CC BY
387
о
Аннотация. Данная статья посвящена некоторым методам создания генетически модифицированных организмов.
Ключевые слова: трансгенные организмы, генетика, трансформация. о
Новые организмы, которые созданы различными методами генной инженерии, могли бы очень широко использоваться в различных сферах нашей жизни.
При создании трансгенных растений возникают некоторые трудности. Это получение нового растения с такими генами, которые от природы не даны ему. Во- первых, необходимо выделить нужный ген из чужой ДНК; во-вторых, нужно встроить его в молекулу ДНК данного растения. Основные этапы создания генетически модифицированных организмов:
- получение изолированного гена;
- введение гена в вектор для переноса в организм;
- перенос вектора с геном в модифицируемый организм;
- преобразование клеток организма;
- отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Существует несколько методов для внедрения чужеродной ДНК в геном растения. Рассмотрим наиболее распространенные.
1. Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens. Грамотрицательная почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens — фитопатоген, который в процессе своего жизненного цикла трансфор-мирует клетки растений. Эта трансформация приводит к образованию корончатого галла — опухоли, нарушающей нормальный рост расте-ния. Этой болезни, имеющей серьезные агрономические последствия, подвержены только
622
о
SCIENCE TIME
двудольные растения, в частности виноград, косточковые фруктовые деревья.
Образование корончатого галла начинается с проникновения, интеграции в геном растительных клеток и экспрессии специфического сегмента бактериальной плазмидной ДНК — так называемой Т-ДНК (от англ. transferred DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (tumor-inducing plasmid, Ti-плазмиды); ее несут большинство штаммов A. tumefaciens.
Инфекционный процесс начинается с прикрепления A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой шейки). Все дело в специфических фенольных соединениях, ацетосирингоне и гид роксиацетосирингоне, которые выделяет поврежденное растение. Эти соединения сходны с некоторыми продуктами основного пути синтеза у растений вторичных метаболитов, таких как лигнины и флавоноиды. Ацетосирингон и гидроксиацетосирингон активируют гены вирулентности (vir), которые локализова-ны в участке Ti-плазмиды длиной 35 т. п. н., находящемся за пределами Т-ДНК.
После присоединения A. tumefaciens, несущей Ti-плазмиду, к растительной клетке и активации wV-генов Т-ДНК транспортируется в клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного механизму переноса плазмидной ДНК из донорной клетки в реципиентную в процессе конъюгации.
Переход Т-ДНК в одноцепочечную форму начинается с внесения в нее разрывов по обеим фланкирующим ее последовательностям. Предполагается, что интеграция Т-ДНК в геном растения зависит от специфических последовательностей, локализованных в правой фланкирующей последовательности, которая содержит повтор длиной 25 п. н. Аналогичный повтор присутствует и в левой последовательности, однако, как показывает делеционный мутагенез, она не принимает участия в интеграции.
Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее встраивания в геном растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Гены iaaMiA iaaH, известные также как tmsl и tms2 соответственно, кодируют ферменты, принимаю-щие участие в синтезе растительного гормона ауксина (индолилуксусной кислоты). Ген iaaM кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая катализирует превращение триптофана в индолил-3-ацетамид, а ген iaaH — фермент индолил-3-ацетамидгидролазу,
катализирующую образование индолилуксусной кислоты из индолил-3-ацетамида. Кроме того, Т-ДНК несет ген tmr (известный также как ген itp), кодирующий изопентилтрансферазу — фермент, который катализирует присоединение к 5'-AMP изопреноидной боковой цепи с образованием цитокининов изопентениладенина и изопентениладенозинмонофосфата. При гидроксилировании этих соединений растительными ферментами образуются цитокинины трансзеатин и трансрибозилзеатин соответственно. И ауксин, и
623
о
SCIENCE TIME
цитокинины регулируют рост и развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей, таких как корончатый галл [1].
2. Физические методы. Системы переноса генов с помощью A. tumefaciens эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеницу и кукурузу), практически не трансформируются A. tumefaciens. Тем не менее, модифицировав методики и тщательно контролируя условия, удалось трансформировать кукурузу и рис агробактериями A. tumefaciens, несущими векторы — производные Ti- плазмид [2].
Так, например, незрелые зародыши кукурузы помещали на несколько минут в суспензию клеток A. tumefaciens, а затем инкубировали несколько дней в отсутствие селективного давления. После этого зародыши переносили в среду с антибиотиками, в которой могли расти только трансформированные растительные клетки. Эти клетки выдерживали в темноте в течение нескольких недель, затем переносили массу трансформированных растительных клеток на другую питательную среду и инкубировали на свету, чтобы произошла регенерация целого трансгенного растения.
3. Бомбардировка микрочастицами. Бомбардировка микрочастицами, или биолис-тика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС12, спермидином или полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не повреждаются.
Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью Agrobacterium [2].
Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и пыльцу широкого круга растений. Кроме того, с помощью этого метода были транспортированы гены в хлоропласт и митохондрии. На поверхность микрочастиц можно осадить плазмидную ДНК, растворенную в буфере. Это позволяет повысить частоту трансформации путем увеличения количества плазмидной ДНК; однако следует иметь в виду, что слишком большие ее
624
о
SCIENCE TIME
количества могут оказаться губительными для клетки.
В трансформированных таким способом клетках, идентифицируемых по экспрессии маркерного гена, введенная ДНК зачастую экспрессируется лишь кратковременно. Пока чужеродная ДНК не встроится в геном растения, она с большой вероятностью утрачивается при делении трансформированных клеток.
Как интеграция, так и экспрессия чужеродных генов может зависеть от конфигурации вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. Кроме того, при бомбардировке микрочастицами высокомолекулярные плазмиды (>10 т. п. н.) могут фрагментироваться, поэтому уровень экспрессии чужеродных генов окажется ниже, чем в случае плазмид меньшего размера [1].
Литература:
1. Б.Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы и применение, М.: Мир, 2002.-585 с.
2. Маниатис Т. Методы генетической инженерии, М.: Мир, 2001.- 479 с.
625
