CC BY
35
УДК 636.1:575
Джус П.П., астрантка, Костенко С.О., к.б.н., Супрун 1.О., к.с.-г.н. ®
(E-mail: cvic_ua@mai.ru) Нацюнальний утверситет 6iopecypcie i природокористування Украгни, м. Кигв
М1ЖПОРОДНА ДИФЕРЕНЦ1АЦ1Я КОНЕЙ ЗА ЦИТОГЕНЕТИЧНИМИ
ПАРАМЕТРАМИ
Проведено цитогенетичний аналiз тимчасоеих культур лiмфoцитie периферичног крoei коней трьох пoрiд. Виявлено мiжпoрoднi eiдмiннocтi за окремиими цитогенетичними параметрами. У кобил нoeooлекcандрiecькoг ваговозног породи eiрoгiднo вищими були частоти ЛМЯ, АП, MI i eiдcoтoк АРЦРХ noрieнянo i3 юньми украгнськог верховог та голштинськог породи. У тварин украгнськог верховог породи eiдмiченo найвищий eiдcoтoк анеуплогдних клтин. Кот породи голштин характеризувалися найнижчим рieнем ктьтсних i структурних порушень карютипу серед до^джених пoрiд.
Ключовi слова: юнь, порода, цитогенетичш параметри, хромосомш аберацп, мжроядра.
У конярств^ як i в шших галузях тваринництва Украши, прюритетним е забезпечення надежного рiвня продуктивних та вщтворних якостей тварин. Належно профшансоваш селекцшш програми, системний ветеринарний нагляд та шдивщуальний пщхщ при розведенш i утриманш коней не завжди забезпечують очжуваний результат. Тому, актуальними, на сьогодш, можна вважати комплексш дослщження генетики коней в розрiзi !х породно! приналежностi. Адже, генетичний гомеостаз оргашзму е невд'емною запорукою його нормального росту, розвитку, функщонування i вiдтворення. Дестабiлiзацiя геному соматичних кл^ин, що виходить за рамки рiвня спонтанного мутагенезу, слугуе шдикатором наявностi мутагенного впливу факторiв рiзно! природи на тварин [5].
Порушення генетичних структур генеративних клiтин оргашзму призводить до зниження репродуктивних функцш, аномальних вагiтностей та передачi нащадкам конститутивних змiн карiотипу несумiсних з життям. Оскшьки конi моноплiднi тварини, то це негативно вщображаеться на загальнш економiчнiй ефективностi !х утримання.
Серед уЫх видiв сiльськогосподарських тварин кош е найменш вивченими за рiвнем спонтанно! соматично! мiнливостi та спектром хромосомних порушень в умовах ди мутагенних чинникiв. Це обумовлено цитолопчними особливостями клiтин !х кров^ через якi досить складно отримати висок значення мiтотичного iндексу лiмфоцитiв при культивуваннi кровi in vitro [1].
Тому для розширення шформацшно! бази з питань цитогенетики сшьськогосподарських тварин метою нашо! роботи було вивчення соматично! мшливост клiтин кровi коней трьох порiд.
Матер1али i методи. Кров вiдбирали з яремно! вени у кобил новоолександрiвсько! ваговозно! породи (n=11) (Дiбрiвський кiнний завод №62
® Джус П.П., Костенко С.О., Супрун 1.О., 2011
Полтавська обл.), коней голштинсько!' (n=5) i украшсько! верхово!' (n=5) (Кшвський державний шодром) порiд. Вiд кожно!' тварини проби кровi культивували в трьох повторах за стандартною методикою [6] з певними модифшацшми. В першому повторi в якостi стимулятора росту клггин використовували фiтогемаглютинiн (ФГА) Р в робочш концентраци 0,01 мг/мл. В другому - ФГА L концентращею 0,01мг/мл. В третьому повторi - ФГА L 0,001 мг/мл. Використаш реактиви вироблеш Sigma, США.
На цитогенетичних препаратах шдраховували кiлькiсть лiмфоцитiв з мiкроядрами (ЛМЯ), двоядерних (ДЯ), апоптозних клiтин (АП) i мгготичний iндекс (М1). Вiд кожно! тварини аналзували не менше 3000 клггин.
При дослiдженнi метафазних пластинок встановлювали вщсоток хроматидних розривГв (ХР) та хромосомних фрагментов (ХФ), а також вщсоток анеупло1дних (А, рис.1.) i полшло'дних (ПП) клгтин, асинхроннiсть розщеплення центромерних районiв хромосом (АРЦРХ, рис.2). У кожно! тварини аналiзували не менше 30 метафазних пластинок. Для дослщження цитогенетичних препарата тимчасових культур лГмфоцилв використовували бшокулярний мшроскоп Carl Zeiss. Аналiз карiотипу здiйснювали при збтьшент мiкроскопа у 1000 разiв.
Рис.1. Анеуплодiя (2n=41) Рис. 2. АРЦРХ
Результати дослвдження. Перед проведенням цитогенетичного aHani3y було здiйснено ощнку якостi цитогенетичних препaрaтiв тимчасових культур лiмфоцитiв перифершно!" кровi коней, приготованих з шдбором стимуляторiв росту клггин in vitro. Найнижчим рiвень мгготично! aктивностi клiтин виявився при використанш ФГА Р в робочiй концентраци 0,01 мг/мл. Цитогенетичнi препарати характеризувалися малою кiлькiстю клiтин i метафазних пластинок. При використант ФГА L в концентраци 0,01 мг/мл спостериали пригшчення росту клгтин i вщсутнють метафаз. В концентраци 0,001 мг/мл ФГА L виявився найбтьш ефективним. Цитогенетичнi препарати характеризувалися великою юлькютю клiтин i метафаз. Метафази були гарно! якосп, з чiтким розкидом хромосом. Цi препарати було використано для цитогенетичних дослщжень.
Результати цитогенетичного aнaлiзу тимчасових культур лiмфоцитiв коней дослщжених порщ представлено в таблиц 1.
Таблиця 1.
Цнтогенетнчш параметри клггин пернфершно!' кров1 коней_
№ Порода п На 1000 клггин, %
ЛМЯ ДЯ Апоптоз М1
1. Новоолександр1вський ваговоз 11 2,73±0,25 0,67±0,08 * 2,42±0,18 2,55±0,34
2. Укра!нська верхова 5 1,2±0,25 *** 1,0±0,21 1,47±0,25 ** 1,6±1,9 **
3. Голштинська 5 1,67±0,38 * 1,47±0,31 * 1,07±0,36 ** 1,87±0,13
*** - при р< 0,001; ** - при р< 0,01; * - при р< 0,05
Згiдно даних таблицi 1, у дослщжених тварин за окремими цитогенетичними параметрами спостер^аються мiжпороднi вщмшносп. Так, у кобил новоолександрiвсько! ваговозно! породи вiдмiчено статистично достовiрно вищi значення частоти ЛМЯ порiвняно iз значенням аналогiчного показника у коней укра!нсько! верхово! (при р< 0,001) та голштинсько! (при р< 0,05) порщ.
За частотою двоядерних лiмфоцитiв тварини породи голштин переважали коней украшсько! верхово! породи та кобил новоолександрiвськоl ваговозно! породи при р< 0,05. Проте, кшькють двоядерних кл^ин у них достовiрно нижча за значення аналопчного показника у коней росшсько! рисисто! породи, дослiджених Л.Ф. Стародуб. У рисаюв частота ДЯ становила 4,6 %о [3].
Апоптозний шдекс у коней породи новоолександрiвський ваговоз був вiрогiдно вищим (при р< 0,01) порiвняно iз частотою апоптозних кл^ин у тварин породи чистокровна укра!нська верхова i голштин. У кобил ще! ж породи вiдмiчено також найвищий рiвень м^отично! активностi, що вiрогiдно переважае значення аналопчного показника (при р< 0,01) у коней укра!нсько! верхово! породи. За результатами цитогенетичного аналiзу, слщ зауважити, що дослiдженi тварини не пщдаються впливу мутагенних чинникiв, оскшьки частота цитогенетичних порушень ядровмiсних кл^ин !х периферiйно! кровi не перевищуе рiвень спонтанного мутагенезу.
Для вивчення породних особливостей хромосомного полiморфiзму коней дослщжених порщ проводили аналiз метафазних хромосом. Результати наведено в таблищ 2.
Як пом^но iз таблищ 2, кшьккш змiни карiотипу у дослщжених тварин представлеш анеупло!дiею та полшло!доею. Структурнi порушення - асинхронним розходженням центромерних райошв хромосом, хроматидними розривами i хромосомними фрагментами.
Вiдсоток анеупло!дi! у коней породи укра!нська верхова вiрогiдно переважав значення аналогiчного показника у тварин голштинсько! породи (при р<0,05). Мiж частотою анеупло!дi! у кобил новоолександрiвськоl ваговозно! i тварин укра!нсько! верхово! порiд рiзниця недостовiрна. Щодо полiпло!дi!, то дещо вищi значення (2,62 %) вiдмiчено у коней породи новоолександрiвський ваговоз порiвняно iз укра!нською верховою. У коней голштинсько! породи взагалi не виявлено полшлощних клiтин. Одержанi нами результати ствпадають iз даними В.В. Дзiцюк, яка також вказуе на переважання кшькосп анеупло!дних клiтин у коней укра!нсько! верхово! породи порiвняно iз ваговозними породами [2].
Таблиця 2.
Хромосомний полшорфн'Щ коней дослщжених порщ_
№ Порода На 100 метафаз, %
А ПП АРЦРХ ХР ХФ
1. Новоолександ р1вський ваговоз 3,95±0,73 2,62±0,74 7,36±1,11 2,93±0,82 2,68±0,86
2. Укра!нська верхова 6,3±0,96* 1,21±0,74 1,88±0,77 *** 3,23±1,02 3,88±1,21
3. Голштинська 2,65±1,25* 0 1,25±0,77 *** 0 0
*** - при р< 0,001; * - при р< 0,05
За частотою асинхронного розходження центромерних райошв хромосом кобили новоолександрiвсько! ваговозно! породи вiрогiдно переважали (при р< 0,001) коней iнших дослiджених порщ. Це суперечить результатам дослщжень В.В. Дзщюк i А.В. Шельова, у яких кош ваговозного напрямку продуктивносп мають найменший вiдсоток АРЦРХ серед уЫх дослiджених порiд коней [2,7]. Пояснити таю розбiжностi в результатах можна з огляду на те, що ми проводили цитогенетичне тестування кобил новолександрiвсько! ваговозно! породи маточного поголiв'я кумисно! ферми в перюд !х лактаци. З лiтератури нам вщомо, що для корiв саме молочного напрямку продуктивност характерний високий рiвень АРЦРХ. Така особливiсть може бути пов'язана iз фiзiологiчними особливостями i обмiнними процесами в органiзмi самиць пiд час лактаци [4].
При цитогенетичних дослщженнях не було виявлено мiжпородних вiдмiнностей за частотою хроматидних розривiв i хромосомних фрагменив. У коней голштинсько! породи взаг^ не спостерiгалось структурних порушень карютипу.
Отже, в ходi цитогенетичного тестування коней трьох порщ встановлено вщсутшсть впливу факторiв мутагенно! природи на дослщжених тварин. Рiвень цитогенетично! нестабшьност клiтин !х перифершно! кровi вщповщае параметрам спонтанно! соматично! мiнливостi, притаманно! ссавцям.
Внсновкн 1. Для одержання високо! якостi цитогенетичних препаратiв тимчасових культур лiмфоцитiв периферично! кровi коней найбшьш ефективним е використання стимулятора росту кл^ин in vitro ФГА L в робочш концентрацп 0,001 мг/мл.
2. Серед трьох дослщжених порщ кош породи новоолександрiвськоl ваговозно! характеризуются найвищою частотою лiмфоцитiв з мжроядрами, апоптозних клiтин, мiтотичного шдексу та асинхроннiстю розходження центромерних райошв хромосом.
3. Для коней укра!нсько! верхово! породи характерний найвищий вщсоток анеупло!дi! порiвняно iз значенням аналопчного показника у тварин порiд новоолександрiвський ваговоз i голштин.
4. У коней породи голштин вiдмiчено найнижчий рiвень кiлькiсних i структурних порушень геному соматичних кл^ин порiвняно iз тваринами iнших дослiджених порiд.
Л1тература
1.Атлас ветеринарной гематологии / Риган В., Сандерс Т., Деникола Д. -М: Аквариум, 2000. - 136с.
2.Дзщюк В. В. Хромосомний полiморфiзм окремих видiв i порщ сшьськогосподарських тварин : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня доктора с/г наук : спец. 03.00.15 « Генетика» / В. В. Дзщюк. - Чубинське, 2009. - 30 с.
3.Костенко С.О. Цитогенетичнке тестування коней росшсько! рисисто! породи / С.О. Костенко, Л.Ф. Стародуб // Мiжвiдомчий тематичний науковий збiрник «Розведення i генетика тварин». - К.: Аграрна наука. - 2009. - С. 187 -192.
4.Стародуб Л. Цитогенетичний контроль продуктивност велико! рогато! худоби / Л. Стародуб, С. Костенко // Вкник Сумського нащонального аграрного ушверситету. - 2010. - №12. -С. 117-123.
5.Пикалова Л. В. Приминение цитогенетических методов исследования хромосом в радиологии / Л.В. Пикалова // Молекулярная биология. - Т. 9. - 2007. -С. 160 - 168.
6.Шельов А. В. Методика приготування метафазних хромосом лiмфоцитiв перифершно! кровi тварин / А. В. Шельов, В. В. Дзщюк // Методики наукових дослщжень i3 селекци, генетики та бютехнологи у тваринництвi : наук. зб. — К., 2005. — С. 210—213.
7.Шельов А. В. Цитогенетична ощнка племшних ресурЫв сшьськогосподарських тварин : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня кандидата с.-г. наук : спец. 03.00.15 "Генетика" / А.В. Шельов - с. Чубинське, 2008. - 17 с.
Summary
The citogenetical analysis of limfocites temporal cultures from the peripheral blood of three horse breed is done. The differences between breeds by the separate citogenetical parameters found out. Mares of novooleksandrivska heavy trout breed have certainly higher frequencies of limfocites with micronucleus, apoptotic cells, mitotic indices and percent of asynchronous of centromere districts of chromosomes breaking up comparatively with the horse of Ukrainian riding and Holstein breeds. The greatest percent of aneuploid cells is marked in the Ukrainian riding breed. The horses of Holstein breed are characterized by the lowest level of quantitative and structural violations of karyotype among the investigational.
Keywords: citogenetical analysis, citogenetical parameters of horses, micronucleus, chromosomes aberration.
Рецензент - д.с.-г.н., проф. Щербатий З.£.
