CC BY
87
58 Разведение, селекция, генетика
УДК 575.174.015.3
Микросателлитный анализ якутского скота
Н.П. Филиппова1, Н.И. Павлова1, Л.П. Корякина2, Н.П. Степанов3, Н.Н. Мордовской3,
Н.Н. Григорьева2
1 ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем»
2 ФГБОУ ВО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия»
3 ГБУ Республики Саха (Якутия) «Сахаагроплем»
Аннотация. Методом ДНК-анализа определены генотипы 97 животных якутского скота по 15 микросателлитным локусам ДНК: ETH3, CSSM66, INRA23, BM1818, ILSTS6, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ETH225, TGLA53, CSRM60, BM2113, BM1824, ETH10. Выявлено, что внутрипородная структура якутского скота различается в аллельном спектре по 15 микросателлитным локусам. Из 15 исследованных микросателлитных локусов 9 обладают высокой степенью гетерозиготности - от 0,6 до 0,8. Частота встречаемости различных аллелей 15 микросателлитных локусов в изученной выборке варьировала от 0,5 % до 82,5 %. При этом подавляющее большинство аллелей встречалось с частотой менее 50 %. Всего у исследованных животных было идентифицировано 77 аллелей. Число аллелей на локус варьировалось от 2 (BM1818) до 9 (TAGLA53), а значения PIC - от 0,272 до 0,742. Среднее число на локус составило 5,13±0,456. Значения уровней наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности находились в пределах 0,351-0,814 (в среднем 0,605±0,038) и 0,300-0,776 (в среднем 0,600±0,037) соответственно.
Ключевые слова: скотоводство, местные породы, якутский скот, полиморфизм, микроса-теллитные локусы, ДНК-анализ, аллели, гетерозиготность.
Введение.
Скотоводство является традиционным занятием народов Якутии, испокон веков занимавшихся разведением уникального якутского скота [1-4]. Находясь в экстремальных природно-климатических условиях, якуты вывели прекрасно адаптированный к местным условиям скот и создали уникальную скотоводческую культуру в условиях Крайнего Севера, включая зону Арктики. Якутский скот отличается неприхотливостью, минимальной потребностью в кормах, высоким содержанием жира в молоке и питательностью мяса [5-8].
Изучению генетической структуры популяций якутского скота по частотам антигенов крови посвящены работы ряда учёных [9-11]. В результате этих исследований выявлен широкий спектр распространения эритроцитарных антигенов в популяции местного якутского скота, а также характерные для них особенности в различных системах групп крови.
Открытие микросателлитных последовательностей генома сельскохозяйственных животных, имеющих очень высокий уровень полиморфизма, стало новым этапом генетической оценки. На уровне генотипа изменения могут быть оценены на любом из этапов разведения скота [12-15].
Согласно базе данных INRA (French National Institute for Agricultural research) у крупного рогатого скота выявлено 2402 микросателлита, из которых 2244 картированы (микросателлиты имеются на всех 30 парах хромосом) [16].
Местные породы могут обладать присущими только им комбинациями аллелей и быть важным резервом генетической вариабельности для коммерческих пород домашних животных. Очевидно, что такие аллели должны быть обнаружены, сохранены и использованы в селекционной работе [17]. Поэтому крайне актуально выявить генетически уникальные породы.
Цель исследования.
Изучить уровень генетического разнообразия в популяциях якутского скота с использованием мультилокусного анализа по гипервариабельным микросателлитным последовательностям ДНК.
Разведение, селекция, генетика 59
Материалы и методы исследования
Объект исследования. Якутский крупный рогатый скот.
Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями Russian Regulations, 1987 (Order No. 755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) and «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1966)». При выполнении исследований были предприняты меры, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.
Схема эксперимента. Для исследований был взят якутский скот в количестве 97 голов ге-нофондного хозяйства ГБУ РС (Я) «Сахаагроплем» в двух филиалах: «Онхой» Верхне-Вилюйского района (n=49), «Кылыс» Горного района (n=48) Республики Саха (Якутия).
Материалом для генетического анализа микросателлитных локусов послужили образцы ДНК, выделенные стандартным фенольно-хлороформным методом [18]. Крупный рогатый скот генотипировали, используя набор реагентов COrDIS Cattle для молекулярно-генетической характеристики крупного рогатого скота, с целью анализа родства и ДНК-индивидуализации животных на основе мультиплексного ПЦР-анализа 15-ти локусов, содержащих короткие тандемные повторы (STR), известные также как микросателлитные локусы (ETH3, CSSM66, INRA23, BM1818, ILSTS6, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ETH225, TGLA53, CSRM60, BM2113, BM1824, ETH10).
Каждый локус оценивали по длине, числу частных и эффективных аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, PIC - показателю информативности, Fis - коэффициенту, отражающего дефицит или избыток гетерозигот в популяции.
Оборудование и технические средства. Выделение ДНК проводили в лаборатории попу-ляционной генетики ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем». Микросателлитный анализ проводился в лаборатории ООО «Гордиз» (г. Москва) по 15 локусам микросателлитов. Крупный рогатый скот генотипировали с помощью набора реагентов COrDIS Cattle (ООО «Гордиз», Россия). Фрагменты амплификации идентифицировали на генетическом анализаторе «НАНОФОР-05» («Синтол», Россия) с применением капиллярного электрофореза с детекцией лазериндуцированной флуоресценции.
Статистическая обработка. Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения «GenAlEx» (v.6.5) (Австралия) [19].
Результаты исследования.
На начало 2018 года поголовье якутского скота составляло 1681 голов, в том числе 666 коров (табл. 1). В Якутии якутский скот разводится в одиннадцати районах - Эвено-Бытантайском, Амгинском, Намском, Горном, Таттинском, Чурапчинском, Мегино-Кангаласском, Хангаласском, Сунтарском, Жиганском и Оймяконском.
Таблица 1. Динамика поголовья якутского скота в Республике Саха (Якутия) на 2011-2018 г., голов
Показатели По годам
2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018
Поголовье якутского
скота (гол.), 1267 1440 1465 1391 1343 1471 1519 1681
в т. ч. коров (гол.) 489 541 532 547 541 573 638 666
Методом ДНК-анализа определены генотипы 97 животных якутского скота двух хозяйств по 15 микросателлитным локусам ДНК: ЕТН3, CSSM66, ШКЛ23, ВМ1818, ILSTS6, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ЕТН225, TGLA53, CSRM60, ВМ2113, ВМ1824, ЕТН10. Выявлено, что внутрипородная структура якутского скота различается в аллельном спектре по 15 микроса-теллитным локусам.
60
Разведение, селекция, генетика
Всего у исследованных животных было идентифицировано 77 аллелей. Число аллелей на локус варьировалось от 2 (BM1818) до 9 (TAGLA53) (рис. 1). Среднее число на локус (Na) составило 5,13±0,456. Меньшее генетическое разнообразие якутского скота выражается и в малом количестве эффективных аллелей (Ne), среднее значение которого равно 2,780±0,226.
Наиболее полиморфным локусом оказался TGLA227 (Ne=4,461), а наименее - локус SPS 115 (Ne=l,428).
10
ш
о
и
8 б 4 2 0
А
Л* Л> <а> <$?> <$><= л) ль л> & £> Л
ЛОКУС МИКРОСАТЕЛЛИТОВ ■ Ыа ■ Ые
Рис. 1 - Число аллелей ^а), число эффективных аллелей (Ne) микросателлитных локусов якутского скота
Установлено, что частота встречаемости различных аллелей варьировала от 0,5 % до 82,5 %. При этом подавляющее большинство аллелей встречалось с частотой менее 50 %. Было выявлено 12 редких аллелей для данной популяции (ЕТН3 (115), CSSM66 (183), TAGLA227 (89,93), TAGLA126 (119), SPS115 (252, 262), TAGLA53 (166,184), CSRM60 (92, 100), ЕТН10 (213).
Уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) варьировал от 0,351 (SPS115) до 0,814 (ILSTS6, TAGLA227), а показатель ожидаемой гетерозиготности (Не) - от 0,300 (SPS 115) до 0,776 (TAGLA227) (рис. 2). Высокие значения гетерозиготности свойственны микросателлитным локу-сам из-за множественности аллельных вариантов, обусловленных изменчивостью числа повторяющихся мотивов ДНК.
ЛОКУС МИКРОСАТЕЛЛИТОВ
I Но //Л Не IIIIIIIIII PIC
■ Fis
Рис. 2 - Уровень наблюдаемой (Но), уровень ожидаемой (Не) гетерозиготности,
показатель информативности (PIC) и индекс фиксации (Fis) у якутского скота
Разведение, селекция, генетика 61
Из 15 исследованных микросателлитных локусов 9 обладают высокой степенью гетерози-готности - от 0,6 до 0,8. Наибольшее значение степени гетерозиготности у якутского скота выявлено для локусов TGLA 227 (0,814) и ILSTS006 (0,814), низкое - у локусов SPS115 (0,351) и ВМ1818 (0,381).
Нарушение генетического равновесия выявлено по микросателлитному локусу TAGLA53 (Х2=166,89; df=36; Р<0,05).
Результаты расчётов показали, что для 11 локусов из 15 показатель информативности превышает значение 0,5, что свидетельствует о высокой информативной ценности локусов для выявления генетических различий между животными и группами животных. Наибольший показатель PIC имели локусы TGLA 227 (0,742) и ILSTS006 (0,712). Наименьшее значение показателя информативности отмечается у локуса SPS 115 - 0,272.
Эффективным инструментом оценки избытка или недостатка гетерозигот является показатель индекса фиксации, используемый в популяционной генетике в качестве критерия достоверности принадлежности группы особей к конкретной популяции. Показатель индекса фиксации достаточно точно отражает избыток или недостаток гетерозигот для большинства из изученных микро-сателлитных локусов - в случае избытка гетерозигот его значение было отрицательным (BM1824 (-0,077), BM2113 (-0,059), ETH10 (-0,042), ILSTS006 (-0,091), TGLA227 (-0,050), TGLA 122 (-0,008), CSRM60 (-0,071), TGLA53 (-0,086), SPS115 (-0,170); недостатка гетерозигот - положительным (ETH225 (0,052), ETH3 (0,058), INRA023 (0,008), BM1818 (0,115), CSSM66 (0,128), TGLA 126 (0,107).
Обсуждение полученных результатов.
По статистическим данным на начало 2018 г. поголовье якутского скота составляет 1681 голов и разводится в одиннадцати районах Якутии. Для сохранения и увеличения поголовья уникального якутского скота приняты меры государственной поддержки, благодаря которым за последние три года (2016-2018 гг.) наблюдается положительная динамика роста поголовья.
На сегодняшний день проблема сохранения генетических ресурсов домашних животных стала одной из самых актуальных в мире. Для сохранения генетической изменчивости и эффективного использования малочисленных стад предложены различные приёмы. Так, по данным ФАО, при разделении популяций на субпопуляции, обменивающиеся между собой единичными особями, например, быками, устойчивость системы существенно повышается, и потери аллелей в те же сроки, что и в случае не подразделенной популяции, не происходит [20].
Проведённый анализ показал наличие высокого полиморфизма микросателлитов [21, 22]. Число аллелей по 15 локусам микросателлитов варьирует от 2 до 9.
Исходя из полученных данных, следует, что меньшее генетическое разнообразие (Na=5,13±0,456; Ne=2,780±0,226) и средний уровень гетерозиготности (Ho=0,604±0,036) указывают на то, что исследованные популяции якутского скота являются закрытыми. Полученные данные согласуются с данными других исследователей [23]. И тем не менее, наблюдаемая гетерозигот-ность популяции выше ожидаемой по 9 локусам микросателлитов, т. е. система случайного скрещивания преобладает над инбридингом, что подтверждается отрицательным значением Fis (-0,012±0,023). Было выявлено 12 редких аллелей для данной популяции якутского скота - (ETH3 (115), CSSM66 (183), TAGLA227 (89,93), TAGLA126 (119), SPS115 (252, 262), TAGLA53 (166,184), CSRM60 (92, 100), ETH10 (213). Выявленные редкие аллели свидетельствуют об уникальности якутского скота.
Выводы.
Результаты проведённых исследований якутского скота свидетельствуют о широком полиморфизме микросателлитов. Для сохранения аборигенного якутского скота и поддержания оптимального уровня генетического разнообразия необходимо проводить контроль параметров генетической структуры и ротацию быков-производителей.
62 Разведение, селекция, генетика
Литература
1. Иванов В.Ф. Историко-этнографическое изучение Якутии XVII-XVIII вв.: монография. М.: Изд-во «Наука», 1974. 286 с.
2. Горохов Н.И. Проблемы совершенствования молочного скота в условиях Республики Саха (Якутия): автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук. Новосибирск, 2005. 38 с.
3. Актуальные направления исследований в животноводческой отрасли Республики Саха (Якутия) / В.В. Романова и др. // Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2017. № 3. С. 107-114.
4. Абрамов А.Ф. Прошлое и будущее якутской породы скота. Якутск, 2017. 40 с.
5. Чугунов А.В. Адаптация крупного рогатого скота в условиях Крайнего Севера: монография. Якутск: Изд-во ЯГУ, 1993. 64 с.
6. Иванова З.И. Генофонд антигенов крови крупного рогатого скота Якутии: монография. Новосибирск, 1997. 149 с.
7. Корякина Л.П. Местные породы: аборигенный якутский скот // VetPharma Farm Animals. 2013. № 2. С. 43-47.
8. Саха Ынага - дар предков: монография / Р.Г. Попов, Р.И. Бравина, С.И. Заровняев, Г.Н. Оси-пова, И.А. Филиппова. Якутск: Изд-во «Бичик», 2013. 176 с.
9. Черкашенко В.И. Генетические особенности крупного рогатого скота турано-монгольской группы по полиморфным системам крови в связи с сохранением генофонда: дис. ... канд. биол. наук. Л.: Пушкин, 1984. 132 с.
10. Алексеева П.Е., Иванова З.И. Генетический полиморфизм эритроцитарных антигенов якутского скота // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. № 7. С. 29-31.
11. Иванова З.И. Генофонд антигенов крови крупного рогатого скота Якутии: монография. Новосибирск, 1997. 149 с.
12. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И. Селекция XXI века: использование ДНК-технологий. Лесные Поляны: Изд-во ВНИИплем, 2000. 31 с.
13. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. М.: РАСХН, 2008. 501 с.
14. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота / Т.Ю. Киселева, Б.Е. Подоба, Е.Е. Заблудовский, В.П. Терлецкий, Н.И. Воробьев, Ю. Кан-танен // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 6. С. 20-25.
15. Денискова Т.Е., Соловьева А.Д., Зиновьева Н.А. Изучение динамики изменений алле-лофонда и генетического разнообразия в трёх популяциях романовских овец с помощью микросателлитов // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: материалы XXVII Всерос. молодёж. конф., посвящ. памяти академика РАСХН Г.С. Муромцева М.: ФГБНУ ВНИИСБ, 2017. С. 22-23.
16. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота / Т.Ю. Киселева, Б.Е. Подоба, Е.Е. Заблудовский и др. // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 4. С. 20-25.
17. Grzybowski G., Prusak B. Genetic variation in nine European cattle breeds as determined on the basis of microsatellite markers III. Genetic integrity of the Polish Red cattle included in the breeds preservation programme // Animal Science Papers and Reports. 2004. 22(1). P. 45-46.
18. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных / Л.А. Калашникова, И.М. Дунин, В.И. Глазко и др. Лесные поляны: ВНИИплем, 1999. 147 с.
19. Peakall R., Smouse Р.Е. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research - an update // Bioinformatics. 2012. Vol. 28. P. 2537-2539.
20. Столповский Ю.А., Захаров-Гезехус И.А. Проблема сохранения генофондов домести-цированных животных // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017. Т. 21. № 4. С. 477-486.
Разведение, селекция, генетика 63
21. Характеристика аллелофонда сычевской породы крупного рогатого скота по ДНК микросателлитам / Д.Н. Кольцов, В.В. Волкова, Е.А. Гладырь и др. // Достижения науки техники в АПК. 2012. № 8. С. 56-58.
22. Аржанкова Ю.В., Мосачихина И.А., Харитонов А.В. Генетические особенности чёрно-пёстрого и помесного крупного рогатого скота по микросателлитным локусам // Известия Великолукской государственной сельскохозяйственной академии. 2015. № 1. С. 7-11.
23. Характеристика аллелофонда якутского скота по микросателлитам / Е.А. Гладырь, Я.Л. Шадрина, П.В. Горелов и др. // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 6. С. 65-69.
Филиппова Наталья Павловна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», 677010, г. Якутск, ул. Сергеляхское шоссе, 4, тел.: 8-914-303-43-95, e-mail: inni-ah1970@list.ru
Павлова Надежда Ивановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Якутский научный центр комплексных медицинских проблем», 677010, г. Якутск, ул. Сергеляхское шоссе, 4, тел.: 8-914-303-43-95, e-mail: inni-ah1970@list.ru
Корякина Лена Прокопьевна, кандидат ветеринарных наук, доцент, заведующий кафедрой физиологии сельскохозяйственных животных и экологии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия», 677008, Якутск, ул. Чайковского 32/1, тел.: 8924360-81-67, e-mail: koryrinalp_2017@mail.ru
Степанов Николай Прокопьевич, кандидат сельскохозяйственных наук, заместитель руководителя ГБУ Республики Саха (Якутия) «Сахаагроплем», 677000, г. Якутск, ул. Орджоникидзе, 20, к. 204, тел.: 8964415-74-05, e-mail: nikprok74@mail.ru
Мордовской Ньургун Николаевич, главный зоотехник ГБУ Республики Саха (Якутия) «Сахаагроплем», 677000, г. Якутск, ул. Орджоникидзе, 20, к. 204, тел. 8964415-74-05, e-mail: nikprok74@mail.ru
Григорьева Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии сельскохозяйственных животных и экологии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия», 677008, г. Якутск, ул. Чайковского 32/1, тел.: 8-914-108-58-86, e-mail: nataliag@mail.ru
Поступила в редакцию 31 октября 2018 года
UDC 575.174.015.3
Filippova Natalya Pavlovna1, Pavlova Nadezhda Ivanovna1, Koryakina Lena Prokopievna2, Stepanov Nikolay Prokopievich3, Mordovsky Nyurgun Nikolaevich3, Grigorieva Natalya Nikolaevna 2
1FSBSI «Yakut Scientific Center for Complex Medical Problems», e-mail: inniah1970@list.ru
2 FSBEIHE «Yakut State Agricultural Academy», e-mail: koryrinalp_2017@mail.ru
3 SBI of the Sakha Republic (Yakutia) «Sakhaagroplem», e-mail: nikprok74@mail.ru Microsatellite analysis of Yakut cattle
Summary. Using DNA analysis there were identified 97 genotypes of Yakut cattle by 15 microsatellite DNA loci: ETH3, CSSM66, INRA23, BM1818, ILSTS6, TGLA227, TGLA126, TGLA122, SPS115, ETH225, TGLA53, CSRM60, BM2113, BM1824, ETH10. It was revealed that intra-breed structure of the Yakut cattle differs in the allelic spectrum by 15 microsatellite loci. 9 of the 15 microsatellite loci studied have a high degree of heterozygosity - from 0.6 to 0.8. Alleles frequency of 15 microsatellite loci in the studied sample varied from 0.5 % to 82.5 %. At the same time, the overwhelming majority of alleles had frequency less than 50 %. A total of 77 alleles were identified in the studied animals. The number of alleles per locus ranged from 2 (BM1818) to 9 (TAGLA53), and PIC values ranged from 0.272 to 0.742. The average number per locus was 5.13±0.456. The levels of the observed and expected heterozygosity ranged from 0.351-0.814 (on average 0.605±0.038) and 0.300-0.776 (on average 0.600±0.037), respectively.
Key words: beef cattle breeding, local breeds, Yakut cattle, polymorphism, microsatellite loci, DNA-analysis, alleles, heterozygosity.
