CC BY
67
ОГЛЯДИ
УДК 577.15:577.152.3
МІКРОБНІ а-L-РАМНОЗИДАЗИ: ПРОДУЦЕНТИ, ВЛАСТИВОСТІ, ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ
О. В. ГУДЗЕНКО, Л. Д. ВАРБАНЕЦЬ Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Отримано 23.02.2012
Огляд присвячено a-L-рамнозидазам, які гідролітично відщеплюють кінцеві невідновлені а-1,2-, а-1,4- та а-1,6-зв’язані залишки L-рамнози в a-L-рамнозидах. Розглянуто методи визначення a-L-рамнозидазної активності за допомогою як природних, так і синтетичних субстратів. Ці ензими знайдено в організмах рослин, тварин, дріжджів, грибів і бактерій. Показано, що найактивнішими біосинтетиками є мікроміцети. Описано методи виділення та очищення a-L-рамнозидаз мікробного походження, які включають осадження ензиму з розчинів органічними розчинниками та нейтральними солями, діаліз, ультрафільтрацію, гель-фільтрацію, іонообмінну та афінну хроматографію. Узагальнено дані щодо фізико-хімічних властивостей (рН-оптимуму, термооптимуму, молекулярної маси) та субстратної специфічності a-L-рамнозидаз. Встановлено, що ензимні препарати, які отримували з одних і тих самих продуцентів під час культивування їх у присутності різних індукторів, виявляли різну субстратну специфічність. Показано, що a-L-рамнозидази належать до глікозилгід-ролаз з каталітичними доменом (a/a)6 -барель. Біотехнологічні властивості ензиму спрямовано на використання в харчовій, фармацевтичній і хімічній промисловості. У харчовій промисловості a-L-рамнозидази застосовують для поліпшення якості напоїв (зменшення гіркоти, підсилення аромату вин) та у виробництві харчових добавок; у фармацевтичній — для отримання багатьох лікарських засобів, а також їхніх попередників; у хімічній — як попередник для виробництва рамнози.
Ключові слова: а^-рамнозидаза, продуценти мікробного походження, фізико-хімічні властивості, субстратна специфічність, практичне використання.
Сучасні промислові біотехнологічні компанії приділяють велику увагу розробленню нових ензимів для впровадження їх у різні сфери виробництва. Серед цих ензимів важливе місце посідає а^-рамнозидаза, яка характеризується специфічністю щодо термінальних залишків рамнози, що присутні в природних глікокон’югатах та синтетичних глікозидах. В останні роки цей ензим привертає особливу увагу дослідників, які на основі глікозидів рослинного походження створюють засоби для лікування серцево-судинних захворювань, а також препаратів з противірусною та імунотропною дією. Для вияву біологічної дії деяких із цих препаратів необхідна наявність рамнози, в інших випадках — її відщеплення.
На сьогодні ензимні технології становлять альтернативу хімічним процесам, оскільки за їх участю можна зменшити витрати енергії та матеріалів, мінімізувати витрати й виділення тепла. Тому а^-рамно-зидази набули такого широкого застосуван-
ня в харчовій, фармацевтичній та хімічній промисловості.
а^-рамнозидаза (а^-рамнозид-рамно-гідролаза — К.Ф. 3.2.1.40) гідролітично відщеплює кінцеві невідновлені а-1,2-, а-1,4-та а-1,6-зв’язані залишки L-рамнози в а^-рамнозидах. Розщеплення О-глікозидного зв’язку відбувається зі збереженням конфігурації аномерного атома вуглецю (С1 у циклічній формі моносахариду).
L-рамноза є компонентом пектинових полісахаридів [1], глікопротеїнів [2], вторинних метаболітів, таких як антоціаніни [3], флавоноїди [4] і тритерпеноїди [5]. Її також знайдено в бактеріальних гетерополі-сахаридах [6], рамноліпідах [7] та ліпополі-сахаридах зовнішніх бактеріальних мембран [8]. Рамноза є важливим біоактивним компонентом цитотоксичних сапонінів [9,10], протигрибних рослинних глікоалкалоїдів [11] і факторів вірулентності бактерій [12]. У рослинах L-рамнозовмісні терпенові глікозиди можуть відігравати протективну
роль щодо вільних агліконів [13]. L-рамнозо-вмісні флавоноїдні глікозиди мають антиоксидантні та протизапальні властивості [14].
a-L-рамнозидази було виявлено в багатьох мікроорганізмах, а також деяких рослинних і тваринних тканинах, тоді як ß-L-рамнозидазу (ЕС 3.2.1.43) описано лише в Klebsiella aerogenes [15].
Традиційна номенклатура глікозидаз ґрунтується на субстратній специфічності й лише іноді враховує молекулярний механізм їхньої дії. Накопичення даних щодо первинної структури глікозидаз дало підставу запропонувати нову класифікацію на основі гомології амінокислотних послідовностей [16]. Ця класифікація на сьогодні налічує понад 100 родин. В основному a-L-рамнозидази належать до родини 78, винятком є ензим Sphingomonas paucimobilis, який віднесено до родини 106 [17]. Ендорам-нозидази, які містять бактеріофаг Sf6, належать до родини 90 [18].
На цей час відома 71 a-L-рамнозидаза, ізольована з бактерій, дріжджів та мікромі-цетів. Як свідчать дані літератури [19], a-L-рамнозидаза не є життєво необхідною для мікроорганізмів, оскільки за відсутності у них активного внутрішньоклітинного або позаклітинного ензиму спостерігається нормальний цикл їх розвитку, тобто фактор синтезу і секреції ензиму в культуральну рідину у цих мікроорганізмів невідомий. Однак незаперечним є той факт, що у мікроорганізмів, які живуть на середовищах зі вмістом специфічних субстратів — індукторів ензиму, a-L-рамнозидаза бере участь в обміні речовин, деградуючи ці субстрати до більш простих і доступних для подальшого катаболізму в клітині з метою одержання необхідних структурних елементів і хімічної енергії. Не виключають її роль у процесах синтезу та деградації таких компонентів клітинних оболонок, як гліколіпіди, глікопро-теїни та інші рамнозовмісні сполуки. Це припущення тим більш очевидне, що в природних умовах цей ензим найчастіше трапляється в тих еконішах, де інтенсивніше здійснюється перебіг метаболічних процесів [19].
Методи визначення активності a-L-рамнозидази
a-L-рамнозидазну активність визначають колориметричним методом Шомоді та Нельсона [20, 21], а також HPLC [22] за кількістю утвореної рамнози. Визначаючи активность a-L-рамнозидази цими методами, використовують різні природні субстра-
ти: нарингін, понцирин, неогесперидин, рутин, гесперидин, сайкосапонін, азіатіко-зид, кверцитрин і просциларидин А. У разі визначення активності a-L-рамнозидази методом Romero [23] застосовують синтетичні хромогенні субстрати, п-нітрофенільні похідні, зокрема п-нітрофеніл-а-і-рамнопі-ранозид. На рис. 1 наведено реакцію гідролізу п-нітрофеніл-а-і-рамнопіранозиду a-L-рамнозидазою.
Рис. 1. Гідроліз л-нітрофенільного синтетичного субстрату за дії a-L-рамнозидази
Відомо [6], що спорідненість ензиму стосовно природних флавоноїдних рамногліко-зидів вища, ніж щодо синтетичних субстратів. За використання Ь-рамнозовмісних флавоноїдів величини Кт були набагато нижчими, ніж на п-нітрофенільному субстраті. Тому для визначення активності а-Ь-рамнозидази найчастіше як субстрат застосовують нарингін, який є більш доступним і дешевим (на відміну від синтетичних) природним субстратом [24] і містить, крім Ь-рамнози, також D-глюкозу. а-Ь-рамнозида-за розщеплює нарингін на термінальну Ь-рамнозу та прунін (рис. 2, а). За допомогою р-О-глюкозидази, яка часто міститься разом з а-Ь-рамнозидазою, прунін перетворюється на нарингенін і глюкозу (рис. 2, б). Нарингенін має більш виражене забарвлення порівняно з нарингіном.
Рис. 2. Гідроліз a-L-рамнозидазою нарингіну до пруніну (а) та ß-D-глюкозидазою пруніну до нарингеніну (b) [6]
Продуценти a-L-рамнозидаз
Незважаючи на те, що a-L-рамнозидази знаходять в тканинах тварин (морських молюсків Turbo cornutus [25], свиней [26]), рослин (Rhamnus daurica [27] і Fagopyrum exculentum [28]), найбільш технологічними джерелами їх одержання є мікроорганізми, оскільки вони здатні надзвичайно швидко розмножуватись та здійснювати синтез в умовах, контрольованих людиною.
Показано [29], що в разі використання індукторів, таких як L-рамноза, нарингін, рутин, геспередин, a-L-рамнозидазу продукують Acremonium persicinum CCF 1850, Aspergillus aculeatus CCF 108, A. aculeatus CCF 3134, A. aculeatus CCF 3138, A. niger CCIM K2, A. terreus CCF 3059, Circinella mus-cae CCF 2417, Emericella nidulans CCF 2912, Eurotium amstelodami CCF 2723, Fusarium oxysporum CCF 906, Mortierella alpine CCF 2514, Mucor circinelloides griseo-cyanus CCIM, Penicillium oxalicum CCF 2430, Rhizopus arrhizus CCF 100, Talaromyces fla-vus CCF 2686, Trichoderma harzianum CCF 2687, Rhizopus nigricans [30-37]. Показано, що Curvularia lunata [38] та деякі мезофіль-ні грибні штами (Aspergillus flavus, Mucor racemonus, Fusarium sambucinum, A. kawac-hii, Penicillium aureatiogriseum, Trichoderma longibrachiatum, Fusarium solani) є продуцентами a-L-рамнозидаз [39]. Наявність a-L-рамнозидазної активності у фітопатоген-них грибів вперше описано для патогена вівса Corticium rolfsii [40] і зернового патогена Stagonospora avenae [41]. Дуже специфічні a-L-рамнозидази, що здатні деградувати різні сапоніни, знайдено в Absidia sp. [42] і Plectosphaerella cucumerina [11].
Найбільше досліджено біохімічні характеристики грибних a-L-рамнозидаз Aspergillus terreus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus [29], Penicillium sp., P. decumbens [43], на основі яких створено комерційні препарати (нарингіназа — Penicillium sp., P. decum-bens, гесперидиназа — A. niger, фірма Sigma-Aldrich, США).
Низький рівень a-L-рамнозидазної активності виявлено у дріжджових штамів Oeno coccus oeni, Saccharomyces cerevisiae, Hansula anomala, Debaryomyces ploymor-phus [44]. Але ефективним продуцентом a-L-рамнозидази виявилась лише Pichia angusta Х349 [45].
Продукування a-L-рамнозидаз бактеріями описано для родів Bacteroides і Fusobacterium K-60, [46, 47], а також Sphingomonas paucinmobilis, Bacillus sp. [48, 49], термофільних бактерій Clostridium stercorarium
[50] і Thermomicrobia sp. [51]. Деякі штами Pseudoalteromonas sp. і Ralstonia pickettii, які отримано з морської води Антарктики, виявляли a-L-рамнозидазну активність у діапазоні температур від -1 до +80С [52]. Відомі нечисленні продуценти з Lacto bacil -lus sp. [53, 54].
Таким чином, на сьогодні накопичено чимало відомостей про бактеріальні, грибні та дріжджові культури мікроорганізмів, які здатні синтезувати a-L-рамнозидазу. Однак найактивнішими біосинтетиками цього ензиму є мікроміцети, рівень активності їхніх продуцентів становив 1,8-230 Од/мл, що перевищує рівень бактеріальних (0,02-2,0 Од/мл) і дріжджових (0,1-8,0 Од/мл) культур. Нині найперспективнішими вважають такі грибні продуценти: Absidia sp. [42], Aspergillus terreus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus, A. flavus, [29], Penicillium sp., P. decum-bens [43].
Виділення та очищення a-L-рамнозидаз
Отримання високоактивних ензимів у гомогенному стані — надзвичайно складне завдання, оскільки містить низку етапів, на яких необхідно контролювати зміни їхньої активності, аби уникнути значних втрат. Поряд із цим для кожного продуцента потрібно розробляти свою, індивідуальну послідовність етапів одержання високоочи-щеного препарату ензиму. На сьогодні існує декілька схем отримання a-L-рамнозидази, які передбачають різні підходи до очищення та концентрування ензиму залежно від внутрішньоклітинного чи позаклітинного похо дження:
• відділення клітинної біомаси від куль-туральної рідини, яке здійснюється методами фільтрації, сепарування (екстрагування водою або іншими розчинниками — для внутрішньоклітинних продуцентів), центрифугування;
• очищення та концентрування розчинів, що містять ензим, за допомогою вакуум-упарювання, виморожування, осадження ензиму з розчинів органічними розчинниками та нейтральними солями, діаліз, ультрафільтрація, гель-фільтрація, іонообмінна та афінна хроматографія.
a-L-рамнозидазу, виділену з печінки морського членистоногого T. cornutus, очищено до гомогенного стану за допомогою колонкової хроматографії на КМ целюлозі і Sephadex G-150, теплової обробки та заморожування за кислого рН [25]. Очищення a-L-рамнозидази, ізольованої з печінки свиней,
включало: гомогенізацію печінки в буфері, фракціонування сульфатом амонію, діаліз та іонообмінну хроматографію на DEAE-целюлозі [26]. Очищення a-L-рамнозидази, виділеної з насіння гречихи F. esculentum, передбачало стадії отримання неочищеного екстракту, фракціонування сульфатом амонію, хроматографію на колонках Sephаdex G-75, DEAE-Sephadex та Ultrogel AcA-44. Гомогенність ензиму підтверджено електрофорезом у ПААГ [28].
За даними літератури [6, 12, 30], більшість a-L-рамнозидаз бактеріального похо -дження є внутрішньоклітинними. Так, a-L-рамнозидазу Bacteriodes JY-6, виділену
з кишкової мікробіоти людини, очищено від інших глікозидаз відділенням бактеріальних клітин, суспендуванням їх у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7, ультразвуковою обробкою, фракціонуванням сульфатом амонію, колонковою хроматографією на DEAE-целюлозі, Silica-PAE, Sephаcryl S-300 і гід-роксіапатиті [46]. Для a-L-рамнозидази Fusobacterium K-60, також виділеної з кишкової мікробіоти людини, очищення включало розділення бактерій ультразвуком, фракціонування сульфатом амонію, колонкову хроматографію на Butyl-Toyopeаrl, оксіапатиті, Sephacryl S-300 і Q-Sepharose [47]. Авторами [48] здійснено очищення a-L-рамнозидази Bacillus sp. GL 1 руйнуванням клітин ультразвуком, фракціонуванням сульфатом амонію, колонковою хроматографією на DEAE-Sepharose CL-6B, Butyl-Toyopearl 650M, Sephacryl S-200HR i QAE-Sephadex A-25. У літературі [55, 56]
є відомості щодо очищення і властивостей внутрішньоклітинної a-L-рамнозидази Pseudomonas paucimobilis FP2001. Очищено термостабільну a-L-рамнозидазу Ram A із C. stercorarium [50]. Beekwilder зі співавт. [53] очистили a-L-рамнозидази Lactobacillus plantarum і L. acidophilus. Проведено експресію a-L-рамнозидаз із генів L. plantarum NCC 245 в Escherichia coli з подальшим очищенням [54].
Також внутрішньоклітинною є a-L-рам-нозидаза, виділена з дріжджів P. angusta X349, яку очищено до гомогенного стану осадженням сульфатом амонію, колонковою хроматографією на конканавалін А-Sepha-rose, DEAE Bio Gel A агарозі, Rhamnose-Sepharose 6B та оксіапатиті [45].
Відомо [55, 57], що більшість глікозидаз мікроміцетів є глікопротеїнами і виділяються в процесі розвитку продуцента в культу-ральну рідину, тобто є позаклітинними ензимами. Вони характеризуються низкою
переваг порівняно з внутрішньоклітинними, одна з яких — відсутність трудомісткого процесу руйнування клітин продуцента.
Очищення a-L-рамнозидази з культу-ральної рідини A. terreus СЕСТ-2663, вирощеного з використанням рамнози або нарин-гіну як єдиного джерела вуглецю, охоплювало осадження сульфатом амонію, іонообмінну хроматографію на DEAE-Sepharose CL-6B, гель-фільтрацію на Sephadex G-200 [58]. a-L-рамнозидазу очищено з культурального фільтрату A. nidu-lans СЕСТ 2544, вирощеного з використанням рамнози як індуктора, комбінацією адсорбції на DEAE A-50, Hi Load 16/10 Q-Sepharose FF, Hi Load 26/S Sepharose FF, а також гель-фільтрацією на Superose 12 HR 10/30 [35].
Mаnzanares зі співавт. [34] очистили різні a-L-рамнозидази RhaA і RhaB з культурального фільтрату A. aculeatus, вирощеного на геспередині, з використанням катіо-нообмінної хроматографії і гель-фільтрації. Очищення й характеристика a-L-рамнози-дази гриба Absidia sp. (EECDL-39) включала відділення міцелію від культурального фільтрату, фракціонування сульфатом амонію і хроматографію на Bioscale Q-2 BioRad [42]. Feng зі співавт. [38] очистили осадженням сульфатом амонію, гель-фільтрацією, катіоно- і аніонообмінною хроматографією рамнозидазу C. lunata, активну стосовно сапоніну. Shanmugaprakash зі співавт. [36] повідомляли про очищення нарингінази з A. niger MTCC 1344, шляхом концентрування супернатанта ультрафільтрації, осадження сульфатом амонію, іонообмінної хроматографії на Q Sepharose Sephadex G-200. Koseki зі співавт. [37] очистили a-L-рамно-зидазу з культурального фільтрату A. kawac-hii, вирощеного на L-рамнозі, осадженням сульфатом амонію, HPL^ іонообмінною хроматографією і гель-фільтрацією на колонках. a-L-рамнозидази A. flavus [59] і Penicillium citrinum MTCC-8897 [60] очищено з культуральних рідин ультрафільтрацією та катіонообмінною хроматографією на КМ-целюлозі.
Проте, незважаючи на значний промисловий інтерес, тільки декілька неочищених препаратів a-L-рамнозидаз (гесперидиназа та нарингіназа), які на цей час виробляють (Sigma, США), отримано з представників родів Aspergillus та Penicillium. Окрім a-L-рамнозидази вони містять ß-D-глюкозидазу як супутній компонент що лімітує їх використання. Відомий комерційний препарат нарингіназа, виділений з A. niger, очищено
гель-фільтрацією на Q-Sepharose, Sephacryl S-200 і S-100. Інший відомий препарат
3 A. aculeatus виявляв субстратну специфічність до и-нітрофен^^^-рамнопіранозиду, нарингіну і гесперидину [57].
Таким чином, a-L-рамнозидази саме мікроскопічних грибів, які продукують зовніш-ньоклітинні ензими, заслуговують на особливу увагу біотехнологів порівняно із внутрішньоклітинними ензимами бактерій і дріжджів, які потребують значних затрат для виділення a-L-рамнозидази.
Фізико-хімічні властивості a-L-рамнозидаз
Загальні властивості очищених a-L-рам-нозидаз наведено в табл. 1. Показано, що a-L-рамнозидази мають рН-оптимум від 2,0 до 11,0. Головні відмінності між грибними і бактеріальними ензимами полягають у суттєвій різниці залежності активності від рН. Грибні ензими мають рН-оптимум у кислій ділянці, тоді як бактеріальні — близькій до нейтральної або лужної. Ці характеристики уможливлюють використання грибних і бактеріальних ензимів у різних галузях. Так, грибні a-L-рамнозидази частіше використовують у таких процесах, як виноробство [24] і виробництво соків [45]. Бактеріальні ензими бажано застосовувати у виробництві L-рамнози шляхом гідролізу геспередину та різних флавоноїдних глікозидів [61].
Температурний оптимум дії більшості a-L-рамнозидаз становить 40-80 °С, винятком є бактеріальна a-L-рамнозидаза Pseudoalte-romonas sp., яка виявляла активність при
4 ОС [52]. Температурний оптимум для очищеної a-L-рамнозидази A. kawachii становив 60 ОС, у таких умовах ензим зберігав 80% від максимальної активності протягом 1 год [37].
Молекулярна маса більшості досліджених a-L-рамнозидаз — від 40 до 240 кДа (табл. 1). Водночас трапляються олігомерні форми з молекулярною масою 500 кДа [62]. На відміну від рослинних глікозидаз, які звичайно представлені двома формами (високо- та низькомолекулярними), для глі-козидаз грибного і тваринного походження характерною є наявність лише однієї висо-комолекулярної форми, хоча у A. aculeatus вона мала два мономери з a-L-рамнозидаз-ною активністю (92 і 85 кДа відповідно) [55]. Бактеріальні та дріжджові ензими нерідко складаються з двох, трьох, чотирьох моно-мерних одиниць і мають відповідно більшу молекулярну масу [55].
Порівняльний аналіз молекулярних мас a-L-рамнозидаз із різних продуцентів ускладнюється тим, що різні автори наводять дані молекулярної маси ензиму на основі результатів тільки одного методу, найчастіше гель-фільтрації у нативній системі, або денатуруючого електрофорезу, що не дає змоги повно охарактеризувати активну молекулу ензиму.
Вивчення складу мікробних a-L-рамно-зидаз показало, що більшість досліджуваних позаклітинних ензимів є глікопротеїна-ми, причому відсоток вуглеводної частини істотно відрізняється у різних продуцентів (для грибних продуцентів він може становити 15-24%).
Як свідчать дані літератури [55], грибні a-L-рамнозидази — це кислі протеїни зі значенням рІ у межах рН 4,0-6,0, оскільки у них високий вміст кислих (20-25%) і гідрофобних (до 35%) амінокислот.
Субстратна специфічність
Природними субстратами для a-L-рамно-зидаз з різних джерел є a-L-рамнозовмісні флавоноїди та сапоніни рослин, глікопротеї-ни, камеді, смоли, пігменти, в яких залишок a-L-рамнози з’єднаний a-1,2-, a-1,4-, і a-1,6-зв’язками з ß-D-глюкозидом або приєднаний безпосередньо до аглікону в положенні С1. Ці речовини мають незначну різницю в структурі аглікону: рутин, гес-перидин, нарингін, кверцитрин є похідними флавоноїдів, тимчасом як гінзенозид — це сапонін, а азіатикозид — терпеновий глікозид. L-рамноза безпосередньо зв’язана з агліко -новою частиною тільки у кверцитрині, тоді як всі інші субстрати — це комплекс глікозидів, у яких L-рамноза зв’язана з ß-D-глю-копіранозильною одиницею за допомогою різних типів глікозидних зв’язків: a-1,2 — у нарингіні та гінзенозиді, a-1,4 — в азіати-козиді, a-1,6 — у рутині й гесперидині (рис. 3).
Субстратами для a-L-рамнозидази можуть бути також рамнозовмісні дисахариди, що містять a-D-ксилозу, ß-D-фукозу, a-D-галактозу і a-N-ацетил-D-глюкозамін у редукованих тер-міналях: О-a-рамнопіранозил-a-1,3-D-ксилоза; O-a-L-рамнопіранозил-a-1,2-D-фукоза, O-a-L-рамнопіранозил-a-1,2-D-галактоза, O-a-L-рамнопіранозил-a-1,4-D-галактоза,
O-a-L-рамнопіранозил-a-1,3-N-ацетил-D-глю-козамін, O-a-L-рамнопіранозил-a-1,6-N-ацетил-D-глюкозамін, O-a-L-рамнопіранозил-a-1,4^-ацетил-0-глюкозамін.
У табл. 2 наведено дані щодо субстратної специфічності різних продуцентів
Таблиця 1. Фізико-хімічні властивості a-L-рамнозидаз, виділених із різних продуцентів
№ Продуцент рН- оптимум Термооптимум, °С Молекулярна маса, кДа рІ Література
1 Fagopyrum esculentum - - 70 а 3,7 28
2 Turbo cornutus 2,8 - - - 25
3 Pig Liver 7 42 б 4 - 26
4 Bacteroid JY-6 7 - 120б 240а 4,2 46
5 Fusabacterium K-60 5,5 41б 70а 5,2 47
6 Clostridium stercorarium 7,5 60 50
7 Pseudoalteromonas species 6,0 40 - - 52
8 Bacillus sp. GL1 7 50 100б,в 49
9 Thermomicrobia sp. (RhmA RhmB) 7.9, 5-6.9 70 104б210а і 107б 210а 51
10 Lactobacillus plantarum NCC 245 (RhaBl and RhaB2) 7 і 5 50 i 60 73®, 155в,а 57б 100в,а 53
11 Lactobacillus plantarum 7 - - 54
12 L. acidophilus 6 - - 54
13 Corticium rolfsii 2 - - 40
14 Pseudomonas paucimobilis FP2001 7,8 45 112б,а 7,1 56
15 Pichia angusta X349 6 40 88б 90в 4,9 45
16 Rhizopus nigricans 6,5 60-80 - -
17 Aspergillus aculeatus (RhaA and RhaB) 4,5-5,0 - 92б і 85б 34
18 A. aculeatus (pnp-rhamnohydrolase and RG-rhamnohydrolase) 5,5 і 4 60 87б і 84б 29
20 A. nidulans 4,5-6 60 102б 5 35
21 A. terreus 5,5 60 89б, 97а 32
22 A. flavus 6,5 50 40 6
23 A. flavus MTCC-9606 11,0 50 41 - 59
24 A. niger 4 50 168а - 36
25 A. kawachii 4 50 90б - 37
26 A. kawachii 4,5 60 - - 29
26 Mucor racemosus 5,5-6,5 55-60 - - 29
27 Fusarium sambucinum 5,5-6,5 55-60 - - 29
28 Penicillium aureatiogriseum - 60 - - 29
28 Trichoderma longibrachiatum 4,5-5,5 60 - - 29
29 Fusarium solani 6,5 - - - 29
30 Curvularia lunata 4 50 66б - 38
31 Absidia sp. 5 40 53б - 42
Примітка. Молекулярну масу визначено за допомогою: а — гель-фільтрації; б — SDS-PAGE; в — PAGE.
он
ж
ОН КЬаОН
А — нарингін (С27Н32О17, М 580,5)
Б — кверцитрин (С21Н20О11, М 448,4)
/,
В — рутин (С27Н30О16, М 610,6)
Е — неогесперидин (С28Н34О15, М 610,6)
Є — понцирин (С28Н34О14, М 594,6)
З — гінзенозид Re (С48Н82О18, М 947,17) Рис. 3. Структури природних субстратів а^-рамнозидаз [6]
а-Ь-рамнозидази, а також значення Кт для п-нітрофеніл-а-Ь-рамнозиду, нарингіну, гес-перидину, рутину, кверцитрину, понцири-ну, сайкосапоніну С, просцилардину А і неогесперидину. Різні а-Ь-рамнозидази здатні гідролізувати а-1,2-, а-1,3-, а-1,4- і а-1,6-глікозидні зв’язки. Кт для п-нітрофеніл-а-L-рaмнозиду знаходиться в межах 0,057-2,8 мМ, для нарингіну — 0,021-1,9 мМ, геспередину — 0,02-1,3 мМ, рутину —
0,028-1,44 мМ, кверцитрину — 0,077-0,89 мМ, понцирину — 0,02-0,93 мМ.
Monti зі співавт. [29] вивчали субстратну специфічність a-L-рамнозидаз, ізольованих з різних видів грибів з використанням таких L-рамнозовмісних природних глікозидів, як рутин, гесперидин, нарингін, кверцитрин, гінзенозид та азіатикозид. Результати скринінгу продуцентів a-L-рамнозидази свідчать про їхню різну специфічность. Так, ензим, отриманий з A. aculeatus, характеризувався широкою субстратною специфічністю щодо різних субстратів, зокрема був ефективним стосовно кверцитрину,
Таблиця 2. Субстратна специфічність a-L-рамнозидаз
№ Продуцент Субстрат Тип зв’язку Кт Специфічна активність, од/мл Літера- тура
1 Fagopyrum esculentum п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид 6-О-а-Ь-рамнозил^-глюко- піраноза а-1 а-1,4 0,33 2,2 - 28 28
2 Bacteroides JY-6 п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид Неогесперидин Нарингін Понцирин Гесперидин Рутин Сайкосапонін С а-1 а-1,2 а-1,2 а-1,2 а-1,6 а-1,6 а-1,4 0,29 0,82 0,89 0,93 1,33 1,44 1,6 162,57 190,21 242,67 174,60 109,31 88,12 2,93 46 46 46 46 46 46 46
3 Pseudomonas paucimobi-lis FP2001 Гесперидин Просцилардин А Рутин Нарингін Сайкосапонін С Кверцитрин п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид а-1,6 а-1 а-1,6 а-1,2 а-1,4 а-1 а-1 0,06 0,07 0,13 0,17 0,88 0,89 1,18 0,12 I,48 0,17 0,18 2,52 II,20 92,40 56 56 56 56 56 56 56
4 Fusobacterium K-6 п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид Кверцитрин Гесперидин Нарингін Понцирин Рутин а-1 а-1 а-1,6 а-1,2 а-1,2 а-1,6 0,057 0,077 0,022 0,021 0,020 0,028 3,40 5,00 0,52 0,34 0,35 0,07 47 47 47 47 47 47
5 Clostridium stercorarium п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид Нарингін Гесперидин а-1 а-1,2 а-1,6 - 82 1,5 0,46 50 50 50
6 Bacillus sp. GL1(RhaA і RhaB) п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид Нарингін Гелан а-1 а-1,2 а-1,3 0,1190 0,282 104;79,4 49 49 49
7 Pichia angusta X349 Нарингін Рутин Гесперидин Кверцитрин а-1,2 а-1,6 а-1,6 а-1 - - 45 45 45 45
8 Absidia sp. 20(8)-гінсенозид 20^)-гінсенозид а-1,2 а-1,2 - - 21
9 Aspergillus niger Нарингін а-1,2 1,9 21 31
10 A. aculeatus (RhaA і RhaB) п-Нітрофеніл-а-Ь-рамнозид а-1 0,3 2,8 24,14 34
11 Stagonospora avenae Авенакозид-а-Ь-рамнозид а-1,4 0,091 - 41
який не гідролізували препарати a-L-рамно-зидаз, одержаних з представників тих cамиx видів. Цей факт можна поягаити мінливС-тю штаму або альтернативними умовами культивування. Незважаючи на можливість стеричної перешкоди, через прямий зв’язок a-L-рамнозильного залишку з агліконом, ензими, отримані з Mortierella alpina, Penicillium oxalicum та Talaromyces flavus, були здатні використовувати кверцитрин як cубcтрат, тоді як його гідроліз раніше було відзначено лише у бактеріальних та тваринних a-L-рамнозидаз.
Комплетений глікозид гінзенозид ефективно дерамнозилювали препарати ензимів зі штамів A. aculeatus, E. nidulans, P. oxalicum, хоча раніше [55] встановлено, що лише a-L-рамнозидаза, що її отримали зі штаму Absidia sp. 39, який культивували в пртеут-ності водного екстракту з коренів женьшеню, була здатна гідролізувати гінзенозид.
Терпеновий глікозид азіатикозид фугував cубcтратом для a-L-рамнозидази A. terre-us, E. nidulans, F. oxysporum та ензиму, отриманого вна^ідок його індукції нарингі-ном у T. flavus. Ензимні препарати, одержані з A. aculeatus, A. niger, що переважно гідролізували а-1,2- та а-1,6-глікозидні зв’язки, були активними також щодо азіатикозиду (а-1,4-глікозидний зв’язок).
У деяких випадках препарати a-L-рам-нозидаз, які отримували з одних і тих cамиx продуцентів за культивування їх у пртеут-ності різних індукторів, виявляли різну cуб-стратну отецифічність. Наприклад, препарат, одержаний під чаc вирощування T. flavus CCF 2686 на ceрeдовищі з нарингіном, виявляв широку cубcтратну cпeцифічніcть, тоді як препарат, отриманий у разі вирощування продуцента на ^редовищі з L-рамно-зою, був активним лише стотовно рутину та кверцитрину. a-L-рамнозидази, одержані за культивування з E. nidulans CCF 2912 на ^редовищі з L-рамнозою, геотеридином або нарингіном, також виявляли різну cуб-стратну отецифічність.
Механізм каталітичної дії глікозидаз
Конкретних фактів щодо механізму дії a-L-рамнозидаз вкрай мало, ожільки від-cутні дані щодо хімії та кінетики ензимів із більшості дооліджених джерел. Хоча за аналогією з іншими глікозидазами ймовірно має міоде розщеплення зв’язків між C-атомом рамнози і киотем cубcтратів. Так, встановлено, що відбуваєтьcя розрив зв’язку між атомом кигаю та нередукуючим залиш-
ком оліго- і пол^ахариду, до якого глікози-даза виявляє найбільшу cпeцифічніcть. Відомо, що a-L-рамнозидаза у cубcтратаx діє на ^-О або О-C (для a-L-рамнозидаз n =2, 4, 6) [бб].
Zverlov зі cпівавт. [50] вивчали тип ензимного механізму рамнозидазної реакції, аналізуючи продукти гідролізу п-нітро-феніл-а^-рамнопіранозиду за допомогою 1Н-ЯМР-cпeктроcкопії. У результаті взаємодії cубcтрату та ензиму на cпeктрі визначали пік ß-рамнози, який ідентифікували раніше за а-ізомер. Такий характер кінетичної поведінки визначає механізм гідролізу, за яким ß-рамноза набуває форми а-рамнозиду за рахунок зміщення, стихійно мутаротую-чи в a-форму. Подібний механізм був і в рамногалактуронан-гідролази A. aculeatus, в якій також виявлено інвертування [63].
На цей чаc Снує розвинена Жеребцовим зі отівавт. [64] ідея про ідентичність механізму розщеплення глікозидних зв’язків глікозидазами. Доалідники виходять із принципу орієнтованої стряженої атаки елек-трофільних та нуклеофільних груп на глікозидний зв’язок молекули оліго- або полСахариду. Cуміщeння на поверхні молекули ензиму на близькій відстані великої кількості чітко орієнтованих іонних груп забезпечує умови для багатофункціонального каталізу. Однак у cамому акті каталізу у глікозидаз, як правило, беруть участь дві групи, що утворюють отряжену отстему. Інші групи беруть участь у створенні додаткових зв’язків з активним центром ензиму, необхідних для орієнтації молекули cуб-страту, і зумовлюють отецифічність дії глікозидаз. Каталітично активні групи, які міcтятьcя на різних, але визначених відстанях одна від одної, не тільки зв’язуютьcя з реагуючими групами cубcтрату, але й отри-чинюють отльну поляризуючу дію на ці групи. Cамe такі властивості притаманні карбокгальній та імідазольній групам. Мала величина рКв, незначна теплота іонізації карботеильної групи визначають її Снування у вигляді карботеилат-іону з яжраво вираженими нуклеофільними властивостями. Важлива роль в акті каталізу імідазоль-ної групи зумовлена резонуючою структурою її гетероциклу, здатного діяти як переногаик позитивних та негативних груп. Виходячи з того, що рНоп для багатьох рам-нозидаз має мСце за значень 5,0, рКв кар-бокгальної групи коливаєтьcя в межах 2,2-3,5, рКа імідазольної — 5,5-7,0 (АрК = рКа — рКв « 3,5); у каталітично активній парі карбокгал-імідазол карбокcильна
група міститься у вигляді карбоксилат-іону, а імідазольна — протонованого імідазолію. Пара карбоксил-імідазол утворює систему карбоксилат-імідазолій, яка функціонує за типом кислотно-основного каталізу. Роль електрофільної (протондонорної) групи відводиться імідазолію, тимчасом як карбоксилат-іон виконує функцію нуклеофілу. Під впливом цієї системи у глікозидному зв’язку глікокон’югатів відбувається зміщення електронів від карбоксилат-іону до імідазолію, що й призводить до розщеплення цього зв’язку.
Роль карбоксильної та імідазольної групи показано раніше для a-L-рамнозидази Pénicillium commune [65], а також підтверджено нашими дослідженнями a-L-рамно-зидаз Eupenicillium erubescens [66] та Cryptococcus albidus [67].
Дія рамнозидаз на нередукуючі кінці оліго- або полісахаридів свідчить про те, що ці кінці відіграють важливу роль у механізмі каталізу, виконуючи функцію контактної ділянки у разі утворення комплексу ензим-субстрат з комплементарною контактною ділянкою активного центру глікозидази.
Інгібітори a-L-рамнозидаз
Інтерес до синтетичних інгібіторів a-L-рамнозидаз виник у зв’язку з тим, що було показано здатність деяких сполук такого типу інгібувати глікозидазу, порушуючи
процесинг глікопротеїну вірусу імунодефіциту людини. У низці робіт було описано синтез інгібіторів a-L-рамнозидаз та інших глікозидаз [68-76]. Відомі окремі повідомлення про інгібування a-L-рамнозидаз L-рамнозою, глюкозою, лимонною кислотою і деякими іонами металів (табл. 3) [67-76]. Показано інгібуючий вплив Cu2+, Cd2+, Mg2+ і Mn2+ на активність a-L-рамнозидаз A.nidu-lans [35], A. aculeatus [34], A. niger [36], Sphingomonas sp. R1 [48]; Ba2+ — на S. pauci-mobilis; Hg2+ — на A. terreus, Bacillus sp., C. stercorarium; п-хлормеркурибензоату — на P. angusta, Bacteroides sp., C. stercorarium (табл. 3).
Деякі катіони здатні стимулювати a-L-рамнозидазну активність: Ca2+ — Absidia sp., A. terreus, Bacillus sp., Emericella nidulans, L.plantarum, Sphingomonaspaucimobilis [36, 64]; Co2+ — A. terreus, L.plantarum; Mg2+, Zn2+ — P. ulaiense [77], Absidia sp., A. terreus [55].
Багато ензимів активуються у присутності сполук, що містять сульфгідрильну групу (таких, як цистеїн та глутатіон). Разом з тим відзначають і неспецифічне інгібування ензимів за дії речовин, які утворюють з протеїнами нерозчинні осади або блокують в них SH-групи. Існують також інгібітори, гальмування каталітичних функцій ензимів якими базується на специфічному зв’язуванні цих інгібіторів з певними хімічними групами активного центру [55].
Таблиця 3. Інгібітори а-Ь-рамнозидаз
Мікроорганізм Інгібітори Література
А. aculeatus Rha A Rha B Рамноза Рамноза 34
A. nidulans Рамноза, Mg2+ 35
A. niger Рамноза 36
A. terreus Рамноза, етанол, глюкоза, Hg2+, С^+ 32
Pennicillium sp. Рамноза, глюкоза 29
P. angusta Рамноза, Си2+, Hg2+, п-хлормеркурибензоат 45
Bacillus sp. Rha A Rha B Рамноза, ^2+ Рамноза, Hg2+, Си2+, Fe3+, глюкоза, 6-дезоксиглюкоза 49
Bacteroides sp. Рамноза, фукоза,лимонна кислота, 1,4-лактон, РЬ2+, п-хлормеркурифенілсульфонід 46
C. stercorarium Hg2+, Си2+, Zn2+, SDS, п-хлормеркурибензоат 50
S. paucimobilis Си2+, РЬ2+, Са2+, Zn2+, Ва2+ 48
Thermomicrobia Rha A Rha B Рамноза, глюкоза, етанол Рамноза, глюкоза, етанол, Zn2+ 51
Примітка. Активність в ензиматичному середовищі визначали з використанням як субстрату п-нітрофеніл-а^-рамнопіранозиду.
Встановлено [32, 55], що дитіотрейтол не впливав на активність а^-рамнозидаз у A. terreus, L. plantarum, що дало змогу дійти висновку про незначну роль SH-груп в каталітичній активності.
Структура
а^-рамнозидази належать до глікозидаз з каталітичним доменом у вигляді (а/а)6-барель. Цей тип просторової структури представлений у глікозил-гідролазах трьох кланів: GH-G, GH-L, GH-M. Усі відповідні ензими перетворюють аномерну конфігурацію субстрату. Таку саму просторову структуру мають і глікозидази родин GH9, GH47, GH76, GH78, GH88, GH92, GH94 (раніше GH36), GH95, GH100, GH105 і GH116, а також полісахаридліази з родини PL 10. У класифікації Pfam їм відповідає клан CL0059 [78], а в класифікації С-родин — С6 [79]. За класифікацією SCOP глікозидази цієї групи віднесено до двох суперродин — Six-haîrpin glycosidases і Seven-hairpin gly-cosidases — у складі фолду alpha/alpha toro-
id [80]. Слід відзначити, що каталітичний домен родини GH47 має модифіковану структуру (а/а)7-барель. Філогенетичний аналіз дозволяє виділити чотири групи протеїнів у складі цієї родини [81]. У складі родини GH8 було виділено три підродини [82], GH15 — чотири [83], GH9 — три структурних субкласи рослинних протеїнів [84].
Ітеративний скринінг бази даних амінокислотних послідовностей за допомогою протеїнів родини GH78 дав змогу прослідкувати еволюційні зв’язки з представниками родин GH94, GH63, GH15, GH37, GH95 і GH65 глікозил-гідролаз. Статистично менш достовірні зв’язки вдалось також встановити з протеїнами родин GH92, GH9, GH8 і GH48 [85].
На цей час визначено кристалічну структуру лише однієї a-L-рамнозидази — Rha B Bacillus sp. GL 1 [86]. Молекулярна маса ензиму — 106 кДа, він містить 956 амінокислотних залишків. Структура (рис. 4 a, b) складається з 5 доменів, позначених відповідно N (червоним кольором), D1 (блакитним), D2 (сірим), A (жовтим) і C (синім).
0< _^-СЗф£-'
-КЖЕ
Чафв-гснф«—;osJ>iPl
~I
i> j? Û } Æ| Iі ï1 її s* ,ï
■І L_i" L_r> t_l* L_____y*
Рис. 4. Загальна структура Rha B:
а — вигляд спереду — гомодимерна структура; b — вигляд збоку; c — топологічна діаграма Rha B.
Циліндри — a-спіралі, стрілочки — Р-спіралі; сірі кулі — іони кальцію; зелені палички і червоні кулі — гліцерол. Червоним кольором позначено домен N, блакитним — домен D1, сірим — домен D2, жовтим — домен А, синім — домен C
a
c
Вторинні елементи показано на рис. 4, с. Домени N, D1, D2 і C відповідають Р-сендвіч-структурі, домен А — (a/a^-барель-структу-рі. Третинні структури, подібні до Rha B, виявлено і внесено до банку даних DAL1. Деякі складові структури Rha B подібні до первинної структури фосфорилази хітобіози Vibrio proteoliticus і фосфорилази мальтози Lactobacillus brevis, хоча різниця в первинній структурі цих двох ензимів є дуже суттєвою.
Встановлено [6], що рамноза зв’язується зі щілиною (a/a^-барель домену. Декілька негативно заряджених залишків, таких як Asp567, Glu572, Asp579 і Glu841, зв’язуються з рамнозою. Оскільки RhaB-мутанти за цими залишками радикально знижують ензиматичну активність, це свідчить про їх важливу роль в ензиматичному каталізі та субстратному зв’язуванні.
Практичне використання a-L-рамнозидаз
a-L-рамнозидази можуть бути використані в різних галузях промисловості, зокрема харчовій, фармацевтичній та хімічній.
Головне використання a-L-рамнозидаз у харчовій промисловості спрямовано на поліпшення якості напоїв (зменшення гіркоти, підсилення аромату вин) і виробництво харчових добавок. Біотехнологічні підходи до зменшення гіркоти цитрусових соків базуються на здатності цього ензиму гідролізувати нарингін і лимонін. Нарин-гіназа, яка містить a-L-рамнозидазу і P-D-глюкозидазу, поступово гідролізує нарингін (рис. 2). a-L-рамнозидаза розщеплює нарингін до рамнози і пруніну, а P-D-глюкозида-за — прунін до глюкози і нарингеніну (рис. 2). Гіркота нарингеніну становить лише 1/3 від гіркоти нарингіну, а прунін є менш гірким, ніж нарингінін. Фактично лише перша глі-козидазна активність, а саме a-L-рамнози-дазна, є важливою. Можливість ензиматичного шляху зменшення рівня гіркоти було показано на обох нарингіназах — водорозчинній та іммобілізованій [87-95].
a-L-рамнозидазу застосовують для вивільнення з терпенових глікозидів — рути-нозидів (6-О-a-L-рамнопіранозил-P-D-глю-копіранозидів) — ароматичних сполук, які здатні підсилювати аромат виноградних соків та отриманих з них напоїв [96]. a-L-рамнозидазу широко використовують у процесі виноробства. Однією з важливих характеристик якості вин є ароматичний букет, істотний внесок у створення якого роблять монотерпени, що містяться у винограді частково у вигляді вільних летких форм, а част-
ково — як глікозидзв’язані нелеткі попередники. До їх жладу входять ß-D-глюкопіра-нозиди та диглікозиди, а cамe: 6^-a-L-арабінофуранозил-ß-D-глюкопіранозид і 6-О-a-L-апіофуранозил-ß-D-глюкопірано-зид, які є потенційним джерелом букета в традиційному виноробстві. Глікозидзв’я-зані леткі речовини можна вивільнити дво-стадійним ензимним гідролізом. На першій стадії глікозидний зв’язок розщеплює a-L-рамнозидаза, a-L-арабінофуранозидаза або ß-D-апіозидаза з вивільненням відповідного монотерпеніл^^-глюкозиду, а на другій — ß-D-глюкозидаза вивільняє монотерпенол [55].
Окрім виробництва вин, a-L-рамнозида-зи використовують у процей виготовлення токів, підвищуючи їхні cмакові властивості. Ожільки глікозиди флавоноїдів є більш біо-доступними, ніж їх рутинозиди (глюкоза + рамноза), обидві a-L-рамнозидази A. aculeatus (rhaA і rhaB) застотовують у виробництві функціональних напоїв, у яких збільшено вміст біофлавоноїдів [94]. Інкубування токів з чорної cмородини, апельотнового току з rhaA або rhaB отрияє збільшенню вмісту флавоноїдних рутинозиду і глюкозидів (антоціанінів — у чорній cмородині, флавонів — в апельотновому тоці, флавонолів — у зеленому чаї).
a-L-рамнозидази використовують у виробництві біологічно активних добавок: різних біополімерів і підтолоджувачів [95].
Здатність рамнозидів та їхніх похідних підвищувати імунітет відкрила широке поле для заcтоcування a-L-рамнозидаз у фармацевтичній промиcловоcті [92]. Так, пСля глікозидазної обробки екстракти родини Ruscus aculeatus набувають протизапальної [28] та цитостатичної [56] дії, що уможливлює їх використання для лікування хронічної венозної недостатності [93, 96]. Такі властивості екстрактів зумовлені наявністю стероїдних cапонінів: русину і ружозину та їхніх похідних — деглюкорущину, де-глюкорамнорузцину та деглюкорузкозиду [97, 98].
Встановлено вплив гінзенозиду Rg 1, отриманого з гінзенозиду Re за дії a-L-рамно-зидази, на кількість інcуліновиx рецепторів у мембранах печінки й мозку та на вміст позаклітинного циклічного адeнозинмонофоcфа-ту (цАМФ). Видалення залишків рамнози перетворює гіпенозид 5 на гінтонозид Rd, який запобігає травмам нирок у разі використання протипухлинних препаратів [99].
Хлорополісторини А, В, C та їхні частково деглікозильовані похідні — нові члени родини глікопептидних антибіотиків,
активних проти грампозитивних бактерій, у тому чиалі клінічних ізолятів метицилінре-зистентних Staphylococcus та анаеробних ентеробактерій. Дерамнозильні похідні, отримані обробленням a-L-рамнозидазою, більш активні порівняно з вихідними компонентами [100].
a-L-рамнозидази занотовують для одержання багатьох лікар^ких затобів, а також їх попередників. Ензим гідролізує cапонін діозген з утворенням рамнози і діозгеніну. Оcтанній викориcтовують для отримання отнтетичного прогecтeрону, який входить до жладу гормональних лікарcькиx затобів. Флаванол кверцитин, який утворюєтьcя у процей гідролізу кверцитрину a-L-рамно-зидазою, виявляє антиокотдантні, антикан-церогенні, протизапальні, антиагрегаційні, cудинорозширювальні властивості. Геоте-ритину, який отримано під чаc гідролізу a-L-рамнозидазою геотеридину, притаманні протипухлинні влаcтивоcті [101]. Уна^ідок відщеплення рамнози від рутину утворюєть-cя кверцитин-3-глюкозид, який виявляє антиотеидантну дію. Прунін, дерамнозильо-ваний продукт нарингіну, має протизапальну активність щодо віругаих ДНК/РНК [6]. Показано, що cайкоcапоніни та їхні метаболіти збільшують рівень кортикостероїдів у крові [61].
Уна^ідок дії a-L-рамнозидаз біофлаво-ноїди можуть бути використані як активні інгредієнти коcмeтичниx затобів проти старіння шкіри, у разі вугрового вкипання, при гіпоактивному та гіперактивному станах шкіри та для тонцезахисту. Переваги заcтоcування їх у препаратах по догляду за волотоям, ротовою порожниною, а також як природних та безпечних конторвантів ко^ метичних затобів беззаперечні.
ЛІТЕРАТУРА
1. Ridley B. L., O’Neill M. A., Mohnen D. Pectins: structure, biosynthesis and oligogalacturo-niderelated signaling // Phytochemystry. —
2001. — V. 57, N 6. — P. 929-967.
2. Ueda H., Ogava H. Glycobiology of the Plant
Glycoprotein Epitope: Structure,
Immunogenicity and Allergenicity of Plant Glycotopes II Trends Glycosci. Glycotech. —
1999. — V. 11, N 62. — P. 413-428.
3. Renault J. H., Thepenier P., Zeches-Hanrot M. et al. Preparative separation of anthocyanins by gradient elution centrifugal partition chromatography // J. Chromagr. A. — 1997. — V. 763, N 1. — P. 34б-3б2.
4. Bar-Peled M., Lewinsohn E., Fluhr R. UDP-rhamnose-flavanone-7-O-glucoside-2”-O-rham-
Використання a-L-рамнозидаз у хімічній промиcловоcті пов’язано зі здешевленням виробництва рамнози. Разом з тим a-L-рам-нозидази в останні роки отримують як попередники для індустріального виробництва ароматичних речовин і хіральні компоненти хімічного отнтезу. Ожільки рамноза не отн-тeзуєтьcя як вільний мономер, він має бути одержаний з a-L-рамнозовмСних глікозидів або полСахаридів, однак ця властивість обмежена доступністю дровини. У цьому контексті розвиваєтьcя інтеграція мікро-бних/ензимних процейв для одержання рамноліпідів та L-рамнози з раптової олії [102] і збільшення виходу рамнози з рамно-ліпідів.
Запатентовано процес виробництва чте-тих антоціанідних глікозидів із чорної cмородини і антоціанідних рутинозидів з ізокверцитрину шляхом оброблення a-L-рамнозидазою [103, 104].
Глікозилювання, каталізоване a-L-рам-нозидазами, можна застотовувати як одно -кроковий шлях одержання чистих рамнозидів. Дослідники [105, 106] пропонують ензиматичний отнтез коротких ланцюгів алкіл-a-L-рамнозидів з використанням рамнози або нарингіну як глікозилюючих агентів та водорозчинних отиртів як акцепторів.
Однак на погоди в Україні препарати a-L-рамнозидаз відcутні, а витока вартість комерційних ензимних препаратів іноземного виробництва ^ША) cуттєво гальмує їx використання в промтелових технологіях. З огляду на це пошук нових більш доступних і ефективних джерел витокостецифічних a-L-рамнозидаз та втобічне їx до^ідження є вельми актуальними у науково-теоретичному і практичному аотектах.
nosyltransferase-pyrification and characterization of an enzyme catalyzing the production of bitter compounds in citrus // J. Biol. Chem. — 1991. — V. 226, N 31. — P. 20953-20959.
5. Friedman M., McDonald G. M. Potato glycoal-kaloids: chemistry, analysis, saferty, and plant physiology // Crit. Rev. Plant Sci.-1997.-V. 16, N 8. — P. 55-132.
6. Yadav V., Yadav P. K., Yadav S. et al. a-L-Rhamnosidase: A review // Proc. Biochem. —
2010. — V. 45, N 8. — P. 1226-1235.
7. Ochsner U. A., Fiechter A., Reiser J. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the Pseudomonas aeruginosa rhlAB genes encoding a rhamnosyltransferase involved in rhamnolipid biosurfactant syntesis
// J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269, N 31. — P.19787-19795.
8. Chua J. E. H., Manning P. A., Morona R. The Shigella flexneri bacteriophage Sf6 tailspike protein (TSP)/endorhamnosidase is related to the bacteriophage P22 TSP and has a motif common to exo- and endoglycanases, and C-5 epimerases // Microbiology. — 1999. — V. 145, N 5. — P. 1649-1659.
9. Deng L., Kasper D. L., Krick T. P. et al. Characterization of the linkage between the type III capsular polysaccharide and the bacterial cell wall of group B Streptococcus // J. Biol. Chem. — 2000. — V. 275, N 11. — P. 7497-7504.
10. Mutter M., Beldman G., Schols H. A., Vora-gen A. G. Rhamnogalacturonan a-L-rhamno-pyranohydrolase. A novel enzyme specific for the terminal nonreducing rhamnosyl unit in rhamnogalacturonan regions of pectin // Plant. Physiol. — 1994. — V. 106, N 1. — P. 241-250.
11. Oda Y., Saito K., Ohara-Takada A. et al. Hydrolysis of the potato glycoalkaloid a-cha-conine by filamentous fungu // J. Biosci. Bioeng. — 2002. — V. 94, N 4. — P. 321-325.
12. Deng L., Kasper D. L., Krick T. P. et al. Characterization of the linkage between the type III capsular polysaccharide and the bacterial cell wall of group B Streptococcus // J. Biol. Chem. — 2000. -V. 275, N 11. — P. 7497-7504.
13. Gunata Y. Z., Bayove C. L., Baumes R. L., Cordonnier R. E.The aroma of grapes I. Extraction and determination of free and glycosidically bound fractions of some grape aroma components // J. Cromatogr. — 1985. — V. 331, N 3. — P. 83-90.
14. Benavente G. O., Castillo J., Marin F. R. et al. Uses and properties of Citrus flavonoides // J. Agric Food Chem. — 1997. — V. 45, N 1. — P.4505-4515.
15. Barker S. A., Somers P. J., Stacey M. Arrangement of the L-rhamnose units in Diplococcus pneumoniae type II polysaccharide. // Carbohydr. Res. — 1965. — V. 1. — P. 106-115.
16. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. — 1991. — V. 280, N 2. — P. 309-316.
17. Countinho P. M., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. — 1995. — V. 3, N 9. — P. 853-859.
18. Steinbacher S., Seckler R., Miller S. Crystal structure of P22 tailspike protein: inter-didigitated subunits in a thermostable trimer // Science. — 1994. — V. 265, N 5. — P. 383-386.
19. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. — 1995. — V. 3, N 9 — P. 853-859.
20. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. — 1944. — N 2. — P.375-377.
21. Somogyi M. Notes on sugar determination // Ibid. — 1952. — V. 195, N 1. — P. 19-23.
22. Manzanares P., Orejas M., Ibanez E. et al. Purification and characterization of an alpha-l-rhamnosidase from Aspergillus nidulans // Lett. Appl. Microbiol. — 2000. — V. 31,N 3. — P. 198-202.
23. Romero C., Manjon A., Bastida J., Iborra J. L. A method for assaying rhamnosidase activity of naringinase // Anal. Biochem. — 1985. — V. 149, N 2. — P. 566-571.
24. Davis D. W. Determination of flavonones in citrus juice // Anal. Chem. — 1947. — V. 19, N7 . — P. 46-48.
25. Kurosawa Y., Ikeda K., Egami F. a-L-rham-nosidases of the liver of Turbo cornutus and Aspergillus niger // J. Biochem. — 1973. — V. 73, N 3. — P. 31-37.
26. Qian S., Yu H., Zhang S. Purification and characterization of dioscin — a-L-rhamnosi-dase from pig liver // Chem. Pharm. Bull. — 2005. — V. 53, N 8. — P. 911-914.
27. Locatelli M., Epifano F., Genovese S. Anthraquinone profile, antioxidant and antimicrobial properties of bark extracts of Rhamnus catharticus and R. orbiculatus // Nat. Prod. Commun. — 2011. — V. 6, N 9. — P. 1275-1280.
28. Bourbouse R., Percheron F., Courtois J. E. a-L-rhamnosidases from Fagopyrum esculentum: purification and some properties // Eur. J. Biochem. — 1976. — V. 63, N 2. — P. 331-337.
29. Monti D., Pisvejcova A., Kren V. et al. Generation of an a-L-rhamnosidase library and its application for the selective derham-nosylation of natural products // Biotechnol. Bioeng. — 2004. — V. 87, N 6. — P. 763-771.
30. Shanmugam V., Yadav K. D. S. Extracellular production of a-rhamnosidase by Rhizopus nigricans // Ind. J. Exp. Biol. — 1995.-V. 33, N 9. — P. 705-707.
31. Spagma G., Barbagallo R. N., Martino A et al. A simple method of purifying glycosidase: a-L-rhamnopyranosidases from Aspergillus niger to increase the aroma of Moscato wine // Enzyme Microb. Technol. — 2000. — V. 27, N 7. — P. 522-530.
32. Yadav S., Yadav K. D. S. Immobilization of a-L-rhamnosidase by Aspergillus terreus MTCC-3374 on bagasse particles based matrix // Indian. J. Chem. Technol. — 2001. — V. 8. — P. 314-318.
33. Yadav S., Yadav K. D. S. Secretion of a-L-rhamnosidases by some indigenous fungal strains // J. Sci. Ind. Res. — 2004. — V. 63. — P. 439-443.
34. Manzanares P., Broeck H. C. V., Graaff L. H. D., Visser J. Purification and characterization of two different a-L-rhamnosidases, RhaA and RhaB from Aspergillus aculeatus // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. — V. 67, N 5. — P. 2230-2234.
35. Orejas M., Ibanez E., Ramon D. The filamentous fungus Aspergillus nidulans produces an a-L-rhamnosidase of potential oenological interest // Lett. Appl. Microbiol. — 1999. — V. 28, N 5. — P. 383-388.
36. Shanmugaprakash M., Kumar V. V., Hemala-tha M. et al. Solid-state fermentation for the production of debittering enzyme naringi-nase using Aspergillus niger MTCC 1344 // Eng. Life Sci. — 2011. — V. 11, N 3. — P. 322-325.
37. Koseki T., Mese Y., Nishibori N. et al. Characterization of an a-L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2008. — V. 80, N 6. — P. 1007-1013.
38. FengB., Hu W., Ma B. P. et al. Purification, characterization, and substrate specificity of a glucoamylase with steroidal saponin-rham-nosidase activity from Curvularia lunata // Ibid. — 2007. — V. 76, N 6. — P. 1329-1338.
39. Scaroni E., Cuevas C., Carrillo L. et al. Hydrolytic properties of crude alpha-l-rham-nosidases produced by several wild strains of mesophilic fungi // Lett. Appl. Microbiol. — 2002. — V. 34, N 6. — P. 461-465.
40. Kaji A., Ichimi T. alpha-l-Rhamnosidase activity in culture filtrate of Corticium rolf-sii. Enzymatic activity at low pH // Agric. Biol. Chem. — 1973. — V. 37, N 2. — P. 431-432.
41. Morrissey J. P., Wubben J. P., Osbourn A. E. Stagonospora avenae secretes multiple enzymes that hydrolyze oat leaf saponins // Mol. Plant. Microbe Interact. — 2000. — V. 13, N 10. — P. 1041-1052.
42. Yu H., Gong J., Zhang C. et al. Purification and characterization of ginsenoside-a-L-rhamnosidase // Chem. Pharm. Bull. —
2002. — V. 50, N 2. — P. 175-178.
43. Temme H., Dethloff O., Pitner W. R. et al. Identification of suitable ionic liquids for application in the enzymatic hydrolysis of rutin by an automated screening // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2012. — V. 93, N 6. — P. 2301-2308.
44. McMahon H., Zoecklein B. W., Fugelsang K. et al. Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 1999. — V. 23, N 3. — P. 198-203.
45. Yanai T., Sato M. Purification and Characte-ri zation of a-L-rhamnosidases from Pichia angusta X349 // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2000. — V. 64, N 10. — P. 2179-2185.
46. Jang I. S., Kim D. H. Purification and characterization of alpha-l-rhamnosidase from Bacteroides JY-6, a human intestinal bacterium // Biol. Pharm. Bull. — 1996. — V. 19, N 1. — P.1546-1549.
47. Park S. Y., Bae E. A., Sung J. H. et al. Purification and characterization of gin-senoside Rb1-metabolizing beta-glucosidase from Fusobacterium K-60, a human intestinal anaerobic bacterium // Biosci. Biotech-nol. Biochem. — 2001. — V. 65, N 5. — P.1163-1169.
48. Hashimoto W., Murata K. alpha-L-rhamnosi-dase of Sphingomonas sp. R1 producing an unusual exopolysaccharide of sphingan // Ibid. — 1998. — V. 62, N 6. — P. 1068-1074.
49. Hashimoto W., Nankai H., Sato N. et al. Characterization of a-L-rhamnosidase of Bacillus sp. GL1 responsible for the complete depolymerization of gellan // Arch. Biochem. Biophys. — 1999. — V. 368, N 1. — P. 56-60.
50. Zverlov V. V., Hertel C., Bronnenmeier K. et al. The thermostable alpha-L-rhamnosidase RamA of Clostridium stercorarium: bioche -mical characterization and primary structure of a bacterial alpha-L-rhamnoside hydrolase, a new type of inverting glycoside hydrolase // Mol. Microbiol. — 2000. — V. 35,N 1.— P. 173-179.
51. Birgisson H., Hreggvidsson G. O., Fridjons-son O. H. et al. Two new thermostable a-L-rhamnosidases from a novel thermophilic bacterium // Enzyme Microb. Technol. — 2004. — V. 34, N 6. — P. 561-571.
52. Orrillo A. G., Ledesma P., Delgado O. D. et al. Cold-active a-L-rhamnosidase from psycho -tolerant bacteria isolated from a sub-Antarctic ecosystem // Ibid. — 2007. — V. 40, N 2. — P. 236-241.
53. Beekwilder J., Marcozzi D., Vecchi S. et al. Characterization of rhamnosidases from Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus // Appl. Environ. Microbiol. — 2009. — V. 75, N 11. — P. 3447-3454.
54. Avila M., Jaquet M., Moine D. et al. Physiological and biochemical characterization of the two a-l-rhamnosidases of Lacto -bacillus plantarum NCC245 // Microbiology. —
2009. — V. 155. — P. 2739-2749.
55. Варбанець Л.Д., Борзова Н. В. Глікозидази мікроорганізмів і методи їх дослідження. — К.: Наук. думка, 2010. — 437 с.
56. Miake F., Satho T., Takesue H. et al. Purification and characterization of intracellular alpha-l-rhamnosidase from Pseudomonas paucimobilis FP2001 // Arch. Microbiol. —
2000. — V. 173, N 1. — P. 65-70.
57. Mutter M., Beldman G., Schols H. A. et al. Rhamnogalacturonan a-l-rhamnopyranohy-drolase // Plant. Physiol. — 1994. — V. 117, N 1.— P. 153-163.
58. Eliades L. A., Rojas N.L., Cabello M. N. et al. a-L-Rhamnosidase and ß-D-glucosidase activities in fungal strains isolated from alkaline soils and their potential in naringin hydrolysis // J. Basic Microbiology. — 2011. — V. б1, N 6. — P. 6б9-66б.
59. Yadav V., Yadav S., Yadava S. et al. a-l-Rhamnosidase from Aspergillus flavus MTCC-9606 isolated from lemon fruit peel // Int. J. Food Sci. Technol. — 2011. — V. 46, N 2. — P. 350-357.
60. Yadav S., Yadav V., Yadav S. et al. Purification, characterisation and application of a-l-rhamnosidase from Penicillium citrinum MTCC-8897 // Ibid. — 2012. — V. 47, N 2. — P. 290-298.
61. Manzanares P., Valles S., Ramon D., Orejas M. a-L-rhamnosidase: old and new insights / Industrial Enzymes. — Springer, 2007. — Р. 117-140.
62. Hashimoto W., Miyake O., Nankai H. et al. Molecular identification of an alpha-L-rham-nosidase from Bacillus sp. strain GL1 as an enzyme involved in complete metabolism of gellan // Arch. Biochem. Biophys. — 2003. — V. 41б, N 2. — P. 23б-244.
63. Pitson S. M., Mutter M., Broek L. A. V. et al. Stereochemical course of hydrolysis catalysed by a-l-rhamnosyl and ß-d-galacturono-syl hydrolases from Aspergillus aculeatus II Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1998. — V. 242, N 3. — P. бб2-бб9.
64. Жєрє6цов H. А., KopHeeBa О. С., Tepmbi4-Haя Т. H. О механизме каталитичеекого действия карбогидраз // Прикл. биохим. микро-биол. — 1999. — Т. 32, № 2. — C. 123-132.
65. Pзaєвa О. М., Бopзoвa H. В., Bapбaнeць Л. Д. Доcліджeння функціональних груп a-L-рамнозидаз P. commune 266 // Укр. біохім. журн. — 2008. — Т. 80, № 6. — C. 42-51.
66. Гудзeнкo О. В., Бopзoвa H. В., Bapбaнeць Л. Д. Влияние ионов металлов и cпeцифичecкиx xимичecкиx реагентов на активноcть a-L-рамнозидазы Eupenicillium erubescens II Там же. — 2012. — Т. 80, № 2. — C. 30-41.
67. Гудзeнкo О. В., Bapбaнeць Л. Д. Доcліджeн-ня функціональних груп a-L-рамнозидази Cryptococcus albidus // Мікробіол. журн. — 2012. — Т. 74, № 4. — C. 19-28.
68. Puri M., Banerjee A., Banerjee U. C. Optimization of process parameters for the production of naringinase by Aspergillus niger MTCC-1344 // Proc. Biochem. — 2005. — V. 40, N 1. — P. 19б-201.
69. Washiyama S., Kamiya A., Esaki S. et al. Synthesis of 1-deoxy-l-rhamnojirimycin and its inhibitory action against a-l-rhamnosi-dase // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1993. — V. б7, N б. — P. 847-849.
70. Davis B. G., Brandstetter T. W., Smith C. et al. Tetrazoles of manno- and rhamno-fura-
noses // Tetrahedron Lett. — 1995. — V. 36, N 41. — P.7507-7510.
71. Shilvock J. P., Wheatley J. R, Davis B. et al. Inhibition of naringinase (l-rhamnosidase) by piperidine analogues of l-rhamnose: scaffolds for libraries incorporating trihydroxy-pipecolic acids // Ibid. — 1996. — V. 37, N 47. — P. 8569-8572.
72. Davis B. G., Hull A., Smith C. et al. 5-epi-Deoxyrhamnojirimycin is a potent inhibitor of an a-l-rhamnosidase: 5-epi-deoxymanno-jirimycin is not a potent inhibitor of an P-d-mannosidase // Tetrahedron: Asymmetry. — 1998. — V. 9. — P. 2947-2960.
73. Davis B. G., Brandstetter T. W., Hackett L. et al. Tetrazoles of manno- and rhamno-pyra-noses: contrasting inhibition of mannosida-ses by [4.3.0] but of rhamnosidases by [3.3.0] bicyclic tetrazoles // Tetrahedron. — 1999. — V. 55, N 14. — P. 4489-500.
74. Kim J. H., Curtis-LongM. J., Seo W. D. et al. Alpha-rhamnosidase inhibitory activities of polyhydroxylated pyrrolidine // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 2005. — V. 15, N 19. — P. 4282-4285.
75. Hakansson A. E., Ameijde J., Guglielmini L.
et al. Looking glass inhibitors: synthesis of a potent naringinase inhibitor l-DIM [1,4-dideoxy-1,4-imino-l-mannitol], the enan-tiomer of DIM [1,4-dideoxy-1,4-imino-d-mannitol] a potent a-d-mannosidase
inhibitor // Tetrahedron: Asymmetry. —
2007. — V. 18, N 2. — P. 282-289.
76. Hakansson A. E., Ameijde J., Horne G. et al. Synthesis of the naringinase inhibitors l-swainsonine and related 6-Cmethyl-l-swain-sonine analogues: (6R)-C-methyl-l-swainso-nine is a more potent inhibitor of
l-rhamnosidase by an order of magnitude than lswainsonine // Tetrahedron Lett. —
2008. — V. 49, N 1. — P. 179-184.
77. Rajal V., Cid A., Ellenrieder G. et al. Production, partial purification and characterization of a-L-rhamnosidase from Peni cil -lium ulaiense // Chemistry and materials science. — 2009. — V. 25, N 6. — P. 1025-1033.
78. Finn R. D., Mistry J., Tate J. et al. // Nucl. Acids Res. — 2010. — V. 38. — Р. 211-222.
79. Ryka P., Czanik P., Ponyi T., Fulop L. Structural classification of glycosyl ydro-lases // Bul. Szent ^^6п University — Godoll. — 2008. — V. 1. — Р. 5-10.
80. Andreeva A., Howorth D., Chandonia J. M. et al. Data growth and its impact on the SCOP database: new developments // Nucl. Acids Res. — 2008. — V. 36. — P. 419-425.
81. Jordan I. K., Bishop G. R. Gonzalez D. S. Sequence and structural aspects of functional diversification in class I alpha-mannosi-dase evolution // Bioinformatics. — 2001. — V. 17. — P.965-976.
82. Adachi W., Sakihama Y., Shimizu S. et al. Crystal structure of family GH-8 chitosanase with subclass II specificity from Bacillus sp. K17 // J. Mol. Biol. — 2004. — V. 343, N 3. — P. 785-795.
83. Stam M. Evolution et prediction des activités des glycoside hydrolases. Ph.D. thesis, Universite Aix_Marseille 1,Marseille, France. — 2006. (www.sfbi.fr/Theses/ 2006_Stam_Mark.pdf).
84. Urbanowicz B. R., Bennett A B., Del Campillo E. et al. Structural organization and a standardized nomenclature for plant endo-1,4-beta-glucanases (cellulases) of glycosyl hydrolase family 9 // Plant Physiol. — 2007. — V. 144, N 4. — P. 1693-1696.
86. Наумов Д. Г. Иерархическая классификация гликозил-гидролаз // Биохимия. —
2011. — Т. 76, Вып. 6. — С. 764-780.
87. Cui Z., Maruyama Y., Mikami B. et al. Crystal structure of glycoside hydrolase family 78 a-l-rhamnosidase from Bacillus sp. GL1 // J. Mol. Biol. — 2007. — V. 374, N 2. — P. 384-398.
88. Norouzian D. Enzyme immobilization: the state of art in biotechnology // Iranian J. Bio-tecnol. — 2003. — V. 1, N 4. — P. 197-206.
89. Yadav S., Yadav V., Yadav Y. et al. Purification, characterization and application of a-l-rhamnosidase from Penicillium citrinum MTCC-8897 // Int. J. Food Sci. Technol. —
2012. — V. 47, N 2. — P. 290-298.
90. Hui N., Chen F., Cai H. Characterization and preparation of Aspergillus niger Naringinase for Debittering Citrus Juice // J. Food Science. — 2012. — V. 77, N 1. — P.C1-C7.
91. Vila-Real H., Alfaia A. J., Rosa J. N. et al. a-Rhamnosidase and -glucosidase expressed by naringinase immobilized on new ionic liquid sol-gel matrices: Activity and stability studies // J. Biotechnol. — 2011. — V. 152, N 4. — P. 147-158.
92. Nunes M. A., Vila-Real H., Fernandes P. C. et al. Immobilization of naringinase in PVA-alginate matrix using an innovative technique // Appl. Biochem. Biotechnol. —
2010. — V. 160, N 7. — P. 2129-2147.
93. Soria F., Ellenrieder G., Oliveira G. B. a-L-Rhamnosidase of Aspergillus terreus immobilized on ferromagnetic supports // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2012. — V. 93, N 3. — P. 1127-1134.
94. Del Nobile M. A., Piergovanni L. Naringinase immobilisation in polymeric films intended for food packaging applications // J. Food Sci. — 2003. — V. 68, N 6. — P. 2046-2049.
95. Gonzdez-Barrio R., Trindade L. M., Manzanares P. et al. Production of bioavailable flavonoid glucosides in fruit juices and green tea by use of fungal alpha-L-rhamnosidases
// J. Agric. Food. Chem. — 2004. — V. 52, N 20. — P. 6136-6142.
96. Giavasis I., Harvey L. M., Mc Neil B. Gellan gum // Crit. Rev. Biotech. — 2000. — V. 20, N 3. — P. 177-211.
97. Chen Y. C., ShenS. C., Lin H. Y. Rutinoside at C7 attenuates the apoptosis-inducing activity of flavonoids // Biochem. Pharmacol. —
2003. — V. 66, N 7. — P. 1139-1150.
98. Boyle P., Diehm C., Robertson C. Meta-analysis of clinical trials of Cyclo 3 Fort in the treartment of chronic venous insufficiency // Int. Angiol. — 2003. — V. 22, N 3. — P. 250-262.
99. Di Lazzaro A., Morana A., Schiraldi C. An enzymatic process for the production of the pharmacologically active glycoside desglu-codesramnoruscin from Ruscus aculeatus // L. J. Mol. Catal. B. Enzym. — 2001. — V. 11. — P. 307-314.
100. Yokozawa T., Owada S. Effect of ginseno-side Rd in cephaloride-induced renal disorder // Nephron. — 1999. — V. 81, N 2. — P. 200-207.
101. Tacatsu T., Takahashi S., Tacamatsu Y. et. al. Cloropolysporins A, B, and C, novel gly-copeptide antibiotics from Faenia interjec-ta p. Nov. IV. Partially deglycosylated derivatives // J. Antibiot. (Tokyo). — 1987. — V. 40, N 7. — P. 941-945.
102. Erlund I. Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and naringenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailability, and epidemiology // Nutr. Res. — 2004. — V. 24, N 10. — P. 851-874.
103. Trumler K., Effenberger F., Syldatk C. An integrated microbiol/enzymatic process for production of rhamnolipids and L-(+)-rhamnose from rapeseed oil with Pseudo -monas sp., DSM 2847// Eur. J. Lipid Sci. Technol. — 2003. — V. 105, N 10. — P. 563-571.
104. Patent Number WO200222847-A. Enzy-matyc production of purified antocyanins and crystalline products from natural resources, for use in (functional) foods, beverages, drugs and cosmetics / Matsumoto H., Hanamura S., Hirayama M. — 2002.
105. Patent Number WO2004027074-A2. Iso-quercitrin-enriched composition prepared by inccubating solution having rutin after adding naringinase, terminating the incubation, the proportion of isoquercitrin in composition being controlled by adjusting duration of incubation / Chang P. R., Muir A. — 2004.
106. Martearena M. R., Blanco S., Ellenrieder G. Syntesis of alkyl-a-L-rhamnosides by water soluble alcohols enzymatic glycosylation // Biores. Technol. — 2003. — V. 90, N 3. — P. 297-303.
2б
МИКРОБНЫЕ a-L-РАМНОЗИДАЗЫ: ПРОДУЦЕНТЫ, СВОЙСТВА, ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Е. В. Гудзенко, Л. Д. Варбанец
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Обзор поcвящeн a-L-рамнозидазам, которые гидролитичecки отщепляют концевые нeвоccтановлeнныe a-1,2-, a-1,4- и a-1,6-cвя-занные оcтатки L-рамнозы в a-L-рамнозидах. Раеемотрeны методы определения a-L-рамно-зидазной активноети c помощью как природных, так и еинтетичееких еубетратов. Эти энзимы найдены в раетениях, у животных, дрожжей, грибов и бактерий. Показано, что наиболее активными биоеинтетиками являют-ея микромицеты. Опиеаны методы выделения и очиетки a-L-рамнозидаз микробного про-иехождения, которые включают оеаждение энзима е раетворов органичеекими раетворите-лями и нейтральными еолями, диализ, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, ионообменную и афинную хроматографию. Обобщены данные о физико-химичееких евойетвах (рН-оптимуме, термооптимуме, молекулярной маеее), еубетратной епецифичноети a-L-рам-нозидаз. Уетановлено, что энзимные препараты, полученные от одних и тех же продуцентов при культивировании в приеутетвии различных индукторов, проявляли разную еубетрат-ную епецифичноеть. Показано, что a-L-рамнози-дазы отноеятея к гликозил-гидролазам е каталитичееким доменом (a/a^-барель.
Биотехнологичеекие евойетва энзима направлены на иепользование в пищевой, фармацев-тичеекой и химичеекой промышленноети. В пищевой промышленноети a-L-рамнозидазы применяют для улучшения качеетва напитков (уменьшения горечи, уеиления аромата вин) и производетве пищевых добавок, в фармацев-тичеекой — для получения многих лекарет-венных препаратов, а также их предшеетвен-ников, в химичеекой — в качеетве предшеетвенников для производетва рамнозы.
Ключевые слова: a-L-рамнозидаза, продуценты микробного проиехождения, физико-химичеекие евойетва, еубетратная епецифич -ноеть, практичеекое иепользование.
MICROBIAL a-L-RHAMNOSIDASES: PRODUCERS, PROPERTIES AND PRACTICAL USE
O. V. Gudzenko, L. D. Varbanets
Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
The review is concern with a-L-rhamnosida-ses that hydrolytically cleave the terminal unrecovered a-1, 2-, a-1, 4- and a-1, 6-linked rham-nose residues in a-L-rhamnosides. It was considered the methods of determination of a-L-rhamnosidase activity both with natural and synthetic substrates. These enzymes were found in plants, animals, yeasts, fungi and bacteria. It was shown that the most active biosynthetics are micromycetes. Methods of extraction and purification of a-L-rhamnosidases of microbial origin, which include the precipitation of enzyme from solutions by organic solvents and neutral salts, dialysis, ultrafiltration, gel-filtration and ionexchange chromatography on columns are described. The data of physical and chemical properties (thermal and pH optima and molecular weight), substrate specificity of a-L-rham-nosidases were generalized. Enzymatic preparations that were obtained from the same producer during cultivation at the presence of different inductors showed different substrate specificity. a-L-Rhamnosidases refer to glycosyl-hydrolases with catalytic domen (a/a)6-barrel. Biotechnological properties of enzyme are directed to usage in food, pharmaceutical and chemical industries. In food industries, a-L-rhamnosidases are used for increasing of drinks quality (lowering of bitterness and improvement of wine aroma) and production of food additives. In pharmaceutical industry a-L-rhamnosidases could be used for obtaining of drugs and their precursors. In chemical one — as precusor for rhamnose production.
Key words: a-L-rhamnosidase, producers of microbial origin, physical and chemical properties, substrate specificity, industrial application.
