CC BY
70
УДК 579.873.083.13
А. В. Барков (с.н.с., к.вт.н.)1,2, М. И. Леонтьева (м.н.с.)2, Е. А. Некрасова (ст. инж.)1, А. В. Савин (инж.)1, А. В. Коканина (асп., м.н.с.)1, Л. М. Краснопольская (д.б.н., зав.лаб. )1,2
Микобиотехнологический метод утилизации отходов производства биоэтанола
1 Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119331, г. Москва, Ленинский пр., 65; тел. (499) 2339589, e-mail: bta@rbcmail.ru 2 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биосинтеза биологически активных соединений 19021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; тел. (499) 2552391, e-mail: labbas@yandex.ru
A. V. Barkov 12, M. I. Leonteva2, E. A. Nekrasova1, A. V. Savin1, A. V. Kokanina1, L. M. Krasnopolskaya1,2
Mycobiotechnological method of ethanol production waste utilization
1 Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii pr, 119331, Moscow, Russia; рЬ. (499) 2339589, e-mail: bta@rbcmail.ru 2 Gauze Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences 11, Bo'shaya Pirogovskaya Str., 119992 Moscow, Russia; рЬ. (499) 2552391, e-mail: labbas@yandex.ru
Разработаны составы питательных сред на основе отходов производства биоэтанола для биотехнологии культивирования лекарственного бази-диомицета Ganoderma lucidum. Питательные среды использованы для твердофазного и погруженного культивирования гриба. Выход погруженной биомассы гриба в результате 4-дневного погруженного культивирования на разработанных жидких средах варьировал в диапазоне 19.1—25.8 г/л культуральной жидкости, минимальное значение конечного рН культурального фильтрата составляло 5.8, максимальное — 7.1. Содержание эндополисахари-дов в погруженном мицелии G. lucidum варьировало в пределах 8.24—11.53 %, их выход составлял 2.1—2.4 г/л культуральной жидкости.
Ключевые слова: биомасса; Ganoderma lucidum; культивирование; отходы производства биоэтанола; полисахариды; спиртовая барда.
The compositions of nutrient media, based on the ethanol production waste, were developed for the biotechnological purpose of medicinal basidiomycetes Ganoderma lucidum cultivation. The media were used successfully for solid state and submerged cultivation of fungus. The submerged biomass yield of 19.1—25.8 g/l in 4 days was achieved, minimum pH value of culture media was 5.8, maximum — 7.1. The biomass obtained on liquid media content 8.24—11.53 % of endopolysaccharides, the endopolysaccharides production was 2.1—2.4 g/l.
Key words: biomass; Ganoderma lucidum; cultivation; ethanol production waste; polysaccharides; distillery stillage.
Биотехнологии погруженного культивирования лекарственных базидиальных грибов позволяют получать биологически активные метаболиты этих продуцентов для их дальнейшего использования в фармакологической и пищевой промышленности. Лекарственные базидиомицеты способны синтезировать соединения с иммуномодулирующими, противоопу-
Дата поступления 20.05.10
холевыми, противовирусными, антибактериальными, антипаразитарными, гиполипидеми-ческими, гипогликемическими, антиоксидант-ными, противовоспалительными и другими свойствами 1,2.
Одним из наиболее известных лекарственных базидиальных грибов благодаря широте спектра биологических свойств и выраженности биологической активности является трутовик лакированный Ganoderma lucidum
(Curt.:Fr.) P. Karst., который способен проявлять все вышеперечисленные биологические свойства. Метаболиты G. lucidum, ответственные за реализацию этих свойств, представлены преимущественно тритерпенами и полисахари-дами3'4'5'6. Обладая широкими ферментативными способностями, трутовик лакированный способен использовать для своего роста и развития различные по химической природе органические соединения углерода и азота. Для погруженного культивирования G. lucidum разработаны различные жидкие питательные среды, в том числе на основе таких отходов, как молочная сыворотка, спиртовая барда7'5. Выход биомассы G. lucidum на разбавленной спиртовой барде при значении рН 5 составил 7.5 г/л культуральной жидкости, дополнительное внесение источников углерода повысило выход до 12.7 г/л 8.
Научно обоснованное включение в состав жидких питательных сред для культивирования лекарственных базидиомицетов отходов пищевой промышленности, сельского хозяйства и др. позволяет одновременно решать две важные задачи: обеспечение ряда отраслей промышленности биологически активными метаболитами и улучшение экологической ситуации.
Сложную экологическую задачу представляет собой утилизация спиртовой барды — отхода производства этанола. В Федеральном законе РФ № 102-ФЗ от 21.07.2005 указано: «Производство этилового спирта, технологией производства которого предусматривается получение барды (основного отхода производства), допускается только при условии ее полной переработки и (или) утилизации на очистных сооружениях». Это означает, что полная переработка барды и (или) ее утилизация является составной частью технологии переработки зерна на спирт. Свежая спиртовая барда представляет собой водную суспензию с небольшим количеством растворенных и взвешенных сухих веществ. В ней содержится 5— 8.5 % сухих веществ, из которых 3—4 % составляют растворенные вещества, а остальное — нерастворимые взвешенные частицы, рН жидкой фазы — 4.6—5.2. Выход барды составляет около 13 л на каждый л произведенного спирта. Благодаря содержанию углеводов, белка и микроэлементов, барда представляет собой вторичный сырьевой ресурс 9. В настоящее время существует четыре основных пути переработки спиртовой барды: производство на ее основе кормов для сельскохозяйственных животных, получение удобрений для улучшения
плодородия почвы в биологическом земледелии, получение биогаза и введение в состав строительных материалов в качестве пластификатора 10,11,12,13. Так как жидкая барда имеет короткий срок хранения, многие из способов переработки спиртовой барды включают способы ее сушки с возможной последующей грануляцией.
Цель настоящей работы состояла в создании биотехнологического метода утилизации спиртовой барды путем разработки рецептур питательных сред для культивирования лекарственного базидиального гриба трутовика лакированного G. lucidum.
Спиртовая барда была получена на ОАО «Кристалл» (г. Кашира). Ее показатели приведены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели качества спиртовой барды
Показатель Значение
Сухие вещества 6.08-8.04
Белки 1.7-2.4
Жиры 0.4-0.6
Клетчатка 0.9-1.7
Зола 0.4-0.6
Безазотистые 3.1-3.3
экстрактивные вещества
рН 3.9
Р20 4.4-4.9
Подготовка спиртовой барды. Спиртовую барду разделяли на жидкую и твердую фазы фильтрованием. Твердую фазу — зерновую дробину сушили при температуре 60 оС .
Объект исследования. В работе использовали культуру G. lucidum коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН.
Хранение культуры. Для хранения культуры G. lucidum использовали картофельно-глюкозный агар. Культуру выращивали на данной среде при 25 оС в течение 7 сут и далее хранили в темноте при температуре 4 оС. Пересевы на свежеприготовленную среду осуществляли один раз в год.
Для вегетативного размножения использовали среды на основе зерновой дробины (табл. 2). К ингредиентам сред добавляли водопроводную воду из расчета 280 мл на 100 г.
Среды стерилизовали при 1.2 атм. в течение 40 мин. Выращивание проводили в чашках Петри в темноте при 25 оС в течение 10 сут.
Составы сред для вегетативного размножения G. lucidum
Таблица 2
Среда, № Ингредиенты
Основа среды Дополнительный компонент
1 Зерновая дробина -
2 Зерновая дробина Мел, 2 вес.%
3 Зерновая дробина Подсолнечный жмых, 30 вес.%
Таблица 3
Составы сред для погруженного культивирования G. lucidum
Ингредиенты Среда, №
4 5 6
Зерновая дробина 20 г/л 20 г/л 20 г/л
Отход сахарного производства, источник углерода - 6 г/л 10 г/л
Отход пищевой промышленности, источник азота - 2 г/л 3.3 г/л
№N03 - 0.2 г/л 0.33 г/л
КНРО4 - 0.5 г/л 0.83 г/л
МдЭОд - 0.05 г/л 0.08 г/л
Мел 0.5 г/л 0.5 г/л 0.5 г/л
Жидкая фаза спиртовой барды до 1 л до 1 л до 1 л
Культуры использовали для засева жидких посевных сред из расчета 1 чашка Петри на 8 колб.
Погруженное культивирование осуществляли в колбах на ротационной качалке Infors-HT при 200 об./мин, температуре 25 оС в течение 4 сут. Процесс погруженного культивирования проводили в два этапа. Жидкий посевной материал выращивали по ранее описанному способу 14. В качестве производственной среды использовали среды на основе спиртовой барды, приведенные в таблице 3. Среды стерилизовали при 1.2 атм в течение 40 мин.
Процесс погруженного культивирования вели в течение 4-х суток. По его окончании определяли весовым методом содержание воздушно-сухой биомассы гриба (влажность 6%), предварительно отфильтрованной и высушенной при температуре 40 оС. Потенциометри-чески определяли рН культурального фильтрата с помощью универсального иономера ЭВ-74.
Микроморфологию погруженного мицелия G. lucidum изучали с использованием микроскопа Olympus CX 41 и временных препаратов мицелия гриба.
Содержание углеводов в биомассе G. lucidum определяли с помощью фенол-сернокислотного метода 15. Определение проводили в 9-кратной повторности.
Результаты и обсуждение
Рост G. lucidum на средах на основе зерновой дробины. На твердофазных средах на основе зерновой дробины использованный штамм G. lucidum формировал колонии белого цвета с хорошо развитым воздушным мицелием и войлочной текстурой колоний. На среде, содержащей зерновую дробину и подсолнечный жмых, был отмечен двухфазный характер роста, при котором формированию плотного воздушного мицелия предшествовала стадия образования тонкого паутинистого мицелия. Наиболее низкая скорость линейного роста была отмечена на среде с зерновой дробиной без каких-либо добавок (рис. 1). Дополнительное внесение мела (рис. 2) или подсолнечного жмыха (рис. 3) ускоряло рост гриба. Диаметр 10-дневных колоний G. lucidum приведен в табл. 4.
Таблица 4
Диаметр 10-дневных колоний G. lucidum на средах на основе зерновой дробины
Среда, № Диаметр колонии, мм
1 6.2
2 7.3
3 7.3
Рис. 1. Поверхностный рост G. lucidum. на зерновой дробине без добавок: 1 — 5 сут культивирования, 2 — 10 сут культивирования.
Рис. 2. Поверхностный рост G. lucidum. на зерновой дробине с добавлением мела: 1 — 5 сут культивирования, 2 — 10 сут культивирования.
Рост G. lucidum в погруженной культуре на средах на основе спиртовой барды. Разработка жидкой питательной среды для конкретного штамма гриба-продуцента представляет собой основу создания микобиотехнологи-ческого метода получения целевого продукта. При использовании в качестве продуцента лекарственного базидиомицета G. lucidum таким целевым продуктом может служить биологически активная биомасса гриба, комплекс биологически активных метаболитов или индивидуальное соединение.
Исходный рН использованной в настоящей работы спиртовой барды составлял 3.9.
Для создания более пригодных для культивирования G. lucidum условий во все среды был внесен мел, что привело к сдвигу значения рН в щелочную среду. Значения рН жидких питательных сред, подготовленных в соответствии с таблицей 3, до стерилизации варьировали в диапазоне 4.8—5.0 Стерилизация сред приводила к дополнительному повышению рН до 5.3.
В погруженной культуре на всех исследованных средах на основе спиртовой барды использованный штамм G. lucidum рос в виде мелких округлых пеллет. Полученные результаты опыта приведены в табл. 5. Выход воздушно-сухой биомассы G. lucidum на исследо-
Рис. 3. Поверхностный рост G. lucidum. на зерновой дробине с добавлением жмыха: 1 — 5 сут культивирования, 2 — 10 сут культивирования.
ванных средах на основе спиртовой барды колебался от 19.1 до 25.8 г/л. Наиболее высокий рН культурального фильтрата был отмечен в результате культивирования гриба на среде № 4. Конечный рН культуральной среды был ниже при выращивании G. lucidum на среде 4, в которую, в отличие от сред 5, 6, не были внесены дополнительные источники углерода и азота.
Таблица 5
Выход воздушно-сухой биомассы G. lucidum при погруженном культивировании на средах на основе спиртовой барды
Среда, № Выход воздушно-сухой биомассы, г/л рН культуральной среды
4 19.1 7.1
5 25.8 5.8
6 24.0 5.9
Исследование погруженного мицелия G. lucidum методом световой микроскопии показало, что при росте на средах, содержащих в своей основе спиртовую барду, мицелий гриба состоит из ветвящихся толстостенных и тонкостенных гиф с регулярными перегородками и пряжками. Пряжки являются характерным микроморфологическим признаком базидиаль-ных грибов, связанным с дикариотичностью этих организмов, и представляют собой небольшие дугообразной формы образования, расположенные у поперечной перегородки гифы и соединяющие две ее клетки. Их наличие можно рассматривать в качестве одного из критериев чистоты культуры.
Ранее было показано, что полисахариды погруженного мицелия использованного в настоящей работе штамма G. lucidum обладают значительной биологической активностью16. В связи с этим было целесообразно определить содержание эндополисахаридов в погруженном мицелии G. lucidum, полученном при культивировании на средах на основе спиртовой барды.
Исследование, проведенное с помощью фенол-сернокислотного метода, показало, что содержание эндополисахаридов в мицелии G. lucidum, выращенном на средах на основе спиртовой барды, варьирует в пределах 8.24— 11.53 % (табл. 6). Различия в содержании эн-дополисахаридов в мицелии в зависимости от состава среды были статистически недостоверны. Выход эндополисахаридов на исследованных средах составил 2.1—2.4 г/л.
Таблица 6 Содержание эндополисахаридов в погруженном мицелии G. lucidum
Среда, Содержание Выход
№ эндополи- эндополи-
сахаридов сахаридов,
в мицелии, % г/л
4 11.53 2.2
5 8.24 2.1
6 10.02 2.4
Проведенное исследование показало возможность создания микобиотехнологического способа утилизация отходов производства биоэтанола, направленного на получение
как биомассы лекарственного базидиомицета G. lucidum, так и его биологически активных полисахаридов.
На основе спиртовой барды может быть разработан весь комплекс питательных сред, используемых в микобиотехнологиях. Это твердофазная среда на основе зерновой дробины, применяемая для вегетативного размножения гриба-продуцента. Культура, выращенная на твердофазной среде, служит посевным материалом для последующего погруженного культивирования. Выращивание на зерновой дробине способствует адаптации гриба-продуцента к спиртовой барде и, как следствие, увеличению выхода целевых продуктов.
В жидкие питательные среды для погруженного культивирования G. lucidum следует включать не только зерновую дробину, но и жидкую фазу спиртовой барды. Для повышения выхода биомассы лекарственного бази-диомицета в питательные среды на основе спиртовой барды могут быть включены отходы пищевых производств, которые являются источниками углерода и азота. Среды без дополнительного внесения источников углерода и азота целесообразно использовать при разработке методов получения эндополисахаридов G. lucidum.
Биомасса G. lucidum может быть использована для разработки биологически активных добавок к пище, направленных на нормализацию функционирования организма человека. На основе биологически активных метаболитов G. lucidum возможно создание лекарственных препаратов. Таким образом, микобиотех-нологические способы утилизации отходов производства биоэтанола обеспечат значительное повышение рентабельности этих процессов по сравнению с переработкой спиртовой барды в корма для сельскохозяйственных животных или в удобрения.
Литература
1. Ю. Л., Тулигуэл, Хайин Б., Широких А. А., Широких И. Г., Егошина Т. Л., Кириллов Д. В. Лекарственные грибы в традиционной китайской медицине и современных биотехнологиях. — Киров: О-Краткое, 2009.— 320 с.
2. Hobbs C. Medicinal mushrooms: an exploration of tradition, healing and cultures.— Loveland: Interweave Press, Inc., 1995.— 251 p.
3. Bao X. F., Wang X. S., Dong Q., Fang J. N., Li X. Y.// Phytochemistry.- 2002.- V. 59.- P. 175.
4. Chien C. M., Cheng J. L., Chang W. T., Tien M. H., Tsao C. M., Chang Y. H., et al. // Bioorg. and Med. Chem.- 2004.- V.12, № 21.- P.5603.
5. Gao J. J. Min B. N., Ahn E. M., Nakamura N., Lee H. K., Hattori M. // Chem. and Pharm. Bull. - 2002. - V.50, № 6.- P. 837.
6. Han H. F.,Nakamura N., Hattori M. // J. Nat. Medic.- 2006.- V. 60.- P. 295.
7. Круподьорова Т. А. БюлоНчш особливост Ganoderma applanatum (Pers.:Wallr.)Pat ta G.lucidum (Curt.:Fr.) P. Karst. в культурь Дисс....канд.бюл.наук.- Кшв.- 2009.- 21 с.
8. Hsich C., Hsu T.-H., Yang F.-C.//Proc. Boichem.- 2005.- V. 40, I 2.- P. 909.
9. Винаров А. Ю., Смирнов В. Н., Соколов Д. П., Кухаренко А. А. Биотехнологические методы защиты окружающей среды.- М.: Изд. «ФИПС», 1999.- 46 с.
10. Арсеньев Д. В., Красницкий В. М., Кузмичев А. В., Ежков А. А., Ежков А. В., Пекарев В. Я.// Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2001.- №4. - С. 24.
11. Красницкий В. М., Арсеньев Д. В., Ежков А. В., Ежков А. А., Кузмичев А. В.//Ликероводочное производство и виноделие.- 2001.- №11(23).-С. 4.
12. Богуславская Н. В.//Экологическая безопасность в АПК. Реферативный журнал.- 2007. -№ 3.- С. 604.
13. Олийничук М. И. Кошель, С. Т. Олийничук, Ю. А. Коранов, Г. М. Заболотная, Н. Б.//Про-изводство спирта и ликероводочных изделий. -2008.- №1.- С.19.
14. Автономова А.В., Краснопольская Л.М., Максимов В.Н.//Микробиол.- 2006.- Т. 75, № 2.-С. 186.
15. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. and Smith F.//Analyt. Chem.- 1956.- V. 28, № 3.- P. 350.
16. Автономова А. В, Белицкий И. В., Исакова Е. Б., Евсенко М. С., Усов А. И., Бухман В. М., Краснопольская Л. М. Биотехнология получения и противоопухолевые свойства водорастворимых полисахаридов мицелия и плодовых тел Ganoderma lucidum//Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии.- Минск-Раков.- 2006.- С.244.
Работа выполнена в рамках Федеральной Целевой Программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы».
