CC BY
93
УДК 631.421.1:579.64
О. А. ПОРХУНЦОВА, В. И. БУШУЕВА, А. А. ФЕДОРЕНЧИК, З. М. АЛЕЩЕНКОВА
МИКРОБНО-РАСТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ ФИТОРЕМЕДИАНТ ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЕПРОДУКТАМИ ПОЧВ
(Поступила в редакцию 18.03.2015)
Приведены результаты анализа эффективности ис- We have presented results of the analysis of efficiency of the
пользования микробно-растительной ассоциации для фи- use of plant-microbial association for phyto-remediation of soil
торемедиации почвы, загрязненной нефтепродуктами. в contaminated with petroleum products. As phyto-extractant we
качестве фитоэкстрагента используется люцерна посев- used alfalfa (medicago sativa l.). The microbial component in-
ная (medicago sativa l.). микробный компонент включает cludes strains of both specific for alfalfa nodule bacteria (sino-
штаммы специфичных для люцерны клубеньковых бактерий rhizobium meliloti), and the phosphate-mobilizing bacteria (ser-
(sinorhizobium meliloti), так и фосфатмобилизующих бак- ratia plymuthica) from the family of enterobacteriaceae. We
терий (serratia plymuthica) из семейства enterobacteriaceae. have confirmed resistibility of alfalfa plants to oil pollutants and
Подтверждена устойчивость растений люцерны посевной their ability, together with associated bacteria, to restore the
к нефтяному загрязнителю и способность совместно с soil micro-biocenosis typical for the given conditions. ассоциативными бактериями к восстановлению типичного для данных условий почвенного микробоценоза.
Введение
Наиболее ценным и невозобновляемым природным ресурсом является почва. Под воздействием антропогенного загрязнения изменяются ее физические, агрохимические и микробиологические характеристики. Критическое состояние земельных ресурсов постоянно нарастает из-за значительного накопления поллютантов в количествах, превышающих способность почв к самоочищению. В связи с этим необходимы экологически безопасные и экономически обоснованные методы, направленные на интенсификацию процессов биоразложения углеводородов и восстановление плодородия сельскохозяйственных земель.
Анализ источников
В мире к уже известным формам загрязнения почв добавился исключительно опасный фактор человеческого вторжения - нефтяное загрязнение. Усиленная эксплуатация и загрязнение пахотных земель отрицательно сказываются на продуктивности почв и целостности биосферы.
Наиболее распространенными формами почвенных загрязнителей являются нефтяные масла. По химическому составу они представляют собой смеси высокомолекулярных парафиновых, нафтеновых и ароматических углеводородов с некоторой примесью смолистых и асфальтообразных веществ. Исходным сырьем для производства легких индустриальных масел служат соляровые дистилляты беспарафиновых нефтей. Отработанные масла токсичны, имеют невысокую степень биоразлагаемо-сти (10-30 %). Они более опасны, чем сырая нефть, поскольку в них содержатся измененные в ходе эксплуатации добавки, полиолефины, смолы, асфальтены, карбены, механические примеси и другие загрязнители [1]
В практике используют различные технологи восстановления почв, загрязненных нефтепродуктами. Самыми распространенными являются биологические методы в силу относительно малых затрат при их осуществлении. Из биологических методов наиболее действенным приемом устранения нефтяного загрязнения является фиторемедиация, основанная на естественной способности растений и ризосферных микроорганизмов деградировать и накапливать различные поллютанты. Многие виды растений способны накапливать поллютанты, причем их содержание в тканях и органах растений может в десятки и сотни раз превышать содержание в окружающей среде. Для фитостимуляции микробов-деструкторов ризосферы корней используют растения, обладающие обширной корневой системой, секретирующие специфические вещества, способствующие росту микроорганизмов, например, овсяницу, плевел, люцерну [2-7].
Органические поллютанты могут или разрушаться в корневой зоне растений, или поглощаться с последующим разрушением, изолированием или испарением. Фиторемедиация успешно применяется для очистки почвы от гербицидов, углеводородов, полихлордифенилов и других органических полю-тантов. Неорганические загрязнители не могут быть деградированы. Однако фиторемедиация может привести к очистке среды от этих поллютантов путем их стабилизации или изолирования в тканях растений. Фиторемедиация позволяет не только устранить нефтяное загрязнение, но и в сочетании с другими приемами рекультивации частично или полностью восстановить почвенное плодородие [8].
В чистых суглинистых почвах общая численность колониеобразующих единиц (КОЕ) основных групп микроорганизмов составляет «9,5 млн/г почвы [9]. На загрязнение почвы нефтепродуктами почвенные микроорганизмы отвечают изменением численности и состава. Увеличение общего числа
микроорганизмов объясняется внесением в почву дополнительного количества доступного для них органического вещества, а снижением - наличием токсических для микроорганизмов веществ в составе нефтепродукта (толуол, ксилол, бензол, нафталин и др.) [10, 11]
Наиболее чувствительными к нефтяному загрязнению являются нитрифицирующие и целлюлозоли-тические микроорганизмы. В клетки нитрифицирующих бактерий легко проникают токсические вещества. Это свойство используется для определения ингибиторов нитрификации. Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам различных систематических групп. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью окислять твердые парафины, ароматические углеводороды, обладают высокой скоростью роста [12]. Активными деструкторами нефтепродуктов также являются аэробные спорообразующие формы [13].
Методы исследования
В качестве растительного компонента для фиторемедиации почв, загрязненных нефтепродуктами, была выбрана люцерна посевная. Микробный компонент был представлен бактериальной ассоциацией штаммов клубеньковых и фосфатмобилизующих бактерий (Sinorhizobium meliloti и Serratia plymu-thica). Данный бактериальный инокулянт предназначен для обработки семян люцерны с целью формирования эффективной микробно-растительной системы в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами. Он разработан в Лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси».
Нефтяными загрязнителями почвы были индустриальное чистое и отработанное масла.
В качестве контроля был использован посев люцерны посевной в чистую почву с предварительной инокуляцией семян. Инокулянтом были быстрорастущие бактерии Sinorhizobium meliloti [14].
Для закладки опыта был выделен участок, выведенные из структуры севооборота опытного поля кафедры селекции и генетики УО БГСХА. Почва дерново-подзолистая, среднесуглинистая, развивающаяся на лессовидном суглинке, подстилаемая с глубины 1 м моренным суглинком; глубина пахотного горизонта 17-22 см. Пахотный слой почвы содержит 1,4-1,8 % гумуса. Содержание Р2О5 и К2О в почве в среднем составило 180-190 и 152-176 мг/кг, соответственно, при рН Kci почвы 5,6-6,1. На основании анализа почвенных образцов на участках проводилось известкование почв и внесение фосфорно-калийных удобрений. Среднее годовое количество осадков по многолетним данным составляет около 679,3 мм, а сумма активных температур 1764,5 оС. По количеству осадков и сумме активных температур Горецкий район Могилевской области соответствует условиям возделывания люцерны посевной.
Почва отведенного участка трехкратно, с интервалом 10-12 дней, обрабатывалась путем дискования с последующим боронованием. Люцерна посевная, как другие многолетние бобовые травы (гале-га, клевер), чувствительна к засоренности посевного участка в первый год жизни. Поэтому многократная обработка почвы значительно снизила засоренность участка, исключая применение на нем гербицидов сплошного действия.
Внесение нефтепродуктов проводилось путем равномерного разлива по поверхности подготовленной почвы в объеме 1 л/м2 и 3 л/м2 (согласно схеме опытас последующим рыхлением. Посев проводился рядовым способом с междурядьями 15 см при 3-кратной повторности с нормой высева семян люцерны посевной 1,8 г/м2 при 100 % хозяйственной годности. Через каждые 20 дней проводилось рыхление почвы междурядий. Урожайность зеленой массы учитывали сплошным методом. Содержание сухого вещества определялось путем высушивания зеленой массы до абсолютно сухого состояния в сушильном шкафу в течение 6-7 часов при 105 оС. Изучение структуры микробоценоза почвы проводили методом посева на агаризованные среды.
Основная часть
Через 15 дней после посева на контрольных делянках были отмечены всходы. Густота и темп роста травостоя в них составили 9 и 7 баллов. Лишь через 20-25 дней после посева были отмечены всходы растений по другим вариантам опыта при густоте травостоя 1-3 балла. Наиболее изреженны-ми были посевы в вариантах с применением 3 л/м2 нефтяного загрязнителя.
В контрольном варианте было 122 растений/м2. Обработка почвы нефтепродуктами негативно отразилась на процессе прорастания семян. По другим вариантам количество растений составило 1635 шт./м2. Наибольшая изреженность травостоя была отмечена в вариантах с загрязнением почвы нефтепродуктом в объеме 3 л/м2 (16-17 растений/м2). Но в опыте не было вариантов, в которых произошла бы полная гибель проростков (табл. 1). Высота растений по вариантам составило 60-70 см. Самыми высокорослыми были растения варианта 4 (70 см). Низкорослые растения были в вариантах с концентрацией загрязнителя 3 л/м2. Загрязнение почвы нефтепродуктами привело к замедлению роста и развития растений. Аналогичные результаты получены в исследованиях Н. А. Киреевой и др. [6, 15].
№ п/п Вариант Растений, шт./м2 Густота/темп роста растений, балл Высота растений, см Продуктивность зеленой массы, г/раст Урожайность зеленой массы, кг/м2 Облиственность растений, % Содержание сухого вещества, %
1 Люцерна посевная, S. meliloti (контроль) 122 9/7 67 28,9 2,9 43,3 24,9
2 Люцерна посевная, S. meliloti и S. рlymu-Ш^, индустриал. масло 1 л/м2 34 3/3 68 60,1 1,5 49,2 23,7
3 Люцерна посевная, S. meliloti и S. plymu-индустриал. масло 3 л/м2 17 1/3 60 41,4 0,8 52,5 22,1
4 Люцерна посевная, S. meliloti и S. plymu-^^ отработан. масло 1 л/м2 35 3/3 70 54,6 1,8 51,2 22,6
5 Люцерна посевная, S. meliloti и S. plymu-отработан. масло 3 л/м2 16 1/1 61 33,2 0,8 51,7 22,8
НСР 05 - - - 15,9 0,7 - -
Об эффективности фиторемедиации почв микробно-растительной асссоциацией свидетельствует оценка люцерны посевной по продуктивности зеленой массы, облиственности растений и содержанию сухого вещества. Вес надземной массы одного растения в опыте составил 28,9-60,1 г. Наименьшее значение имел контроль (28,9 г), что связано с более высокой густотой травостоя в сравнении с другими вариантами. В вариантах 2 и 4 этот показатель составил 60,1 г и 54,6 г, в вариантах 3 и 541,4 г и 33,2 г соответственно. На продуктивность зеленой массы растений люцерны в большей степени оказывает влияние объем внесенного в почву нефтепродукта, чем его форма.
Урожайность зеленой массы по вариантам составила 0,8-2,9 кг/м2. Высокую урожайность зеленой массы имел контроль, в котором были созданы благоприятные условия для вегетации: отсутствие загрязнителя и использование специфического инокулянта. В других вариантах урожайность зеленой массы была в 2-4 раза меньше, чем в контроле, и составила 0,8-1,8 кг/м2.
Облиственность растений в контрольном варианте составила 43,3 %. Варианты 2-5 характеризовались значительным увеличением облиственности, она составила 49,2-52,5 %. Повышение облиственности свидетельствует об эффективности фитоиспарения, как одной из форм фиторемедиации почв. Фитоиспарение представляет собой способность растений поглощать нефтепродукты в процессе поддержания своего водного баланса, т.е. вместе с водой выкачивать из почвы загрязняющее вещество.
В контрольном варианте при облиственности 43,3 % содержание сухого вещества в зеленой массе составило 24,9 %. В вариантах 2-5 на фоне увеличения облиственности отмечено снижение содержания сухого вещества - 22,1-23,7 %. Повышение облиственности, уменьшение содержания сухого вещества в вариантах с применением нефтяного загрязнителя и микробного инокулянта свидетельствует об эффективности фиторемедиации почв растениями люцерны посевной.
Параллельно с полевыми наблюдениями проводился лабораторный анализ микрофлоры почвы, направленный на выявление специфики микробоценоза ризосферы люцерны в условиях нефтяного загрязнения и его изменений при насыщении почвенной биоты азотфиксирующими (Sinorhizobium meliloti) и фосфатмобилизующими (Serratia plymuthica) бактериями. В почвенных ризосферных пробах определяли численность агрономически ценных групп микроорганизмов: аммонифицирующих, денитрифицирующих (усваивающих минеральный азот), спорообразующих и олигонитрофильных бактерий и свободноживущих ризобий. В июле, через 45 дней после обработки почвы, в почвенном микробоценозе ризосферы люцерны, загрязненных нефтепродуктами (варианты 3-5), было отмечено значительно сокращение численности аммонифицирующих, спорообразующих бактерий и свобод-ноживущих ризобий в сравнении с контрольным вариантом. Токсические вещества отработанного масла и высокая концентрация индустриального масла негативно отразились на численности тех групп бактерий, которые обеспечивают деградацию токсических веществ нефтепродуктов. В этот период растения люцерны отстают в росте и развитии, чем в контроле, т.е. еще не наблюдается фито-стимуляции микробов-деструкторов корнями люцерны (рис. 1). Численность денитрифицирующих и олигонитрофильных бактерий была практически равнозначна контрольному варианту. Олигонитро-фильные бактерии довольно хорошо развиваются на безазотистой среде, обладают слабой азотфик-сирующей способностью, но их накопление в почве может значительно содействовать обогащению ее азотом. Исключением в данной закономерности соотношения групп микроорганизмов в почвенном микробоценозе был вариант с внесением в почву индустриального масла в концентрации 1 л/м2. В этом варианте отмечалось значительное превышение численности аммонифицирующих, денитрифицирующих, олигонитрофильных бактерий и свободноживущих ризобий в сравнении с контролем. Стимулирующие действие индустриального масла при концентрации 1 л/м2на микробиологическую активность почвы связано с появлением питательного субстрата для микроорганизмов. При этом также возможно прояв-
ление эффекта Арнд-Шульца: токсические соединения нефтепродуктов в нелетальных дозах изменяют пронимаемость мембраны клетки, нарушают ее барьерные функции, что определяет свободное поступление питательных веществ в клетку и соответственно усилением метаболизма [16]. При повторной оценке почвенной микрофлоры ризосферы люцерны (сентябрь, через последующие 45 дней) были отмечены значительные изменения численности изучаемых групп микроорганизмов (рис. 2).
Рис. 1. Влияние загрязнения нефтепродуктами Рис. 2. Влияние пряжения нефтепродуктами
на микробоценоз дерново-подзолистой почвы на ^р^ценш дершв^пвдюлисгой п°чвы
(на 45 день после обработки) (на 90 день после обработки)
Во всех вариантах с использованием нефтяного загрязнителя отмечено превышение численности изучаемых групп микроорганизмов над контрольным вариантом (Medicago sativa. L. и Sinorhizobium meliloti). Значительным превышением в сравнении с контролем характеризуются аммонифицирующие (+0,30-0,60) и олигонитрофильные (+1,05-1,80) бактерии. Аммонифицирующие микроорганизмы осуществляют разложение азотсодержащих органических соединений с выделением аммиака. Это самая богатая и разнообразная физиологическая группа (бактерии и спорообразующие формы). Интенсивность минерализации в значительной мере определяется численностью и активностью аммо-нификаторов и обуславливает степень обеспеченности почвы минеральными соединениями, следовательно, ее эффективным плодородием.
В общей численности микроорганизмов при повторном анализе почвенных проб существенное место заняла группа фосфатмобилизующих бактерий, количество которых в вариантах с обработкой семян ассоциацией бактерий было выше, чем в контрольном варианте.
В сравнении с первыми отборами почвенных проб при повторном анализе отмечен значительный рост олигонитрофильных микроорганизмов и усваивающих минеральные формы азота. Высокая интенсивность развития бактерий этих группировок свидетельствует об активности процесса минерализации органических веществ.
Олигонитрофильные микроорганизмы завершают минерализацию органических соединений и имеют существенное значение в азотном балансе почв. Благодаря способности использовать органические и неорганические соединения азота в почве, они функционируют как аммонификаторы, де-нитрификаторы и азотфиксаторы. Эти микроорганизмы имеют относительно высокую потребность в углероде и низкую - в азоте. Поэтому они являются своеобразным индикатором обеспеченности почвы мобильным органическим веществом.
Заключение
Изменения морфометрических показателей растений люцерны посевной и их продуктивности подтверждают эффективность использования данной культуры в качестве растительного компонента в фиторемедиации загрязненных почв.
Интродукция азотфиксирующих (Sinorhizobium meliloti) и фосфатмобилизующих бактерий (Serra-tia plymuthica) в ризосферу люцерны посевной в условиях загрязнения почвы нефтепродуктами обеспечила не только стабилизацию микрофлоры почвы, но и способствовала повышению процессов минерализации органического вещества и мобилизации труднодоступных форм фосфора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Каменчук, Я. А. Отработанные нефтяные масла и их регенерация (на примере трансформаторных и индустриальных масел) : дис. ... канд. хим. наук : 02.00.13 / Я. А. Каменчук. - Томск, 2007. - 131 с.
2. Ступин, Д. Ю. Загрязнение почв и новешие технологии их восстановления: учебное пособие / Д. Ю. Ступин. - СПб: Изд-во «Лань», 2009. - 432 с.
3. Белоусов, B. C. Обоснование и разработка биотехнологических приемов реабилитации экологически неблагоприятных ландшафтов / B. C. Белоусов, А. А. Швец // Наука Кубани. - 2007. - №4. - С. 53-56.
4. Киреева, Н. А. Фосфогидролазная активность нефтезагрязненных почв / Н. А. Киреева, Е. И. Новоселова, Ф. Х. Хазиев // Почвоведение. 1997. - №6. - С. 723-725.
5. Башмаков, Д. И. Аккумуляция тяжелых металлов некоторыми высшими растениями в разных условиях местообитания / Д. И. Башмаков, А. С. Лукаткин // Агрохимия. - 2002. - №9. - С. 66-71.
6. Киреева, Н. А. Детоксикация нефтезагрязненных почв под посевами люцерны (Medicago sativa L.) / Н. А. Киреева, Е. М. Тарасенко, М. Д. Бакаева // Агрохимия. - 2004. - № 10. - С. 68-72.
7. Вальков, В. Ф. Почвенная экология сельскохозяйственных растений / В. Ф. Вальков. - М, 1986. - 206 с.
8. Белоусов B. C. Пути восстановления плодородия почв, подверженных химической и биологической деградации в Западном Предкавказье / B. C. Белоусов, А. А. Швец // Энтузиасты аграрной науки / Тр. КубГАУ. - Краснодар, 2009. - Вып. №9. -С. 142-145.
9. Михайлова, А. В. Эколого-биологические особенности и подходы к нормированию загрязнения нефтепродуктами городской среды Архангельска: : дис. ... канд. биолог. наук: 03.02.08 / А. В. Михайлова. - Архангельск, 2014. - 158 с.
10. Биологическая активность загрязненных нефтью и рекультивируемых торфяно-глеевых почв республики Коми / Н. А. Киреева [и др.] // Агрохимия. - 2008. - № 8. - С. 68-72.
11. Звягинцев, Д. Г. Биологическая активность почв и шкалы для оценки некоторых ее показателей / Д. Г. Звягинцев // Почвоведение. - 1978. - № 6. - С. 48.
12. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почвы нефтью / Д. Г. Звягинцев [и др.] // Почвоведение. - 1989. - № 1. - С. 72-78.
13. Нгуен, В. Т. Гетеротрофные бактерии техногенных субстратов как основа биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводородов и поверхностно-активных веществ: автореф. дис. ... канд. биолог. наук: 03.01.06 / В. Т. Нгуен. - Ульяновск, 2013. - 24 с.
14. Новикова, Н. И. Современные представления о филогении и систематике клубеньковых бактерий / Н. И. Новикова // Микробиология, 1996. - Т. 65, № 4. - С. 437-450.
15. Киреева, Н. А. Рост и развитие растений овса на почвах, загрязненных неф- тью / Н. А. Киреева, Х. А. Юмагузи-на, Г. Г. Кузяхметов // Сельскохозяйственная биоло- гия. - 1996. - № 5. - С. 48-54.
16. Громов, Б. В. Экология бактерий / Б. В. Громов, Г. В. Павленко. - Л., 1989. - 248 с.
УДК 633.854.78:631.527.
Т. Г. ТОВСТАНОВСКАЯ СОЗДАНИЕ СОРТОВ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО В УСЛОВИЯХ ЮЖНОЙ СТЕПИ УКРАИНЫ
(Поступила в редакцию 23.03.2015)
Представлены результаты селекционной работы по со- We have presented results of breeding work to create varie-
зданию сортов льна масличного технического и пищевого ties of oilseed flax for technical and food purposes, adapted to
назначения, адаптированных к климатическим условиям the climatic conditions of southern Steppe of Ukraine. Creation
южной Степи Украины. Создание новых сортов льна масли- of new varieties of oilseed flax of Zaporozhye selection is made
чного запорожской селекции осуществляется традиционным by traditional (selection from hybrid population) and the latest
(отбор из гибридной популяции) и новейшими (пыльцевая (pollen selection, experimental mutagenesis) breeding methods.
селекция, экспериментальный мутагенез) методами селек- Introduction of high-yield varieties of oilseed flax of the selec-ции. Внедрение в производство высокопродуктивных сортов tion of the Institute of oilseeds will increase the area under this
льна масличного селекции института масличных культур crop. позволит увеличить посевные площади под этой культурой.
Введение
На протяжении многих десятилетий ведущей масличной культурой в Украине является подсолнечник. Однако в последние годы значительно возрос интерес ко льну масличному. Начиная с 2000-х гг. его выращивание сопровождается значительной динамикой увеличения. Так, в 2008 г. лен масличный высевали на площади 19,3 тыс. гекаров, а уже с 2009 г. посевные площади установились в пределах 50-60 тыс. гектаров. Прогнозы ученых свидетельствуют о том, что увеличение посевных площадей сохранится и в перспективе. Основа такой тенденции заключается в ряде преимуществ этой культуры.
Анализ источников
Лен масличный является одним из лучших предшественников для большинства сельскохозяйственных культур и не ограничивает размещение в севообороте других масличных культур благодаря севу в ранние сроки (что позволяет более эффективно использовать осенне-зимние запасы почвенной влаги). Благодаря короткому вегетационному периоду (80-100 суток) уборку можно проводить уже в конце июля. Лен масличный также может быть незаменимой страховой культурой в случае гибели озимых культур [1]. За последние годы резко изменились климатические условия в сторону потепления, вследствие чего выращивание льна масличного как засухоустойчивой культуры становится очень актуальным, особенно в южных и восточных областях Украины. Простая технология выращи-
