетки репликативный комплекс ВГС [19]. Он также необходим для гиперфосфорилирования NS5A протеина. Функция NS4B протеина остается неясной, предполагается, что он также принимает участие в формировании репликативного комплекса [20].
NS5 регион полипротеина построен из двух больших белков - NS5A (56 кДа) и NS5B (65 кДа). Они освобождаются из полипротеина с помощью NS3-NS4A протеазного комплекса. NS5A белок высококонсервативен, на ядерной мембране инфицированных клеток он совместно с NS5B образует мембранно-связанный репликативный комплекс. NS5A протеин участвует в процессах фосфорилиро-вания и играет важную роль в формировании механизмов устойчивости клеток к действию интерферона. Предположительно белок NS5A ингибирует один или несколько клеточных белков (например, взаимодействует с интерферон-индуцированной клеточной протеинкина-зой), участвующих в начальных стадиях противовирусного действия интерферона [12, 19]. NS5B протеин консервативен и является РНК-зависимой РНК-полимеразой с молекулярной массой 68 кДа, обеспечивая репликацию/ транскрипцию генома вируса [20].
Изучение функциональной роли вирусных белков, кодированных неструктурной зоной РНК ВГС, прежде
всего, важно для поиска новых лечебных препаратов, которые могли бы эффективно блокировать репликатив-ную активность вируса.
3. МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ
Информация о размножении ВГС до сих пор остается неполной. Вирус обладает первичной гепатотропностью. Кроме того, вирус может размножаться в мононуклеарах периферической крови, что приводит к нарушению их иммунологической функции. Имеются данные, что пролиферация инфицированных лимфоцитов может инициировать репликацию ВГС, находящегося в этих клетках в латентной стадии.
До сих пор не решен вопрос об основном механизме повреждения гепатоцитов. Установлено, что белки ВГС могут индуцировать апоптоз. С другой стороны, повреждение гепатоцитов обусловлено специфическим или неспецифическим иммунным ответом организма. В пользу чего свидетельствуют следующие факты: для ГС характерно наличие в печени лимфоидных инфильтратов; имеются наблюдения, что цитокины, продуцируемые CD4+ и CD8+ клетками, играют значительную роль в воспалении гепатоцитов; наличие перекрестной аутоиммунной реакции в виду сходства протеинов ВГС и белков печеночных клеток. Не исключено, что оба процесса могут идти одновременно или с преобладанием одного либо другого на разных стадиях инфекции [4, 12, 19, 20].
В размножении ВГС выделяют следующие этапы (рис. 3):
• Адсорбция вируса на клеточной мембране [19]. При
этом на роль клеточных рецепторов, принимающих участие в проникновении ВГС в клетку, претендует несколько структур. Известно, что вирус проникает в клетки в составе частиц, образуемых липопротеинами низкой плотности. Липопротеины взаимодействуют с соответствующими рецепторами, локализованными в окаймленных ямках на поверхности клеток и затем поглощаются внутрь [12]. На В-лимфоцитах рецептором ВГС служит молекула ТАРА-1 (CD81 антиген) [29]. Вероятно, эти рецепторы взаимодействуют с вирусным гликопротеином, кодированным в основном Е2-зоной РНК. В ряде исследований показана высокая степень сродства рецептора адгезии дендроци-тов (DC-SING) с белком Е2 ВГС, что способствует проникновению вируса в сами дендритные клетки и препятствует связыванию дендроцитов с Т-лимфоцитами в процессе антиген-презентации [23].
• Высвобождение в цитоплазму вирусной РНК.
• Трансляция РНК, процессинг вирусного полипротеина и формирование репликативного комплекса, связанного с внутриклеточной мембраной.
• Использование попавших в клетку плюс-цепей РНК ВГС для синтеза промежуточных минус-цепей РНК ВГС [12, 19].
• Синтез новых плюс-цепей РНК ВГС и вирусных белков для сборки частиц вируса. Внутри клетки соге-белок локализован на мембране эндоплазматического ретикулюма, где происходит его мультимеризация и формирование комплекса с РНК. При сборке вириона Е1 взаимодействует своим С-концом с соге-белком, а Е2 - с №2-протеином.
РИС. 3.
Схема морфогенеза вируса гепатита С (Suzuki T. et aL, 2007).
При этом Е1 и Е2 образуют комплексы, сшитые дисульфид-ными связями, достраивая вирусную частицу.
• Выход вириона из инфицированной клетки [19, 20].
4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
Именно на знании структуры вирусной частицы, в частности молекулярного строения геномной РНК, основана методология лабораторной диагностики заболевания. В свою очередь, применение молекулярно-генетических методов диагностики для качественного выявления РНК, определения вирусной нагрузки и генотипирования ВГС согласно международным «консенсус-конференциям» в 2002 (США), 2004 (Канада) и 2010 гг. (Австрия) принято основой для оптимизации алгоритмов лечения ХГС [24, 30, 31, 32].
Определение вирусной РНК
Современные молекулярно-генетические методы, направленные на качественное обнаружение РНК ВГС, совместно с результатами серологического тестирования, используются для установления факта инфицирования и уточнения фазы заболевания. Так, в условиях постоянно повышающихся концентраций антигена в результате репродукции вируса происходит активное снижение концентрации специфических антител за счет их включения в состав иммунных комплексов. Как следствие этого, наблюдается длительное «серологическое окно» от момента заражения до сероконверсии - от 3 до 6 месяцев. Обнаружение РНК позволяет сократить фазу «окна» в полтора раза, снижая соответственно риск передачи вируса [5,19, 33]. У больных ХГС наличие репликативной активности вируса свидетельствует о фазе реактивации латентно протекающего процесса [19]. В связи с чем целесообразно и необходимо проводить ПЦР-обследование пациентов с клиническими признаками гепатита с целью ранней постановки диагноза ГС и своевременного проведения противовирусной терапии [3]. Определение РНК у новорожденных является необходимым элементом лабораторной диагностики для подтверждения факта заражения ГС вследствие трансплацентарной или интернаталь-ной передачи вируса. Так, наличие генома ВГС у детей через два месяца после рождения говорит в пользу перинатального заражения [34]. Следует отметить, что отрицательный результат выявления РНК на 4-й и 12-й неделе лечения является критерием раннего вирусологического ответа на терапию [30].
Количественный анализ и генотипирование вирусного генома служат прогностическим и мониторинговым инструментом, а также используются для определения тактики и контроля результатов лечения, в частности, отслеживания резистентных штаммов вирусов. В настоящее время данные о связи вирусной нагрузки и тяжести
заболевания весьма противоречивы. Ряд исследователей считают, что репликация вируса возрастает по мере про-грессирования болезни. Так, отмечена прямая корреляционная связь между высокой вирусной нагрузкой и степенью фиброза печени. В противоположность этому в других исследованиях показано отсутствие прямой связи между количеством РНК в организме (как в печени, так и в периферической крови) и степенью активности патологического процесса [30, 35, 36]. В то же время, количество РНК ВГС является значимым для проведения интерферо-нотерапии. Известно, что высокая вирусная нагрузка до начала терапии является плохим прогностическим фактором, такие пациенты требуют более длительного лечения [30, 37]. А также она увеличивает вероятность перинатальной передачи вируса [2].
Определение генотипов вируса
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей РНК изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира и даже в процессе заболевания от одного и того же пациента, выявил самую высокую генетическую гетерогенность генома этого вируса среди других возбудителей вирусных гепатитов, которая оказывает значительное влияние на течение инфекционного процесса. Положение о значительной генетической вариабельности РНК ВГС легло в основу теорий, объясняющих длительную персистенцию вируса и уход от иммунного ответа, частую хронизацию заболевания, трудности в терапии и создании эффективных вакцинных препаратов [5, 19, 20]. Различные генотипы вируса неодинаково влияют на особенности течения болезни, эффективность противовирусной терапии и, возможно, на исход заболевания [5, 6, 38, 39].
Генотипическая классификация вируса гепатита С
В основе генотипической классификации ВГС положено изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей регионов Соге, Е2 и №5 изолятов вируса, полученных в разных регионах мира [24]. Согласно современной классификации Р. Simmonds et а1 (1998), выделяют 6 генотипов вируса (изоляты с высоким уровнем генетических различий), обозначаемых арабскими цифрами: 1-6. Различия связаны с высокой скоростью мутаций вирусного генома и могут достигать 31-35% [20, 30]. Внутри каждого генотипа выделяют субтипы - близкородственные изоляты в пределах одного генотипа, различия нуклео-тидной последовательности между которыми составляют 15-20% (таблица). Субтипы включают в себя изоляты, состоящие из квазивидов - совокупности генетически близких вариантов вируса, структурно и антигенно отличающихся между собой, в пределах одного индивидуума. Генетическая вариабельность квазивидов достигает 1-10% [5, 19, 30].
ТАБЛИЦА.
Номенклатура обозначения генотипов и субтипов вируса гепатита С (Миронов и др., 2007)
Генотипы Субтипы Субтипы, выявленные на территории РФ
1 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 1a, 1b
2 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r 2a, 2c, 2k
3 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l 3a
4 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t 4a (единичные случаи)
5 a -
6 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u -
Совокупные данные о географическом распространении вариантов ВГС, представленные в международной базе данных нуклеотидных последовательностей генома вируса Национальной лаборатории Лос-Аламоса (Los Alamos National Laboratory), отражают крайне неравномерное распределение генотипов вируса по территории земного шара (рис. 4).
Некоторые генотипы встречаются по всему миру, другие циркулируют в определенных географических зонах. Так, основные генотипы - 1, 2 и 3 (особенно их субтипы: 1а -«американский», 1b - «японский», 2а, 2b, 3а) - наиболее широко распространены в мире, преимущественно в Америке, Западной Европе, на Дальнем Востоке, в Японии. Более локальное распространение имеют генотипы: 4 (доминирует в Центральной и Северной Африке, Заире, на Среднем Востоке), 5 (исключительно в Южной Африке) и 6 (широко представлен в странах Юго-Восточной Азии) [5, 24]. Установлено, что разделение ВГС на генотипы могло произойти от 500 до 2000 лет тому назад, разделение генотипа 1 на субтипы 1а и lb - более 300 лет назад, а глобальное распространение генотипа lb по регионам мира произошло 76 лет тому назад. Регионами мира, откуда происходила первоначальная миграция основных
генотипов ВГС, были страны Африки и Юго-Восточной Азии [5, 12, 19].
Согласно информации, указанной в базе данных, на территории РФ выявлены 1, 2, 3 и 4 генотипы ВГС, последний из указанных выявляется крайне редко (единичные случаи, считаются завозными из стран Северной Африки) [6, 40]. По данным ФБУН ЦНИИЭ доминирующими в большинстве регионов России являются субтипы 1Ь и 3а ВГС, на долю которых приходится более 85% от всех регистрируемых генотипов. Значительно реже выявляются субтипы 2 генотипа, 1а и различные варианты микст-генотипов: 8,2%, 3,6% и 1,7% соответственно. Так, генотип 1а довольно широко распространен на территории РФ (в Центральном, Северо-Западном регионах (до 11,2%), значительно реже в Восточной Сибири, в ЦентральноЧерноземном районе, на Урале), в то время, как циркуляция 2к и 2с установлена только в Санкт-Петербурге и Москве. 4 генотип составляет менее 0,05% всех генотипи-рованных проб. Наряду с этим, отмечена циркуляция изо-лятов ВГС, которые не удается генотипировать [19, 40].
Основы генетической изменчивости вирусного генома
Высокая изменчивость РНК ВГС определяется, с одной стороны, появлением точечных мутаций, вставок и деле-ций, возникающих при репликации вируса, а с другой стороны, рекомбинациями между изолятами.
Генетическая вариабильность ВГС распределена по всей длине генома неравномерно, так, например, участки №3 и №5В являются высоко консервативными. Наиболее значительные отличия последовательностей РНК сосредоточены в ^концевой части региона Е2, между 384 и 414 аминокислотных остатков. Для обозначения этой области был предложен термин «гипервариабельный регион» (HVR). Изменения, происходящие в HVR и, соответственно, в антигенных детерминантах Е2, играют ключевую
роль в ускользании вируса от первичного иммунного ответа, мешая созданию эффективных вакцин против ВГС. Гипервариабельный регион 1 (HVR1), протяженностью в 80 нуклеотидов, выявлен во всех изолятах вируса. J. Bukh et al. (2000) удалось получить клоны ВГС, где белок Е2 лишен HVR1. При многократном заражении шимпанзе такими клонами вирус остается инфекционным, хотя течение ГС несколько меняется, что выражается в низком уровне РНК в начале болезни. Авторы считают, что это свидетельствует о возможном аттенуировании вируса [19, 20, 27, 41]. Второй гипервариабельный регион (HVR2), протяженностью всего в 7-10 а.о., идентифицирован в изолятах вируса, относящихся к генотипу lb, который связывают с более плохим ответом на терапию препаратами интерферона. При секвенировании HVR1, выделенного у пациентов, получающих лечение препаратами, обладающими иммуностимулирующим действием, была обнаружена увеличенная частота мутаций в этом регионе. Экспериментально полученные антитела против пептидов, кодированных зоной HVR1, были способны блокировать взаимодействие ВГС с клеткой, т.е. обладали вирус-нейтрализующими свойствами [8, 19, 27].
Секвенирование участка в зоне NS5 РНК в изолятах вируса (генотипа lb), выделенного у пациентов с низким уровнем ответа на проводимую терапию препаратами интерферона, позволило определить участок РНК, в котором наиболее часто регистрировались мутации. Этот участок генома получил обозначение ISDR [5, 12]. В работе I. Okura et al. (2004) и Е. Herrmann et al. (2004) показано, что генотип-специфические мутации в NS5, особенно в участке NS5A, определяющем устойчивость к интерферону, снижают репликативную активность вируса у пациентов с генотипом 1а/Ь, усиливая ответ на интерферонотерапию [42, 43]. C другой стороны, V. Balan et al. (2010) установил возможность развития лекарственной устойчивости при комбинированной терапии, которая обусловлена появлением мутации V851 (замена валина на изолейцин) в регионе NS5B ВГС [44].
Что касается рекомбинаций, возникающих между изо-лятами ВГС, то первое описание таких форм выполнено О. Kalinina et al. (2002). Ими были изучены образцы ВГС на соответствие результатов генотипирования по различным областям генома вируса. Филогенетический анализ 5'NTR-core и NS5B областей показал, что два из изученных изолятов принадлежали к разным подтипам ВГС 2k и 1b по соответствующим регионам вируса. Таким образом, была выявлена рекомбинация 2k/1b. Секвенирование региона E2-p7-NS2 позволило найти точку перекреста рекомби-нантных участков данных изолятов ВГС, которая располагалась в пределах NS3 в позициях 3175 и 3176 [8]. В дальнейшем были обнаружены и описаны еще несколько слу-
чаев подобной рекомбинации между разными генотипами ВГС. Выявленные рекомбинанты - результат естественной эволюции ВГС. Они не только являются жизнеспособными, но и могут оказывать влияние на проведение интерферонотерапии, в связи с чем адекватная оценка возможности формирования устойчивого вирусологического ответа должна основываться на генотипи-ровании ни одной, а сразу нескольких областей генома ВГС [7, 9, 45].
Значение определения генотипического разнообразия изолятов
Сведения о взаимосвязи воспалительного процесса в печени с конкретным генотипом вируса весьма противоречивы. Большинство исследователей считают, что корреляция между вариантом генотипа и морфологическими изменениями в печени отсутствует. Другие авторы, наоборот, указывают на то, что у больных, инфицированных 1 генотипом вируса, более активно протекает воспалительный процесс в печени и чаще развивается гепатокар-цинома, но влияние генотипа оказывается все равно значительно меньше, чем у других факторов риска (например, употребление алкоголя и возраст пациентов) [46]. При этом доказано, что гено/субтипирование ВГС и вирусная нагрузка являются важным фактором, определяющим эффективность противовирусного лечения, а следовательно, и его тактику [30]. По данным Национального института здоровья США пациенты, инфицированные ВГС 1го генотипа, значительно хуже отвечают на противовирусное лечение препаратами интерферонов, чем больные со 2-ым и 3-им генотипами [31]. Рядом отечественных и зарубежных авторов предполагается, что подобные различия в эффективности терапии могут быть следствием более медленного процесса разрушения гепатоцитов при инфицировании генотипом 1. Показан неодинаковый уровень вирусологического ответа на лечение и в зависимости от субтипа 1 генотипа ВГС. Так, считается, что больные с субтипом 1а хуже отвечают на комбинированное противовирусное лечение, чем пациенты с 1b [30, 47, 48]. Что касается других генотипов ВГС, то 4 плохо отвечает на интерферонотерапию, 5 большинство исследователей относят к относительно «благоприятным», а 6 занимает промежуточное положение по уровню устойчивого ответа на лечение [30, 40, 49]. В настоящее время для пациентов, не ответивших на пегелированный интерферон в комбинации с рибаварином, перспективным считается использование прямых противовирусных препаратов, препятствующих основным этапам репликации вируса. Современная классификация включает:
• Специфические ингибиторы сериновой протеазы NS3/4A (BILN2061, BI 201335, AVL-192, ACH-1625, MK-5172, телапревир, босепревир). Например, в работах D. Lamarre
с соавт. (2003) и S. Lemon с соавт. (2005) отмечено снижение вирусной нагрузки в сыворотке крови уже через два дня терапии BILN2061 среди больных, инфицированных генотипом 1 ВГС. Эффективность ингибитора значительно снижается у пациентов с генотипами 2 и 3, которые имеют меньшую степень сродства к BILN2061 [50, 51].
• NS5B РНК-зависимые РНК-полимеразные ингибиторы: нуклеазидные/нуклеотидные (фармасит, филибу-вир); ненуклеазидные (АВТ-333).
• №5А ингибиторы.
Большинство препаратов находится на стадии клинических испытаний и многие исследователи отмечают возможность формирования лекарственной устойчивости, ассоциированной с применением ингибиторов протеаз [24]. Так, для группы ингибиторов NS3/4A лекарственная резистентность обусловлена такими основными мутациями, как D168V, R155K, V36M. Интересно, что D168V наиболее часто наблюдалась у пациентов с генотипом 1b, а R155K - с 1а [22, 52]. Для АВТ-333, потенциально активной в отношении генотипов 1а и 1b, с высоким риском развития устойчивости связана мутация C316Y [24].
Несмотря на то, что представленные данные требуют проведения дальнейших исследований, уже сегодня правильное применение современных молекулярных методов позволяет максимально оптимизировать имеющиеся алгоритмы противовирусного лечения и в ряде случаев добиться высоких показателей устойчивого вирусологического ответа [30]. Предполагается, что уже в 2011-2012 гг. мировым стандартом лечения больных ХГС будет тройная терапия ингибитором полимеразы, пегилированным интерфероном и рибавирином. А к 2015 г. будут зарегистрированы 4 ингибитора протеазы и 2 ингибитора поли-меразы, что позволит приблизить эффективность терапии к 100% и исключить из схем лечения интерфероны [53].
Кроме того, определение генотипов ВГС имеет не только безусловно клиническое значение, но является перспективным для решения ряда эпидемиологических задач, включая генетическую характеристику вирусов, циркулирующих на определенной территории в динамике; отслеживание изменений в структуре путей передачи и выявление закономерностей распределения ВГС в популяции с целью прогнозирования изменений эпидемиологической ситуации, предотвращения дальнейшего распространения инфекции. На все эти вопросы позволяют ответить молеку-лярно-генетические методы типирования изолятов вируса.
Так, мониторинг генотипической структуры вируса в популяции позволяет судить о тенденциях распространения инфекций и возможных источниках инфицирования. Считается, что субтип 1а ассоциирован с внутривенным потреблением наркотических средств, а для 3а данные о подобной корреляции с этим путем передачи инфекции
весьма неоднозначны; 1Ь часто связывают с заражением через медицинские манипуляции, гемотрансфузии и гемодиализ; 2-ой генотип значительно распространен среди лиц, инфицированных половым путем [8, 46]. Кроме того, доминирование и возможный дальнейший рост доли 1-го генотипа, который значительно снижает эффективность интерферонотерапии, ведет к увеличению длительно существующих источников ГС-инфекции. Так и в случае создания кандидатной вакцины, возможность ее применения и эффективность также будут определяться степенью изученности популяционной структуры ВГС, а именно, знанием превалирующих генотипов [6].
5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ
Поскольку ГС-инфекция чаще всего протекает в бессимптомной форме, своевременная диагностика ее значительно затруднена. Лабораторная диагностика ГС, в первую очередь, основывается на обнаружении в образцах сывороток или плазмы крови человека специфических антител к антигенам ВГС, относящихся к иммуноглобулинам классов G и М (анти-ВГС ^ и анти-ВГС 1дМ). При этом антитела 1дМ к оболочечным белкам (чаще к Е2) и ядерному антигену вируса начинают определяться в крови больных лишь через 2-10 недель, а иногда через несколько месяцев от начала заболевания. Что касается антигенов вируса, если они и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются и могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммун-ногистохимических методов исследования [19, 54, 55]. Это существенно ограничивает возможность обнаружения, оценки течения и активности инфекционного процесса.
В такой ситуации на первое место выходит совершенствование лабораторных методов для выявления ГС-инфекции с целью ранней диагностики заболевания и предотвращения путей дальнейшей передачи этой инфекции, а в частности - максимально полное обнаружения ее скрытопротекающего компонента. Применение рутинного иммуноферментного анализа в индикации серологических маркеров ГС является лишь косвенным методом диагностики, выявляющим опосредованную реакцию иммунной системы человека на внедрение вируса [56]. Внедрение в лабораторную практику ПЦР предоставило возможность использовать прямой лабораторный метод для непосредственного обнаружения генома возбудителя из небольшого количества легкодоступного биологического материала, позволяя определять РНК ВГС в детектируемых количествах через 1-3 недели после инфицирования [3, 56].
Качественное и количественное определение РНК
Сравнение первичной структуры 5'-NTR-области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость. Это сделало предпочтительным
использование праймеров из данной зоны РНК в диагностических тест-системах [12, 19]. Первый стандартизированный набор для определения РНК ВГС («Amplicor TM HCV», «Roche Diagnostic Systems», Швейцария) изготовлен в 1993 г., он позволял выявлять 100 и более копий/мл. Дальнейшему развитию эффективности методики способствовало введение внутреннего контроля с этапа про-боподготовки в диагностические наборы реагентов [40, 57]. В настоящее время чувствительность коммерческих тест-систем составляет 10-50 копий РНК в 1 мл крови (50-100 международных единиц (МЕ) /мл) («АмплиСенс HCV-EPh», «АмплиСенс HCV-FRT» ФГУН ЦНИИЭ МЗ РФ, г. Москва; «ОТ-ГЕПАТОГЕН-С», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва; «COBAS AmpliPrep TM», «COBAS Amplicore HCV 2.0», «Roche», Швейцария).
Современные молекулярные технологии для обнаружения генетических последовательностей очень чувствительны и могут определить низкие уровни вируса в образце крови («АмплиСенс HCV Монитор», «АмплиСенс HCV Монитор FRT» ФБУН ЦНИИЭ МЗ РФ, г. Москва; «ОТ-ГЕПАТОГЕН-С количественный», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва; «COBAS Amplicore HCV Monitor 2.0», «Amplicore HCV Monitor 2.0», «Roche», Швейцария) [33, 42]. Международным стандартом Всемирной организации здравоохранения 96/790 для количественного определения вирусного генома является образец плазмы крови в лиофилизированном виде, содержащий РНК ВГС 1-го генотипа в концентрации 105 МЕ/мл [30]. В настоящее время результаты исследования выражают в количественных единицах: количество копий РНК, содержащихся в 1 мл, в абсолютном или логарифметическом выражении (log 10). Специальные коэффициенты позволяют пересчитывать полученные показатели концентрации в международные единицы. В большинстве коммерческих тест-системах для проведения анализа используется сыворотка и/или плазма крови пациента c ГС. При этом имеются данные, что тестирование образцов сыворотки/плазмы крови не позволяет определить истинный уровень вирусной нагрузки в отличие от использования в качестве биоматериала цельной крови. Использование образцов цельной крови для определения РНК позволяет выявлять более низкий уровень виремии, что имеет особое значение для раннего прогнозирования рецидива ГС-инфекции при проведении интерферонотерапии [58].
Как известно, вирусные геномы обычно присутствуют в биологических субстратах в малых количествах и для их выявления, количественной оценки необходима стадия предварительного усиления либо сигнала (разветвленная ДНК), либо мишени (ПЦР). Наиболее широкое применение для обнаружения РНК ВГС получили различные варианты ПЦР (Кэри Мюллис, 1983).
Рассмотрим основные молекулярно-генетические методы, применяемые для определения РНК ВГС:
1. ОТ-ПЦР (Обратная транскрипция полимеразная цепная реакция) / RT-PCR ( (Reverse transcription polymerase chain reaction -) - метод ферментативной наработки количества копий специфических фрагментов комплиментарной ДНК (кДНК) с предшествующим этапом обратной транскрипции (впервые успешно применен в 1989 г. рядом исследователей). Используемая в качестве фермента ДНК-зависимая ДНК-полимераза (источник - бактерии Thermophilus termus (Tth-полимераза) или Thermophilus aquaticus (Taq-полимераза)) обладает термостабильностью в присутствии ионов марганца и магния и может быть одновременно использована для синтеза комплементарных одноцепочечных молекул кДНК ВГС и амплификации избранных участков кДНК [19, 59]. Анализ результатов реакции может быть проведен «по конечной точке», как это реализовано в гель-электрофоретической и флуоресцентной (FLASH) детекции. Что позволяет увидеть лишь статичную картинку динамичного процесса. Сейчас все более широкое распространение получает метод гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» [57, 59, 60]. Отличительными чертами последнего являются:
- исключение контаминации на этапе детекции продукта реакции, поскольку регистрация результатов идет в закрытой пробирке непосредственно в момент проведения амплификации (упрощая процедуру проведения анализа);
- повышение чувствительности методики ПЦР позволяет выявлять низкокопийные пробы, снижая долю нетипи-рованных образцов (100 МЕ/мл для «Real-Time» в сравнении с 103 МЕ/мл при гель-электрофорезе);
- высокая специфичность благодаря применению оли-гонуклеотидных зондов, строго специфичных к амплифи-цируемому фрагменту;
- визуальное отражение течения процесса дает возможность оценки исходного количества копий кДНК в образце, что позволяет выбрать более адекватный метод лечения;
- автоматизированная система регистрации данных практически полностью исключает неверную трактовку результатов [40, 59].
С целью повышения чувствительности (в несколько раз) и контроля специфичности диагностических тестов для выявления РНК ВГС ряд исследователей применяют модификацию метода, так называемую «гнездовую» ПЦР (nested PCR). Отличие от «классической» методики заключается в одновременном использовании двух пар прай-меров: внешние (прямой и обратный) для кДНК-матрицы с образованием 1-го ПЦР-продукта; внутренние праймеры
(обычно короче по отношению к олигонуклеотидам начальной стадии реакции), которые комплементарно связываются с внутренним участком ампликона первого раунда амплификации с образованием 2-го ПЦР-продукта [Б, 19]. Для детекции полученных продуктов амплификации используют электрофорез в горизонтальном геле. Применение универсальных праймеров, в отличие от типоспецифических, при постановке ПЦР-амплификации позволит их отжиг на матрице всех вариантов кДНК ВГС независимо от генотипа [Б]. Но введение второго раунда амплификации и, как следствие, манипуляции с уже амплифицированным материалом увеличивает риск кросс-контаминации (из пробирки в пробирку), что может привести к получению ложноположительных результатов.
Решается эта проблема с помощью постановки ПЦР в одной пробирке за счет разницы температур отжига наружной и внутренней пары праймеров (так называемая «Boost PCR») [12, 19, 61].
2. Лигазная цепная реакция выявления РНК ВГС (Ligase chain reaction - LCR) (1989 г.). Метод амплификации, основанный на способности фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) разрывы фосфодиэ-фирной связи в ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg2+. Для этого синтезируются два олигонуклеотида/праймера, комплементарные непрерывной последовательности кДНК ВГС: один - к Б'-концу, другой - к З'-концу. После связывания с кДНК праймеры остаются разделены лишь одноцепочечным разрывом и термостабильная лигаза соединяет их в полинуклеотид. Лигирование не происходит при отсутствии целевой последовательности. Кроме того, специфичность реакции обеспечивается тем, что неполное спаривание праймеров с матрицей в пограничной области предотвращает их лигирование. При последующей амплификации полинуклеотид и исходная кДНК служат матрицами для повторных циклов гибридизации, лигирования и диссоциации. Поскольку один праймер метится гаптеном или лигандом, а другой - с репортерной группой, появляется возможность детектировать полученные продукты непосредственно после амплификации, без использования электрофореза или секвенирования ДНК [19, 62]. Чувствительность метода составляет около 100 копий РНК ВГС в 1 мл («Abbott Real Time HCV», «ABBOTT», США) [Д0].
3. Метод транскрипционно апосредованной амплификации (Transcription-mediated amplification - ТМА) отличается от RT-PCR и LCR тем, что непосредственно амплифи-цируются фрагменты РНК ВГС, а не кДНК («Versant HCV RNA Qualitative Assay (TMA)», «Bayer Diagnostic», США). На начальном этапе реакции на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезируется кДНК. Обратная
транскриптаза, обладая также активностью РНКазы Н, разрушает вирусную РНК в гибриде РНК-кДНК. Затем молекула кДНК достраивается до двуцепочечной. С помощью РНК-полимеразы происходит транскрипция РНК с кДНК, что приводит к образованию от 100 до 1000 копий ампликона РНК ВГС в одном цикле реакции. Образовавшиеся РНК-ампликоны специфически взаимодействуют с ДНК-зондами, меченными хемилюминафо-рами, учет результатов реакции осуществляют на люмено-метре.
К преимуществам ТМА-метода относятся:
- возможность проведения реакции при более низких температурах (в сравнении с ПЦР);
- образование большего числа ампликонов в одном цикле реакции, что уменьшает время для получения конечного результата (30-40 мин.) и повышает чувствительность реакции (50 копий/мл);
- снижение риска контаминации, так как РНК менее устойчива, чем ДНК.
В ряде сравнительных исследований по детекции РНК ВГС при помощи ТМА и других методов продемонстрировали высокий уровень совпадения результатов [19, 62]. В то же время, по данным С. Sarrazin (2002) применение ТМА позволило обнаружить РНК ВГС в 36% образцов, для которых был получен отрицательный результат с использованием RT-PCR. Впоследствии такие «ТМА-позитивные» пациенты рассматривались как лица, не ответившие на комбинированную терапию, с низким уровнем вирусной нагрузки [63].
4. Сочетание принципов гибридизации и амплификации лежит в основе метода гибридизации с использованием разветвленных зондов (Branched DNA assay- bDNA) («Versant HCV RNA 3.0 (bDNA)», «Bayer Diagnostic», США). В отличие от ПЦР, в данном тесте осуществляется амплификация не молекул кДНК ВГС, а сигнала. Реакция проводится в 96 луночных планшетах, на которых адсорбируются олигонуклеотиды/ фрагменты РНК ВГС из 5'-NTR зоны и соге-региона, куда добавляется сывороточная РНК. За счет последующего связывания с синтетической молекулой разветвленной ДНК и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфатазой с усилителем, и последующей ферментативной реакцией достигается резкое увеличение полученного сигнала (хеми-, флуоролюми-несценции). Чувствительность метода низкая - 2500 копий РНК ВГС в 1 мл [19, 62].
Отдельно рассмотрим метод гибридизации (образования двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов). Метод основан на соединении меченых гибридизационных зондов (генноин-женерные или синтетические молекулярные структуры, содержащие в себе нуклеотидные последовательности,
комплементарные избранным участкам РНК) с искомой последовательностью РНК, зафиксированной на нитро-целлюлозной мембране. Учет результатов осуществляют по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе образовавшегося комплекса [19, 62]. Некоторые исследователи считают, что одностадийная ПЦР с последующей гибридизацией с олигонуклеотидными зондами (меченными радио или флуоресцентной меткой) по чувствительности не уступает двустадийной ПЦР с внутренней парой праймеров и предпочтительна при клинической диагностике инфекций, т. к. способствует снижению риска контаминации [62].
Для ГС этот метод прежде всего нашел свое применение для идентификации РНК непосредственно в гепатоцитах -в тестах in situ hybridization. Кроме того, гибридизация позволяет продемонстрировать наличие негативных (репликативных) цепей РНК ВГС. Доказано, что плюс-цепь не может служить критерием активной репликации при отсутствии минус-цепи - вирус находится в нереплика-тивной стадии. При сопоставлении наличия плюс- и минус-цепей РНК ВГС в тканях печени, периферических мононуклеарах и сыворотке крови было установлено, что минус-цепь выявляется только в присутствии плюс-цепи, обратная зависимость отсутствует [35, 62].
Генотипирование изолятов вируса гепатита С
В настоящее время для гено/субтипирования РНК ВГС разработаны несколько методов, основанных на использовании ПЦР:
1. Наиболее широкое распространение получила ПЦР с тип-специфическими (генотип- и субтип-специфически-ми) праймерами с использованием гель-электрофоретической, «FLASH» и «Real-Time» детекции («АмплиСенс HCV-генотип», «АмплиСенс HCV-генотип FEP» «АмплиСенс HCV-генотип FRT», «АмплиСенс HCV 1/2/3 FL» ФГУН ЦНИИЭ МЗ РФ, г. Москва; «ГЕНОТИП-С», ЗАО «НПФ ДНК-Технология», г. Москва). Для амплификации выбирается наиболее вариабельный участок генома вируса, при этом выбранные праймеры отжигаются на разных участках выбранного региона в зависимости от генотипа.
2. Гибридизация ПЦР-продуктов с тип-специфическими олигонуклеотидами/ зондами («Versant HCV Genotyping Assay», «Bayer Diagnostic», США)
3. Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР-продуктов (PCR-RFLP) (Thiers V. et al., 1997). Метод основан на рестрикции амплифицированного фрагмента (чаще полученного с использованием гнездовой ПЦР) из 5'-NTR-области генома ВГС с помощью трех мелкощепя-щих эндонуклеаз/рестриктаз - BstNl, BstUl и Sau3a, которые распознают уникальные комбинации нуклеотидов. Рестрицированные ПЦР-продукты разделяют в 3%-ом
высокоразрешающем агарозном геле, который позволяет идентифицировать весьма короткие фрагменты: до 50-250 пар нуклеотидов. Использование маркера молекулярных масс и сравнительный анализ полученных элек-трофореграмм амплифицированных фрагментов, обработанных рестриктазами, позволяет сделать заключение о гено/субтипах ВГС [5, 11]. Сравнение результатов геноти-пирования методом ПЦР-RFLP с данными секвенирования продемонстрировало высокий уровень совпадения результатов - 95% [62].
4. Определение нуклеотидных последовательностей участков генома методом секвенирования ПЦР-продуктов (от англ. sequence — последовательность) («TRUGENE HCV 5 NC Genotyping Kit», Bayer Diagnostic, США). Перед постановкой реакции ПЦР-продукты очищают, для чего можно использовать различные коммерческие наборы реагентов очистки фрагментов ПЦР («GFX PCR DNA and Gel Band purification kit», Amersham Pharmacia Biotech; «Axy Prep PCR Cleanup Kit Nucleic Acid purification kit», ФБУН ЦНИИЭ МЗ РФ, г. Москва) [5]. Принцип метода заключается в ферментативном синтезе олиго(поли) дезоксирибонуклеотидов с помощью ДНК-полимераз на основе матричного полинуклеотида. Можно секвениро-вать весь геном вируса (в несколько раундов с перекрыванием концов регионов и последующим их склеиванием), но чаще метод используется для отдельных участков, представляющих интерес. Синтез начинается (олигону-клеотид-затравка остается постоянным 5'-концевым фрагментом) и останавливается на одном из четырех мономерных звеньев (A, G, C, T), повторяясь 4 раза. Реакцию секвенирования проводят, используя один из праймеров, работавших в ПЦР. В более современном варианте дезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. В случае «минус-системы» присутствуют только три нуклеотида. Определение длины каждой копии фракционированием в полиакриламидном геле позволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого полинуклеотида (луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель). Гель-электрофорез и чтение гелей проводят на автоматическом секвенаторе (ABI PRISM 377 или 310, Applied Biosystems). Сиквенсы ДНК читают, собирают и обрабатывают с помощью пакетов специализированных программ (LASERGENE, DNA STAR Inc., Madison, WI) с дальнейшим построением фило-грамм. Так, множественное выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей с данными по изучаемой области из GenBank может выполняться с помощью программы Clustal X [5, 11].
Секвенируемый участок генома должен быть достаточно вариабельным, чтобы обеспечить возможность диф-ференцировки различных изолятов одного и того же варианта гено/субтипа, а также достаточно большое количество доступных нуклеотидных последовательностей изучаемой области (сиквенсы всех субтипов) в международной библиотеке данных EMBL (GenBank) [5]. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВГС с использованием данных GenBank позволило заключить, что оптимальным для подбора праймеров и зондов, специфичных к циркулирующим на территории РФ генотипам 1, 2 и 3, является 5'-NTR-rare и NS5B-область генома вируса (длиной около 670 пар олигонуклеотидов) [40]. Сравнение первичной структуры 5'-NTR области генома различных изолятов ВГС выявило их незначительную изменчивость (между генотипами гомология нуклеотидов составляет 92-98%, а внутри генотипа - 98-99%). Кроме того, первые 30 нуклеотидов core-региона являются высоко консервативными для всех генотипов ВГС (этот сегмент содержит IRES) [19, 21]. Установление принадлежности выделенного штамма к определенному кластеру может помочь в выявлении завозных случаев ВГС, когда обнаруживается нехарактерный для данного региона изолят.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шляхтенко Л. И., Мукомолов С. Л., Сулягина Л. Г. и др. Пути совершенствования эпидемиологической диагностики вирусных гепатитов В и С. Мир вирусных гепатитов. 2006. № 1. С. 2-10.
Shljahtenko L. I., MukomolovS. L., Suljagina L. G. idr. Putisovershenstvovanija jepidemiologicheskoj diagnostiki virusnyh gepatitov В i C. Mir virusnyh gepatitov. 2006. № 1. S. 2-10.
2. Ершова О. В. Современные проявления эпидемического процесса гепатита С, активность естественных путей передачи и совершенствование профилактики этой инфекции: автореф. дисс....докт. мед. наук. М., 2006. 22 с.
Ershova O. V. Sovremennyeprojavlenija jepidemicheskogo processa gepatita C, aktivnost' estestvennyh putej peredachi i sovershenstvovanie profilaktiki jetojinfekcii:avtoref. dis....dokr. med. nauk. M., 2006. 22s.
3. Мазепа В.Н. Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобакторной, негонококковых урогенетальных инфекций и вирусных гепатитов: автореф. дисс. ... док. биол. наук. М., 2010. 65 с.
Mazepa V.N. Optimizacija i kompleksnoe ispol'zovanie polimeraznoj cepnoj reakcii v diagnostike aktual'nyh zabolevanij na modeli ostryh kishechnyh, helikobaktornoj, negonokokkovyh urogenetal'nyh infekcij i virusnyh gepatitov: avtoref. dis.... dok. biol. nauk. M, 2010. 65s.
4. Мамедов М. К., Михайлов М. И. К истории открытия и изучения вируса гепатита С . Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 5-8.
Mamedov M. K., Mihajlov M. I. K istorii otkrytija i izuchenija virusa gepatita C. Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 5-8.
5. Мукомолов С. Л., Калинина О. В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов. 2003. № 12. С. 5-13.
Mukomolov S. L., Kalinina O. V. Molekuljarnaja jepidemiologija virusnyh gepatitov. Mir virusnyh gepatitov. 2003. № 12. S. 5-13.
6. Шустов А. В. Генотипическое разнообразие изолятов и молекулярная вариабельность вируса гепатита С у Населения Новосибирской области: автореф. дисс....канд. биол. наук. Кольцово, 2003. 22 с.
Shustov A. V. Genotipicheskoe raznoobrazie izoljatov i molekuljamaja variabel'nost' virusa gepatita C u Naselenija Novosibirskoj oblasti: avtoref. dis....kand. biol. nauk. Kol'covo, 2003. 22s.
7. Colina R., Casane D., Vasquez S. et al. Evidence of intratypic recombination in natural populations ofhepatitisC virus. Gen. Virol. 2004. Vol. 85(1). P. 31-37.
8. Kalinina O., Norder H., Mukomolov S. et al. A natural intergenotypes recombinant of hepatitis C virus identified in St. Peterburg. Virol. 2002. Vol. 76(8). P. 4934-4043.
9. Kurbanov F., Tanaka Y., Chub E. et al. Molecular epidemiology and interferon susceptibility of the natural recombinant of hepatitis C virus strain RF1_2k/1b. Infect. Dis. 2008. Vol. 198. P. 1448-1456.
10. Los Alamos National Laboratory (http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/ HTML).
11. Podzorski R. P. Molecular testing in the diagnosis and management of hepatitis C virus infection. Arch Pathol Lab Med. 2002. Vol. 126(3). P. 285-290.
12. Suzuki T., Aizaki H., Murakami K. et al. Molecular biology of hepatitis C virus. Gastroenterol. 2007. Vol. 42. P. 411-423.
13. Быстрова Т. Н., Ефимов Е. И., Арзяева А. Н. Парентеральные вирусные гепатиты: этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика / Учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов. Н.Новгород: НГМА, 2010. 180 с.
Bystrova T. N., Efimov E. I., Arzjaeva A N. Parenteral'nye virusnye gepatity: jetiologija, jepidemiologija, diagnostika, profilaktika / Uchebnoe posobie dlja studentovmedicinskih VUZov. N.Novgorod: NGMA, 2010. 180 s.
14. Иванова Т. Г., Яковчук Е. М., Высоцкий В. С. и др. Проблемы вирусных гепатитов в современный период // Сборник трудов Всерос. НПК «Современные проблемы эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций». СПб. 2009. С. 215.
Ivanova T. G., Jakovchuk E. M., Vysockij V. S. i dr. Problemy virusnyh gepatitov v sovremennyj period // Sbornik trudov Vseros. NPK «Sovremennye problemy jepidemiologii. Perspektivnye sredstva i metody laboratornoj diagnostiki i profilaktiki aktual'nyh infekcij». SPb. 2009. S. 215.
15. Чахарьян В. В. Особенности эпидемиологии и оценка путей передачи возбудителей вирусных гепатитов В и С в современный период: автореф. дисс.... канд. мед. наук. М., 2009. 22 с.
Chaharjan V. V. Osobennosti jepidemiologii i ocenka putej peredachi vozbuditelej virusnyh gepatitov В i C v sovremennyj period: avtoref. diss... kand.med. nauk. M., 2009. 22 s.
16. Ильченко Л.Ю., Осканова Р.С., Сторожаков Г.И. Вирус гепатита С и особенности течения ВГС-инфекции у онкогематологических больных. Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 9-14.
Il'chenko LJu., Oskanova R.S., Storozhakov G.I. Virus gepatita C i osobennosti techenija VGC-infekcii u onkogematologicheskih bol'nyh. Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 9-14.
17. Гепатит С (Диагностика, эпидемиология, лечение, профилактика) (Российский консенсус), Москва, 26-27 сентября 2000 г. Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2000. № 3(10). С. 3-92.
Gepatit C (Diagnostika, jepidemiologija, lechenie, profilaktika) (Rossijskij konsensus), Moskva, 26-27 sentjabrja 2000 g. Virusnye gepatity: Dostizhenija i perspektivy. 2000. № 3(10). S. 3-92.
18. Ющук Н. Д., Ивашкин В. Т., Жданов К. В. и др. Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С. М. 2013. 64 с.
Jushhuk N. D., Ivashkin V. T., Zhdanov K. V. i dr. Rekomendacii po diagnostike i lecheniju vzroslyh bol'nyh gepatitom S. M. 2013. 64 s.
19. Шахгильдян И. В., Михайлов М. И., Онищенко Г. Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. 384 с.
Shahgil'djan I. V., Mihajlov M. I., Onishhenko G. G. Parenteral'nye virusnye gepatity (jepidemiologija, diagnostika, profilaktika). M.: GOU VUNMC MZ RF,
2003. 384 s.
20. Новикова Н. А., Новиков В. В., Добротина Н. А. и др. Вирусология. Н.Новгород: ННГУ, 2002. С. 182-204.
Novikova N. A., Novikov V. V., Dobrotina N. A. i dr. Virusologija. N.Novgorod: NNGU, 2002. S. 182-204.
21. Thelu M., Drouet E., Hilleret M. et al. Lack of clinical significance of variability in the internal ribosome entry site of hepatitis C virus. Med. Virol.
2004. Vol. 72(3). P. 396-405.
22. Kunkel M., Watowich SJ. Biophysical characterization of hepatitis C virus core protein: implications for interactions within the virus and host //FEBS Lett. 2004. Vol. 557(1-3). P. 174-180.
23. Wang Q., Feng Z, Nie Q. et al. DC-SING:bilding receptors for hepatitis C virus. Clin. Med. 2004. Vol. 117(9). P. 1395-1400.
24. Кожанова Т. В. Лекарственная устойчивость вируса гепатита С (по материалам 45-го Международного конгресса ЕАSL, 14-18 апреля 2010 г.). Мир вирусных гепатитов. 2010. № 2. С. 32-35.
Kozhanova T. V. Lekarstvennaja ustojchivost' virusa gepatita C (po materialam 45-go Mezhdunarodnogo kongressa EASL, 14-18 aprelja 2010 g.) Mir virusnyh gepatitov. 2010. № 2. S. 32-35.
25. Kamegaya Y., Hiasa Y., Zukerberg L. et al. Hepatitis C virus acts as a tumor accelerator by blocking apoptosis in a mouse model of hepatocarcinogenesis. Hepatology. 2005. vol. 41(3). Р. 660-667.
26. Dubuisson J. Hepaitis C virus proteins. Gastroenterol. 2007. Vol. 5. P. 2406-2415.
27. Moradpour D., Penin F., Rice C. Replication of hepatitis C virus. Microbiol.
2007. Vol. 5. P. 453-463.
28. Brun P., Boninsegna S., Palu G. Innate immune system responses differ during recent and chronic hepatitis C virus infection. Hepatology. 2010. Vol. 52 (1). P. 671.
29. Lavillette D., Tarr A., Voisset C. et al. Characterization of host-range and cell entry properties of the major genotypes and subtypes of hepatitis C virus. Hepatology. 2005. Vol. 41(2). P. 265-274.
30. Чуланов В. П., Шипулин Г. А. Роль молекулярных методов диагностики в оптимизации алгоритмов лечения вирусного гепатита С. Лабораторная медицина. 2006. № 8. С. 1-10.
Chulanov V. P., Shipulin G. A. Rol' molekuljarnyh metodov diagnostiki v optimizacii algoritmov lechenija virusnogo gepatita C. Laboratornaja medicina. 2006. № 8. S. 1-10.
31. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of hepatitis C: 2002 June 10-12. Hepatology. 2002. Vol. 1. Р. 3-20.
32. Sherman M., Bain V., Villeneuve J. et al. Management of chronic viral hepatitis: a Canadian consensus conference 2004. Gastroenterol. 2004. Vol. 18. P. 715-728.
33. Гараев М. М., Богдан С. А., и др. «СМАРТ-тюб™ HIV&HCV» -новая вспомогательная технология для выявления антител к ВИЧ и ВГС в стадии «серологического окна» / Методические рекомендации. М.
2008. 12 с.
Garaev M. M., Bogdan S. A., i dr. «SMART-tjub™ HIV&HCV» - novaja vspomogatel'naja tehnologija dlja vyjavlenija antitel k VICh i VGC v stadii «serologicheskogo okna» / Metodicheskie rekomendacii. M. 2008. 12 s.
34. Сенягина Н. Е. Клинические особенности, критерии диагностики и профилактика вирусного гепатита С у детей при вертикальной передаче инфекции: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Н.Новгород, 2011. 26 с.
Senjagina N. E. Klinicheskie osobennosti, kriterii diagnostiki i profilaktika virusnogo gepatita C u detejpri vertikal'nojperedache infekcii:avtoref. diss.... kand. med. nauk. N. Novgorod, 2011. 26 s.
35. Лакина Е. И., Масалова О. В., Абдулмеджидова А. А., Кущ А. А. Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом С: есть ли связь? Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2001. № 3 (13). С. 16-32.
Lakina E. I., Masalova O. V., Abdulmedzhidova A. A., Kushh A. A. Virusnaja nagruzka i tjazhest' zabolevanija gepatitom C: est' li svjaz? Virusnye gepatity: dostizhenija iperspektivy. 2001. № 3 (13). S. 16-32.
36. Von Wanger M., Huber M., Berg T. et al. Peginterferon alfa-2a(40 kd) and ribavirin for 16 or 24 weeks in patients with genotype 2 or 3 chronic hepatitis C. Gastroenterol. 2005. Vol. 129. P. 522-527.
37. Краснова Л. И. Характеристика фиброза печени в зависимости от продолжительности хронического гепатита С (ХГС) и величины вирусной нагрузки // Сборник трудов II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. М. 2010. С. 158-159.
Krasnova L. I. Harakteristika fibroza pecheni vzavisimosti ot prodolzhitel'nosti hronicheskogo gepatita C (HGC) i velichiny virusnoj nagruzki//Sbornik trudov II Ezhegodnogo Vserossijskogo Kongressa po infekcionnym boleznjam. M. 2010. S. 158-159.
38. Маркин Н. В., Цема Н. И. и др. Распределение субтипов вируса гепатита С в Ростовской области // Сборник трудов V Всерос. НПК «Генодиагностика инфекционных болезней». М. 2004. Т. 1. С. 249-250.
Markin N. V., Cema N. I. i dr. Raspredelenie subtipov virusa gepatita C v Rostovskoj oblasti // Sbornik trudov V Vseros. NPK «Genodiagnostika infekcionnyh boleznej». M. 2004. T. 1. S. 249-250.
39. Цыганко Е. В., Ковалев С. Ю. Распределение генотипов вируса гепатита С в г.Екатеринбурге: динамика эпидемического процесса // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагности-ка-2007». М. 2007. Т. 1. С. 279-283.
Cyganko E. V., Kovalev S. Ju. Raspredelenie genotipov virusa gepatita C v g.Ekaterinburge: dinamika jepidemicheskogo processa // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 1. S. 279-283.
40. Орлов С. Т., Неверов А. Д., Михайловская Г. В. и др. Разработка и апробация тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип FRT» на клиническом материале и контрольных панелях QCMD // Сборник трудов 6-ой всероссийской НПК с международ. участием «Молекулярная диагностика-2007». М. 2007. Т.1. С. 320-323.
Orlov S. T., Neverov A. D., Mihajlovskaja G. V. i dr. Razrabotka i aprobacija test-sistemy «AmpliSens HCV-genotip FRT» na klinicheskom materiale i kontrol'nyh paneljah QCMD // Sbornik trudov 6-oj vserossijskoj NPK s mezhdunarod. uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2007». M. 2007. T. 1. S. 320-323.
41. Николаева Л.И. Новые данные о ВГС-инфекции (по материалам 10 Междун. симпозиума по вирусным гепатитам и заболеваниям печени). Вектор-Бест. 2000. № 3 (17). C. 3449.
Nikolaeva L.I. Novye dannye o VGC-infekcii (po materialam 10 Mezhdun. simpoziuma po virusnym gepatitam i zabolevanijam pecheni). Vektor-Best. 2000. №3(17). S. 3449.
42. Okura I., Horiike N., Michitaka K. et al. Effect of mutation in the hepatitis C virus nonstructural 5B region on HCV replication // Gastroenterol. 2004. Vol. 39(5). P. 449-454.
43. Herrmann E., Sarrazin C. Hepatitis C virus- virus kinetics and resistance mechanisms //Gastroenterol. 2004. Vol. 42 (5). P. 387-396.
44. Balan V., Pivert A., Dumbrava V. Resistance mutation in hepatitis C virus NS5B polymerase gene in patients with chronic hepatitis C virus infection genotype 1b treated with pegylated IFN and ribavirin. Hepatology. 2010. Vol. 52(1). P. 296.
45. Legrand-Abravanel F., Claudinon J., Nicot F. et al. New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus. Virol. 2007. Vol. 81(8). P. 4357-4362.
46. Эсауленко Е.В., Ветров Т.А., Дунаева Н.В., Го А.А. Распространение генотипов вируса гепатита С в Санкт-Петербурге. Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2004. №1. С.14-16.
Jesaulenko E.V., Vetrov T.A., Dunaeva N.V., Go A.A. Rasprostranenie genotipov virusa gepatita C v Sankt-Peterburge. Virusnye gepatity: dostizhenija i perspektivy. 2004. №1. S.14-16.
47. Jensen D., Morgan T., Marcellin P.et al. Earl identification of HCV genotypes 1 patients responding to 24 weeks peginterferon alfa-2a (40 kd)/ ribavirin therapy. Hepatology. 2006. Vol. 43. Р. 954-960.
48. Zeuzem S., Marcellin P., Pockros P. et al. Treatment outcome in patients with hepatitis C virus genotype 1a and 1b and persistently «normal» alanine aminotrasferase (ALT) levels receiving peginterferon alfa-2a (40 kd) plus ribavirin. Clin. Virol. 2006. Vol. 36 (2). P. 136.
49. Nguyen M., Keefe E. Prevalence an treatment of hepatitis C virus genotype 4,5 and 6. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2005. Vol. 3 (Suppl. 3). P. 97-101.
50. Lamatte D., Anderson P., Bailey M. et al. An NS3 protease inhibitor with antiviral effects in humans infected with hepatitis C virus. Nature. 2003. Vol. 426 (6963). P. 186-189.
51. Lemon S., Yi M., Li K. «Strong reasons make strong actions»- The antiviral efficacy of NS3/4A protease inhibitors// Hepatology. 2005. Vol. 41(3). P. 671-674.
52. Carroll S., McCauley J., Ludmerer S. MK-5172: a novel HCV NS3/4A protease inhibitor with potent activity against known resistance mutants. Hepatology. 2010. Vol. 52 (1). P. 17.
53. Pockros P.J. New Direct_acting Antivirals in the Development for Hepatitis C Virus Infection. Therapeutic Advances in Gastroenterology. 2010. Vol. 3 (3). P. 191-202.
54. Диго Р.Н., Хорошевская А.А. Взаимосвязь серологического профиля при вирусных гепатитах В и С и результатами ПЦР// Сборник трудов НПК с международ. участием «Болезни печени в клинической практике». Харьков. 2007. С. 67-68.
—Digo R.N., Horoshevskaja A.A. Vzaimosvjaz' serologicheskogo profilja pri virusnyh gepatitah B i C i rezul'tatami PCR//Sbornik trudov NPKs mezhdunarod. uchastiem «Boleznipecheni v klinicheskoj praktike». Har'kov. 2007. S. 67-68.
55. Рахманова А.Г., Неверов В.А., Кирпичникова Г.И. и др. Вирусные гепатиты (этиопатогенез, эпидемиология, клиника, диагностика и терапия) / Пособие для врачей. п. Кольцово. 2001. 46 с.
Rahmanova A.G., Neverov V.A., Kirpichnikova G.I. i dr. Virusnye gepatity (jetiopatogenez, jepidemiologija, klinika, diagnostika i terapija) / Posobie dlja vrachej. pos. Kol'covo. 2001.46 s.
56. Рогозина Н. В., Мукомолова А. Л., Горячева Л. Г и др. Клинико-лабораторная характеристика острого вирусного гепатита С у детей. Педиатрия. 2004. № 6. С. 25-29.
Rogozina N. V., Mukomolova A. L., Gorjacheva L. G i dr. Kliniko-laboratornaja harakteristika ostrogo virusnogo gepatita C u detej. Pediatrija. 2004. № 6. S. 25-29.
57. Лаптинов И. А. ПЦР-диагностика без электрофореза. Лабораторная диагностика России.Мир медицины: Ежегодный справ. М. 2004-2005. С. 162-163.
Laptinov I. A. PCR-diagnostika bezjelektroforeza. Laboratornaja diagnostika Rossii. Mir mediciny: Ezhegodnyj sprav. M. 2004-2005. S. 162-163.
58. Watkins-Riedel T., Ferenci P., Steindl-Munda P. et al. Early prediction of hepatitis C virus (HCV) infection relapse in nonresponders to primary interferon therapy by means of HCV RNA whole-blood analysis. Clin. Infect. Dis. 2004. Vol. 39(12). P. 1754-1760.
59. ПЦР в режиме реального времени / под. ред. Д.В. Ребрикова. М.: БИНОМ, 2009. 215 с.
PCR v rezhime real'nogo vremeni / pod. red. D.V. Rebrikova M.: BINOM, 2009. 215 s.
60. Walker N.J. A Technique whose time has come// Sciense. 2002. Vol. 296. P. 19.
61. Поклонская Н.В., Амвросьева Т.В., Дьяконова О.В. и др. Использование различных модификаций метода полимеразной цепной реакции при диагностике энтеровирусных инфекций. Медицинские новости. 2003. № 1. С. 91-93.
Poklonskaja N.V., Amvros'eva T.V., D'jakonova O.V. i dr. Ispol'zovanie razlichnyh modifikacij metoda polimeraznoj cepnoj reakcii pri diagnostike jenterovirusnyh infekcij. Medicinskie novosti. 2003. № 1. S. 91-93.
62. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С. Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. Информационный бюллетень. 2001. № 2 (12). С. 8-18.
Mihajlov M.I. Laboratornaja diagnostika gepatita C. Virusnye gepatity: Dostizhenija i perspektivy. Informacionnyj bjulleten'. 2001. № 2 (12). S. 8-18.
63. Sarrazin C. Highly sensitive hepatitis C virus RNA detection methods: molecular backgrounds and clinical significance. Clin. Virol. 2002. Vol. 25(3). P. 23-29.
