CC BY
35
© Коллектив авторов, 1999
УДК 616.42-006.04-097-092.9:577.112.6
Н. Т. Райхлин, И. А. Букаева, Н. А. Пробатова,
Е. А. Смирнова, Н. Н. Тупицын, Е. Н. Шолохова, Р. Госсрау
МЕМБРАННО-АССОЦИИРОВАННЫЕ ЭКЗОПЕПТИДАЗЫ ПРИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН,
Институт анатомии Свободного Университета, Берлин
Интерес к изучению экзопептидаз, ассоциированных с поверхностными мембранами клеток, связан с их ролью в развитии злокачественных новообразований. Они участвуют в процессах роста, размножения и дифференцировки опухолевых клеток, в модуляции действия лимфокинов, в изменении адгезивных свойств и ликвидации контактного торможения, способствуют инвазивному росту опухолей и образованию метастазов (разрушая базальную мембрану и белковый компонент экстрацеллюлярного матрикса), могут определять орган-мишень для образования метастазов [2, 12, 14, 18, 22, 23, 29]. Экспериментальными исследованиями было показано, что один из ферментов группы экзопептидаз — гамма-глутамилтранспептидаза — может проявлять свойства раково-эмбрионального антигена и быть маркером опухолевой трансформации клеток печени крыс [28]. Являясь одним из ключевых ферментов метаболизма глутатиона и регуляции его внутриклеточного уровня, этот фермент может вовлекаться в развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей [29].
Неходжкинские злокачественные лимфомы (НЗЛ) и лимфогранулематоз (ЛГМ) изучались с различных позиций [3, 6—9, 30].
Особенности экспрессии активности разных групп экзопептидаз при доброкачественных и злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях остаются малоизученными. Имеющиеся сведения касаются лишь отдельных наблюдений НЗЛ и ЛГМ [7, 8, 13, 20, 21, 26].
Задачей настоящего исследования было изучение активности гамма-глутамилтранспептидазы или гамма-глутамилтран-сферазы (ГГТ) (ЕС 2.3.2.2), аминопептидазы М (АПМ) или аминопептидазы N (АРЫ) (ЕС 3.4.11.2), аминопептидазы А (АПА) (ЕС 3.4.11.7) и дипептидил(амино)пептидазы IV (ДАШУ или ДПП1У) (ЕС 3.4.14.5)* в клетках при реактивной фолликулярной гиперплазии (РФГ), НЗЛ и ЛГМ; выявление возможности использования полученных результатов в дифференциальной диагностике НЗЛ разной степени злокачественности и разграничении РФГ и ее опухолевого аналога — фолликулярной центробластно-центроцитарной лимфомы.
Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 26 случаев лимфопролиферативных заболеваний, в том числе 11 НЗЛ, 7 ЛГМ и 8 РФГ. Все наблюдения были иммунофенотипированы. Среди НЗЛ в соответствии с требованиями Кильской классификации [27] были выделены 5 НЗЛ низкой степени злокачественности и 6 НЗЛ высокой степени злокачественности.
НЗЛ низкой степени злокачественности включали четыре В-клсточных
N.T.Reihlin, LA.Bukayeva, N.A.Probatova, E.A.Smirnova, N.N.Tupitsyn, E.N.Sholokhova, R.Gossrau
MEMBRANE-ASSOCIATED EXOPEPTIDASES IN BENIGN AND MALIGNANT LYMPHOPROLIFERATIVE DISEASES
N.N.Blokhin Cancer Research Center, RAMS;
Anatomy Institute, Free University, Berlin
There is a vast study of cell surface membrane-associated exopeptidases due to their contribution to cancer development. These enzymes interfere with tumor cell growth, proliferation and differentiation, lymphokine activity modulation, contribute to adhesion alteration and counteract contact inhibition, promote invasive tumor growth and metastasis (by destroying basal membrane and protein component of extracellular matrix), may determine targets for metastasis [2,12,14,18,22,23,29]. It was demonstrated experimentally that an enzyme from the exopeptidase group, gamma-glutamyl-transpeptidase, may act as carcino-embryonic antigen and serve a marker of neoplastic transformation in rat liver cells [28]. As a key agent of glutathione metabolism and intracellular content regulation this enzyme may be involved in development of tumor multiple drug resistance (MDR) [29].
Non-Hodgkin’s (NHL) and Hodgkin’s (HL) lymphomas were studied in a variety of aspects [3,6-9,30].
However, there was no sufficient study of expression and activity of different exopeptidase classes in benign and malignant lymphoproliferative diseases so far. The available reports mainly describe specific NHL or HL cases
[7,8,13,20,21,26].
The purpose of this study was to analyze activities of cell gamma-glutamyltranspeptidase or gamma-glutamyltrans-ferase (GGT) (EC 2.3.2.2), aminopeptidase M (APM) or aminopeptidase N (APN) (EC 3.4.11.2), aminopeptidase A (АРА) (EC 3.4.11.7) and dipeptidyl (amino) peptidase IV (DAPIV or DPPIV) (EC 3.4.14.5)* in reactive follicular hyperplasia (RFH), NHL and HL; to see whether these findings may be used to diagnose NHL of different malignancy grades and to differentiate RFH from its tumor analog, follicular centroblastic-centrocytic lymphoma.
Materials and Methods. The study was performed in 26 cases with lymphoproliferative diseases including 11 NHLs, 7 HLs and 8 RFHs. Immunophenotyping was performed in all the cases. The NHL cases were stratified into low-grade NHL (5) and high-grade NHL (6) categories in accordance with the Kiel classification [27].
The low-grade NHLs included 4 B-cell (1 lymphocytic, 3 follicular een-troblastic-centrocytic) lymphomas and 1 T-ccll (Lenncrt’s) lymphoma.
The high-grade NHLs included 6 B-cell (3 centroblastic, 3 immunoblastic) lymphomas.
All the HLs were of mixed cellularity type.
Exopcptidasc activity was studied by simultaneous azo-dyc coupling technique [1]. Gamma-glutamyl-4-mctoxy-2-naphthylamidc, L-alanyl-4-metoxy-2-naphthylamide, alpha-glutamyl-4-metoxy-2-naphthylamide and glycylpropyl-4-mctoxy-2-naphthylamide were used as substrates to study
новообразования (лимфоцитарная лимфома — 1, фолликулярная цснтро-бластно-цснтроцитарная лимфома — 3) и одно Т-клсточнос новообразование (лимфома Лсннсрта).
НЗЛ высокой степени злокачественности были представлены шестью В-клеточными новообразованиями (центробластные лимфомы — 3, имму-нобластные лимфомы — 3).
Все исследованные ЛГМ имели смсшанно-клсточнос строение.
Для выявления активности экзопептидаз использовали метод одновременного азосочетания [1]. Субстратом для выявления активности ГГТ, АПМ, АПА, ДАШУ послужили соответственно гамма-глутамил-4-мсток-си-2-нафтиламид, Ь-аланил-4-метокси-2-нафтиламид, альфа-глутамил-4-мстокси-2-нафтиламид и глицилпролил-4-метокси-2-нафтиламид. Конечная концентрация субстрата 0,5 мг/мл. В качестве соли диазония был использован прочный синий В в конечной концентрации 1 мг/мл. При выявлении активности ГГТ и АПА в качестве активатора в инкубационную среду вводили соответственно глицил-глицин в конечной концентрации
0,5 мг/мл и СаС12 в конечной концентрации 1 мг/мл. Выявление активности ферментов проводили в криостатных срезах нефиксированной ткани.
В клетках разных тканей и органов группа экзопептидаз выявляется при гистохимическом исследовании как в цитоплазматической мембране, так и в цитоплазме клеток [7, 9, 20, 24].
Результаты. РФГ. Активность ГГТ в лимфоидных элементах зародышевых центров, зон мантии, межфолликуляр-ных зон была низкая или умеренная и практически сходна в клетках В- и Т-зависимых зон лимфоузла, что приводило к «стиранию» границ реактивных фолликулов (рис. 1, а, табл. 1). Активность АПМ в лимфоидных элементах при РФГ практически отсутствовала, но она была высокой в гистиоцитах, расположенных в зародышевых центрах и в меж-фолликулярной зоне (рис. 1, Ь), а также в сосудах и фиброб-ластах капсулы лимфоузла. Активность АПА отсутствовала и в лимфоидных элементах, и в гистиоцитах, но была высокой в сосудах (рис. 1, с). Активность ДАШУ определялась в эндотелии сосудов и лишь в единичных лимфоидных элементах реактивных фолликулов. Продукт гистохимической реакции в Т-лимфоцитах располагался в виде «пятна».
НЗЛ. Активность ГГТ в лимфомах низкой степени злокачественности была преимущественно низкой как в клетках лимфоцитарной лимфомы, так и в лимфоидных элементах лимфомы Леннерта, в то время как в эпителиоидных клетках последней активность была умеренной. В клетках фолликулярной центробластно-центроцитарной лимфомы активность ГГТ была от низкой до умеренной (рис. 1, с!) и была сходна с активностью фермента при РФГ (см. табл. 1). Лимфомы высокой степени злокачественности — центробластная и им-мунобластная — характеризовались высокой активностью ГГТ (рис. 1, ё). Продукт реакции локализовался по поверхностной мембране, а также в цитоплазме клеток. Активность АПМ, АПА и ДАШУ в опухолевых клетках лимфоцитарной лимфомы, центробластной и иммунобластной лимфом и лимфомы Леннерта не обнаруживалась (табл. 2). При всех вариантах лимфом высокая и очень высокая активность АПМ наблюдалась в фибробластах капсулы лимфоузлов, в участках разрастания соединительной ткани.
activities of GGT, APM, APA, DAPIV, respectively. Substrate end-point concentration was 0.5 mg/ml. Fast blue B at an end-point concentration 1 mg/ml was used as a diazonium salt. Glycyl-glycin at an end-point concentration 0.5 mg/ml and CaC12 at an end-point concentration 1 mg/ml were added to incubation medium as GGT and APA activators. The enzyme activities wore studied in cryostat sections of non-fixcd tissue.
Histochcmical assay discovers exopeptidases in ccll cytoplasmic membrane and cytoplasm in different organs and tissues [7,9,20,24].
Results. RFH. GGT activity in lymphoid elements of germinal centers, mantle zones, interfollicular spaces was low to moderate and practically equal in B- and T-dependent lymph node regions which resulted in disappearance of bor-der-lines between reactive follicles (fig.la, table 1). APM demonstrated practically zero activity in lymphoid elements in contrast to high activity in germinal center and interfollicular histiocytes (fig. 16) as well as in lymph node vessels and capsule fibroblasts. There was no APA activity in lymphoid elements or histiocytes while this activity was high in vessels (fig.lc). DAPIV activity was found in vascular endothelium and in few lymphoid elements of reactive follicles. The histochemical reaction product in T-lymphocytes had a stain-like appearance.
NHL. GGT activity in low-grade lymphomas was as a rule low both in lymphocytic lymphoma and lymphoid elements of Lennert’s lymphoma while increasing to moderate in epithelial cells of Lennert’s lymphoma. The GGT demonstrated low to moderate activity in follicular centroblastic-centrocytic lymphoma (fig.lcQ, similar to that in RFH (see table 1). High-grade (centroblastic and immunoblastic) lymphomas presented with high GGT activity (fig. le). The reaction product was localized on cell membranes and cytoplasm. There was no activity of APM, APA, DAPIV in lymphocytic, centroblastic, immunoblastic and Lennert’s lymphomas (table 2). High or very high APM activity was found in lymph node capsule fibroblasts and in connective tissue growth areas. Besides, high APM activity was also discovered in histiocytes scattered among tumor cells and in vessels (fig.2a). The vessels also demonstrated high APA and low DAPIV activities. DAPIV-positive non-neoplastic lymphoid elements with a stain-like reaction product were regularly encountered among tumor cells of follicle-like areas of centroblastic-centrocytic lymphomas as well as in the vicinity of postcapillary venules in interfollicular spaces. The number of DAPIV-positive lymphoid elements in cen-troblastic-centrocytic lymphomas was variable and reached rather high values in one of such cases (fig.26). There were scarce DAPIV-positive cells among tumor cells in lymphocytic, centroblastic and immunoblastic lymphomas.
HL. GGT activity was high in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in 4 cases. The reaction product was localized on the membrane, marked staining intensity was also discovered
* Молекулярно-биологическими исследованиями была установлена структурная и функциональная идентичность молекул ферментов АПМ, АПА и ДАПІУ и соответствующих лейкоцитарных дифференцировочных антигенов, в связи с чем для названных ферментов приняты также следующие обозначения CD 13 (APN, ВР-1/6СЗ/АРА и CD26) ДАПІУ [25].
* Molecular biological study discovered structural and functional identity of АРМ, АРА and DAPIV molecules with corresponding leukocyte differentiation antigens; therefore the following designations are also used for the above-mentioned enzymes: CD13 (APN, ВР-1/603/, APA and CD26) [25].
Рис. 1. Активность экзопептидаз в клетках при РФГ и в клетках НЗЛ. Метод одновременного азосочетания.
а — РФГ. Гамма-глутамилтранспептидаза: умеренная активность фермента в лимфоидных элементах фолликулов и межфолликулярной зоны, граница между которыми стерта; высокая активность фермента в гистиоцитах, х 120; b — РФГ. Аминопептидаза М: в лимфоидных элементах активность фермента отсутствует; высокая активность в гистиоцитах, х 120; с — РФГ. Аминопептидаза А: высокая активность фермента в сосудах, х 160; d — центробластно-центроцитарная лимфома (низкая степень злокачественности). Гамма-глутамилтранспептидаза: умеренная активность фермента в опухолевых клетках, х 800; е — иммунобластная лимфома (высокая степень злокачественности). Гамма-глутамилтранспептидаза: высокая активность фермента в опухолевых клетках, х 800.
Fig. 1. Cell exopeptidase activity in RFH and NHL. Simultaneous azo-dye coupling technique.
a, RFH. Gamma-glutamyltransferase. Moderate activity in lymphoid elements from follicles and interfollicular areas with unclear border-lines. High activity in histiocytes. x120; b, RFH. Aminopeptidase M. No activity in lymphoid elements. High activity in histiocytes. x120; c, RFH. Aminopeptidase A. High activity in vessels. x160; d, centroblastic-centrocytic lymphoma (low-grade). Gamma-glutamyltranspeptidase. Moderate activity in tumor cells, x 800; e, immunoblastic lymphoma (high-grade). Gamma-glutamyltranspeptidase. High activity in tumor cells, x 800.
Высокая активность АПМ, кроме того, выявлялась в гистиоцитах, разбросанных среди опухолевых клеток, и в сосудах (рис. 2, а). В сосудах также наблюдалась высокая активность АПА и слабая активность ДАШУ. ДАП1У — положительные неопухолевые лимфоидные элементы с продуктом реакции в виде «пятна» постоянно встречались среди опухолевых клеток фолликулоподобных очагов цент-робластно-центроцитарной лимфомы, а также в межфолли-кулярных зонах, где они располагались вблизи посткапил-лярных венул. Число ДАП1У-положительных лимфоидных элементов в центробластно-центроцитарных лимфомах колебалось и в одном из наблюдений отмечалось довольно высокое содержание ДАП1У-положительных клеток (рис. 2, Ь). Среди опухолевых клеток лимфоцитарной, центробласт-ной и иммунобластной лимфом встречались единичные ДАП1У-положительные клетки.
ЛГМ. В 4 наблюдениях в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга активность ГГТ была высокой. Продукт реакции локализовался вдоль поверхностной мембраны,
in cytoplasm. The remaining 3 HL cases presented with low cellular GGT activity. Lymphoid elements of lymphogranuloma tissue showed a moderate GGT activity in all cases (fig.2c). There was no activity of APM, APA, DAPIV in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells. DAPIV demonstrated activity in few lymphoid elements. High APA activity was discovered in vessels, while APM was active in histiocytes and fibroblasts.
Discussion. The GGT activity alone was found in normal lymphoid cells, and tumor cells in the NHL types studied, as well as in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in HL. There was no significant difference in the GGT activity between RFH and its neoplastic analog follicular centroblas-tic- centrocytic lymphoma. High GGT activity was discovered in high-grade NHL while being low in low-grade NHL as concerns both B- and T-cell elements.
Analysis of findings on GGT activity in tumor cells of different origin shows that many epithelial tumors including breast cancer [24], ovarian cancer [12], hepatocellular carcinoma [15] and melanoma [17] have high GGT activity.
Таблица 1 Table 1
Активность экзопептидаз в лимфоидных элементах при реактивной фолликулярной гиперплазии и фолликулярной центробластно-центроцитарной лимфоме
Exopeptidase activity of lymphoid elements in reactive follicular hyperplasia and in follicular centroblastic-centrocytic lymphoma
Лимфопролиферативные заболевания Экзопептидазы
ГГТ АПМ АПА ДАП IV
РФГ:/Reactive follicular hyperplasia (RFH):
лимфоидные элементы зародышевых центров лимфоидных фолликулов lymphoid elements from lymphoid follicular germinal centers +/++ - - + (отдельные клетки) (single cells)
лимфоидные элементы зон мантии lymphoid elements from mantle areas +/++ - - «
лимфоидные элементы межфолликулярных зон lymphoid elements from interfollicular spaces + - - «
Фолликулярная центробластно-центроцитарная лимфома: Follicular centroblastic-centrocytic lymphoma: опухолевые клетки tumor cells неопухолевые лимфоидные элементы non-neoplastic lymphoid elements +/++ + + - —/+(отдельные клетки) (single cells)
GGT АРМ АРА DAPIV
Lymphoproliferative diseases Exopeptidases
а также отмечалось выраженное окрашивание цитоплазмы. В остальных 3 наблюдениях ЛГМ активность ГГТ в опухолевых клетках была низкой. В лимфоидных элементах лимфогранулематозной ткани во всех случаях активность ГГТ была умеренной (рис. 2, с). Активность АПМ, АПА, ДАШУ в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга не выявлялась. Активность ДАП IV наблюдалась лишь в единичных лимфоидных элементах. Высокая активность АПА определялась в сосудах, а АПМ — в гистиоцитах и фибробластах.
Обсуждение. Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что в нормальных лимфоидных клетках и опухолевых клетках изученных вариантов НЗЛ, а также в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга при ЛГМ наблюдалась экспрессия только активности ГГТ. При этом существенных различий в активности ГГТ в клетках РФГ и ее опухолевого аналога фолликулярной центробластно-центроцитарной лимфомы обнаружено не было. Также было установлено, что высокая активность ГГТ наблюдается в клетках НЗЛ высокой степени злокачественности, в то время как в клеточных элементах НЗЛ низкой степени злокачественности, как В-, так и Т-клеточных, активность ГГТ была низкой.
Анализ имеющихся сведений об активности ГГТ в клетках опухолей разного гистогенеза показывает, что многие эпителиальные опухоли, включая рак молочной железы [24], рак яичников [12], гепатоцеллюлярный рак [15], а также меланомы [17], характеризуются высокой активностью ГГТ. Сообщается об умеренной и высокой активности ГГТ при остром миелобластном, миелоцитарном и монобласт-ном лейкозах, а также при бластном кризе хронического ми-елолейкоза [20, 23]. В противоположность этому при ост-
There are reports of moderate to high GGT activity in acute myeloblastic, myelocytic and monoblastic leukemias as well as in blast crisis of chronic myeloid leukemia [20,23]. In contrast acute lymphoblastic leukemias demonstrate practically zero or low activity of this enzyme [16,21] as well as B-cell chronic leukemia, prolymphocytic and hairy-cell leukemia [20,21].
There are few reports of GGT activity in NHL and HL
[13,20,21,26]. Low GGT activity is found in centroblastic-centrocytic lymphoma [20], moderate activity of the enzyme was discovered in Sezary syndrome [21] and high activity in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells [20].
Our findings of low GGT activity in centroblastic-centro-cytic lymphoma are in agreement with the published data [20]. As concerns Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in HL we found high GGT activity in 4 and low activity in another 3 cases.
The discovered difference in GGT activity in NHL of different degree of malignancy is also of much interest because tumor glutathione is involved in a mechanism of development of antitumor drug resistance and GGT is a key regulator of glutathione cell content. There are several publications that confirm relationship of increased GGT activity and tumor resistance to alkylating agents and platinum derivatives as well as the resistance to radiation therapy [12]. Besides, increased tumor GGT content may be associated with high activity of glutathionetransferase whose isoforms interfere with metabolism of various antitumor agents by catalyzing conjugation of electrophilic compounds with glutathione resulting in generation of lower toxic complexes [29].
Thus, the supposition may be made that the observed differences in GGT activity between low- and high-grade NHL
Таблица 2 Table2
Активность экзопептидаз в опухолевых клетках НЗЛ низкой и высокой степени злокачественности Tumor cell exopeptidase activity in low- and high-grade NHL
Морфологический вариант НЗЛ Экзопептидазы
ГГТ АПМ АПА ДАП1У
НЗЛ низкой степени злoкaчecтвeннocти:/Low-grade NHL:
лимфоцитарная + - - -
lymphocytic
фолликулярная центро-бластно-центроцитарная +/++ - - -
follicular centroblastic-centrocytic
лимфома Леннерта + - - -
Lennert’s lymphoma
НЗЛ высокой степени злoкaчecтвeннocти:/High-grade NHL
центробластная +++ - - -
centroblastic
иммунобластная +++ - - -
immunoblastic
Неопухолевые лимфоидные элементы + - _ +(отдельные клетки)
Non-neoplastic lymphoid elements (single cells)
GGT АРМ АРА DAPIV
NHL morphological types Exopeptidases
•* «te
-
Рис. 2. Активность экзопептидаз при НЗЛ и ЛГМ. Метод азосочетания.
а — фолликулярная центробластно-центроцитарная лимфома. Аминопептидаза М: активность фермента отсутствует в опухолевых клетках фолликулоподобных очагов; высокая активность фермента определяется в соединительной ткани, окружающей опухолевые фолликулы, в сосудах, а также в гистиоцитах, располагающихся в опухолевых фолликулах и межфолликулярной зоне, х 120; Ь — центробластно-центроцитарная лимфома. Межфолликулярная зона Дипептидил(амино)пептидаза IV: активность фермента в лимфоидных элементах, расположенных вблизи посткапиллярных венул; в клетках эндотелия посткапиллярных венул слабая активность фермента, х 500; с — ЛГМ. Смешанноклеточный вариант. Гамма-глутамилтранспептидаза: высокая активность фермента в клетках Ходжкина и умеренная активность в лимфоидных элементах, х 800.
Fig. 2. Exopeptidase activity in NHL and HD. Azo-dye coupling technique.
a, follicular centrobfastic centrocytic lymphoma. Aminopeptidase M. No activity in tumor cells from follicle-like foci. High activity in connective tissue surrounding tumor follicles, in vessels, in histiocytes from tumor follicles and interfollicular spaces. x120; b, centroblastic-centrocytic lymphoma. Interfollicular space. Dipeptidyl(amino)peptidase IV. Activity in lymphoid elements situated in the vicinity of postcapillary venules. Low activity in postcapillary venular epithelial cells, x 500; c, HL. Mixed cellularity type. Gamma-glutamyltranspeptidase. High activity in Hodgkin’s cells, moderate activity in lymphoid elements, x 800.
рых лимфобластных лейкозах активность фермента практически отсутствует или низкая [16, 21]. Низкая она и в клетках В-клеточного хронического лимфолейкоза, пролимфо-цитарного и волосковоклеточного лейкозов [20, 21].
cells both reflect degree of malignancy and may serve as a prognostic factor of different response to therapy.
The difference in GGT activity in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in mixed cellularity HL suggests
В отношении активности ГГТ в клетках НЗЛ и при ЛГМ имеются лишь единичные сообщения [13, 20, 21, 26]. Сообщается о низкой активности ГГТ в клетках центробластно-центроцитарной лимфомы [20]; умеренной активности в клетках при синдроме Сезари [21] и высокой активности ГГТ в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга [20].
Наши данные о низкой активности ГГТ в клетках цент-робластно-центроцитарной лимфомы согласуются с данными литературы [20]. Что же касается клеток Ходжкина и Березовского — Штернберга при ЛГМ, то, как было нами отмечено, наряду с высокой активностью ГГТ в этих элементах в 4 наблюдениях в 3 других была зарегистрирована низкая ее активность.
Обнаруженные различия активности ГГТ в опухолевых клетках НЗЛ разной степени злокачественности представляют интерес также в связи с тем, что одним из механизмов развития устойчивости к противоопухолевой терапии является содержание глутатиона в опухолевых клетках, ключевая роль в поддержании внутриклеточного уровня которого принадлежит ГГТ. В ряде исследований была подтверждена связь между повышенной активностью этого фермента и развивающейся устойчивостью к алкилирующим агентам и препаратам, основанным на платине, а также резистентностью к лучевой терапии [12]. Кроме того, в опухолях повышенная активность ГГТ может сочетаться с высокой активностью глутатионтрансферазы, изоформы которой вовлекаются в метаболизм разных противоопухолевых препаратов, катализируя конъюгацию электрофильных соединений с глутатионом с образованием менее токсичных комплексов [29].
В связи с изложенным можно думать, что наблюдавшиеся нами различия активности ГГТ в клетках НЗЛ (низкой и высокой степени злокачественности) отражают степень их злокачественности и могут являться прогностическим признаком разной чувствительности к проводимой терапии.
Различная активность фермента в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга при смешанно-клеточном варианте ЛГМ может свидетельствовать о функциональной неоднородности опухолевых клеток при этом варианте ЛГМ, а также, возможно, об их разном ответе на терапевтические мероприятия.
Отсутствие активности АПМ и АПА в опухолевых клетках исследованных НЗЛ и в их неопухолевых аналогах объясняется особенностями экспрессии активности этих ферментов в клетках гемопоэтического ряда. Имму-ногистохимическими исследованиями было установлено, что активность АПМ (СВ IЗ/АРГЧ) экспрессируется комми-тированными гранулоцитарно-моноцитарными предшественниками и морфологически распознаваемыми клетками гранулоцитарно-моноцитарного ряда последующих стадий дифференцировки. В противоположность этому ни в клетках-предшественниках лимфоидного ряда, ни в зрелых В- и Т-лимфоцитах активность АПМ не обнаруживается [25]. Что же касается АПА (ВР-1/6СЗ/АРА), то активность этого фермента в клетках лимфоидного ряда у человека практически не изучена, однако имеются сведения о том, что у мышей ВР-1/6СЗ/АРА экспрессируется ранними, содержащими цитоплазматические иммуногло-
functional heterogeneity of tumor cells in this HL type and may be indicative of different response to therapy.
The absence of АРМ and АРА activities in tumor cells from cases with NHL and its non-neoplastic analogs may be due to peculiar expression of the enzymes in hemopoietic cells. It was discovered immunohistochemically that АРМ (CD13/APN) activity is expressed by committed granulocyte/monocyte progenitor cells and by morphologically distinct granulocytes and monocytes of further differentiation stages. In contrast no АРМ activity is found in lymphoid progenitor cells or mature B- and T-lymphocytes [25]. АРА (BP-1/603/APA) activity in human lymphoid cells has not been studied sufficiently so far, though there are reports of BP-1/603/APA expression on early bone marrow non-anti-gen-dependent В-cells containing cytoplasmic immunoglobulins in mice while no such expression is found on mature В-cells from peripheral blood, spleen, lymph nodes [25].
The studied В-cell NHLs were formed of В-cells at later antigen-dependent differentiation stages which may account for the zero АРА activity in the tumor cells.
Different tumor groups are characterized by specific distribution of АРМ activity which allows distinction of tumors of different origin and detection of lymph node metastasis from tumors with high АРМ activity (colonic adenocarcinoma, melanoma, gall bladder and gastric cancer) [4,5]. Our findings of zero АРМ and АРА activity in lymphoid elements of B- and T-dependent areas of reactively altered lymph nodes also suggest that АРА and АРМ may be used to identify cancer cells in lymph nodes.
The observed zero DAPIV activity in tumor cells of the B- and T-cell NHLs studied and in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in HL is in agreement with previous findings of no DAPIV activity in these cells.
The DAPIV was considered a phenotypic marker of T-lymphocytes. However, recent studies discovered DAPIV expression on certain splenic В-cells, Epstein-Barr virus-transformed В-cell lymphoblastoid cell lineages [25]. The highest DAPIV activity was found in medullar thymocytes. In mature T-cells from lymphoid organs and in peripheral T-lymphocytes the DAPIV is expressed mainly by T-helpers [9,11].
Among lymphoid tissue tumors DAPIV is mainly expressed in T-cell neoplasms including lymphoblastic NHL, prolymphocytic leukemia, T-cell types of large-cell anaplastic Ki-I/CD30-positive NHL as well as in some cases with T-cell chronic leukemia, mycosis fungoidea, angioim-munoblastic T-cell lymphoma [7-9,11,19]. Among B-cell NHLs DAPIV expression was discovered only in few cases of large-cell anaplastic Ki-I/CD30-positive lymphoma and acute lymphoblastic leukemia [7,25].
The DAPIV-positive lymphoid elements with stain-like reaction products in RFH and in tumor tissue of different NHL and HL types corresponded to immunohistochemical findings about T-helper distribution in reactively altered lymph nodes [10] as well as in tissue of various В-cell NHLs and HLs [8,30].
Histochemical and immunohistochemical study of B-cell NHL discovered that the CD26/DAPIV-positive cells were non-neoplastic activated T-helpers. The supposition was
булины антигеннезависимыми пре-В-клетками костного мозга и фетальной печени, в то время как фермент не экспрессируется зрелыми В-лимфоцитами периферической крови, селезенки, пейеровых бляшек и лимфоузлов [25].
Исследованные нами В-клеточные НЗЛ были представлены новообразованиями, сформированными из В-клеток более поздних антигензависимых стадий дифференциров-ки, что может быть причиной отсутствия в опухолевых клетках активности АПА.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что каждой группе опухолей свойствен определенный характер распределения активности АПМ, что позволяет проводить дифференциальную диагностику опухолей разного гистогенеза и обнаруживать метастазы опухолей с высокой активностью АПМ (аденокарциномы толстой кишки, меланомы, раки желчного пузыря, желудка) в лимфоузлах [4, 5]. Результаты настоящего исследования, свидетельствующие об отсутствии активности АПМ и АПА в лимфоидных элементах В- и Т-зависимых зон реактивно измененных лимфоузлов, подтверждают возможность использовать активность АПМ, а также и АПА как тест, позволяющий идентифицировать метастатические раковые клетки в лимфоузлах.
Полученные нами данные об отсутствии ДАП1У в опухолевых клетках исследованных вариантов В- и Т-клеточных НЗЛ, а также в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга при ЛГМ подтверждаются имеющимися сведениями об отрицательной активности ДАП1У в клетках этих новообразований.
ДАШУ рассматривалась как фенотипический маркер Т-кле-ток. Однако исследованиями последних лет продемонстрировано, что ДАШУ может также экспрессироваться определенными В-клетками селезенки и В-клеточными лимфобластоидными линиями клеток, трансформированными вирусом Эпштейна — Барр [25]. Наиболее высокая активность ДАШУ наблюдается в медуллярных тимоцитах. В зрелых Т-клетках, локализующихся в лимфоидных органах, и в Т-клет-ках периферической крови ДАШУ экспрессируется преимущественно Т-клетками с иммунофенотипом Т-хелперов [9,11].
Среди опухолей лимфоидной ткани экспрессия ДАШУ наблюдается преимущественно в Т-клеточных новообразованиях, включающих лимфобластные НЗЛ, пролимфоцитарный лейкоз, Т-клеточные варианты крупноклеточной анапласти-ческой Кл-1/СП30-положителыгой НЗЛ, а также некоторые случаи Т-клеточного хронического лимфолейкоза, грибовидного микоза, Т-клеточных лимфом ангиоиммунобластного типа [7 — 9, 11, 19]. Среди В-клеточных НЗЛ экспрессия активности ДАП1У была отмечена лишь в некоторых случаях крупноклеточных анапластических КИ/СБ-положительных лимфом и острых лимфобластных лейкозов [7, 25].
Наблюдаемая нами ДАШУ-положительные лимфоидные элементы с продуктом реакции в виде «пятна» при РФГ, а также в опухолевой ткани различных вариантов НЗЛ и при ЛГМ соответствовали иммуногистохимическим данным о характере распределения Т-клеток-хелперов в реактивно изменен-ныхт лимфоузлах [10], а также в ткани разных вариантов В-клеточных НЗЛ и при ЛГМ [8, 30].
При анализе серии В-клеточных НЗЛ с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов было найдено,
made that the non-neoplastic activated T-lymphocytes might synthesize growth factors similar to interleukin-2 and modulate growth of B-cell NHL [8].
Conclusions. 1. The study of exopeptidases GGT, APM, APA, DAP1V in low- and high-grade NHL as well as in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells in HL discovered expression of GGT only.
2. High-grade (centroblastic and immunoblastic) NHL cells demonstrated high GGT activity while low-grade (lymphocytic, follicular centroblastic-centrocytic, Lennert’s lymphoma) NHL had low to moderate activity of the enzyme. This difference suggests that GGT activity may be used as a supplementary test to differentiate these neoplasms.
3. GGT activity in Hodgkin and Beresovsky-Stemberg cells was high in some and low in other HL cases.
4. The discovered difference in tumor GGT activity between NHL and HL may be used as a prognostic sign of response to therapy. It may be expected that NHL and HL with high GGT activity have a poorer prognosis due to the risk of resistance to antitumor therapy.
5. GGT activities of lymphoid elements in B- and T-dependent regions of lymph nodes with RFH were practically similar and low.
6. There was no difference in GGT activity between RFH and follicular centroblastic-centrocytic lymphoma having similar morphology.
7. DAPIV activity was found in few lymphoid elements of reactive follicles and interfollicular spaces in RFH as well as in single non-neoplastic lymphoid elements in NHL and in HL with a stain-like reaction product characteristic of T-helpers.
8. The absence of APM and APA activity in lymphoid elements from lymph node B- and T-dependent areas suggests that measurement of activity of these enzymes may be undertaken to identify metastatic cancer cells with high exopeptidase activity in lymph nodes.
This study was supported by the Russian Foundation for Fundamental Research, code 96-04-49273, and the Foundation for National Priorities in Medicine and Health Care, code 07-02.
что С026/ДАШУ-положительные клетки являются неопухолевыми активированными Т-лимфоцитами хелпер-ного иммунофенотипа. Полагают, что неопухолевые активированные Т-лимфоциты могут секретировать факторы роста, подобно интерлейкину-2, и модулировать рост В-клеточных НЗЛ [8].
Выводы. 1. Среди исследованных экзопептидаз (ГГТ, АПМ, АПА и ДАП1У) в опухолевых клетках НЗЛ низкой и высокой степени злокачественности, а также в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга при ЛГМ выявляется лишь активность ГГТ.
2. Обнаружено, что клетки НЗЛ высокой степени злокачественности (центробластные и иммунобластные НЗЛ) характеризовались высокой активностью ГГТ, в то время как клетки НЗЛ низкой степени злокачественности (лим-
фоцитарные, фолликулярные центробластно-центроцитарные, лимфома Леннерта) имели низкую или умеренную активность фермента. Найденные различия активности ГГТ могут быть использованы как дополнительный дифференциально-диагностический признак при разграничении этих новообразований.
3. Активность ГГТ в клетках Ходжкина и Березовского — Штернберга в части случаев ЛГМ высокая, в части — низкая.
4. Выявленные различия активности ГГТ в опухолевых клетках НЗЛ и при ЛГМ могут рассматриваться как прогностический признак разной чувствительности злокачественных лимфом к проводимой терапии. Можно ожидать, что НЗЛ и случаи ЛГМ с высокой активностью ГГТ в опухолевых клетках могут быть прогностически менее благоприятными в связи с большим риском развития устойчивости к проводимой противоопухолевой терапии.
5. Активность ГГТ в лимфоидных элементах В- и Т-зави-симых зон лимфоузлов при РФГ была практически сходной и характеризовалась низкими значениями.
6. Существенных различий активности ГГТ между РФГ и фолликулярной центробластно-центроцитарной лимфомой, имеющих сходное морфологическое строение, не выявлено.
7. Активность ДАП1У выявлялась лишь в единичных лимфоидных элементах реактивных фолликулов и межфол-ликулярных зон при РФГ и в отдельных неопухолевых лимфоидных элементах при НЗЛ и при ЛГМ с продуктом реакции в виде «пятна», характерным для Т-клеток-хелперов.
8. Отсутствие активности аминопептидаз М и А в лимфоидных элементах В- и Т-зависимых зон лимфоузлов подтверждает возможность использования анализа активности этих ферментов как теста, позволяющего идентифицировать в лимфоузлах метастатические раковые клетки с высокой активностью экзопептидаз.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, код 96-04-49273, и Фонда «Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении», код 07-02.
ЛИТЕРАТУРА /REFERENCES
1. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. //Гистохимия ферментов:
Пер. с англ. — М., 1982. — С. 157—176.
2. Орехович В. Н., Локшина Л. А., Елисеева Ю. Е., Павлихина
Л. В. //Вестн. АМН СССР. — 1984. — № 8. — С. 3—11.
3. Пробатова Н. А. //Арх. пат. — 1990. — Т. 58, № 9. — С. 72—
75.
4. Райхлин Н. Т. Гистохимические методы в диагностике опухолей человека. — М., 1968. — С. 20—23.
5. Райхлин Н. Т. Патологическая диагностика опухолей человека. — М., 1993, —Т. 1, — С. 93—101.
6. Франк Г. А. //Клиническая морфология лимфогранулематоза: Дис. ... д-ра мед. наук. — М., 1981.
7. Carbone A., Cozzi М., Gloghini A., Pinto A. //Hum. Path. — 1994.— Vol. 25, N 12.—P. 1360—1365.
8. Cozzi М., Gloghini A., VolpeH., Carbone A. //Br.
J. Haemat. — 1990. — Vol. 75, N 3. — P. 325—332.
9. Crockard A. D. //Histochem. J. — 1984. — Vol. 16, N 10. — P. 1027—1051.
10. Dvoretsky Ph., Wood G. S., Levy R., Warnke K. A. //Hum.
Path. — 1982. — Vol. 13, N 7. — P. 618—625.
11. Feller A. C., Parwaresch M. R. //Leuk. Res. — 1980. — Vol.
8. — P. 397—406.
12. Godwin A. K., Meister A., О'Dwyer P. J. et al. //Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1992. — Vol. 89, N 7. — P. 3070—3074.
13. Gossrau R., Bukaeva I., Probatova N., Raikhlin N. //Symposium: Progress in basic, applied and diagnostic histochemistry. — Olomouc, 1994. — P. 12.
14. Graber R., Losa G. A. //Int. J. Cancer. — 1995. — Vol. 62, N
4. — P. 443—449.
15. Haningen М. H., PitotH. C. //Carcinogenesis. — 1985. — Vol. 6.— P. 165—172.
16. Heumann D., Losa G. A., Barra C. et al. //Blood. — 1985. — Vol. 66, N 2. — P. 255—258.
17. Hu F„ Bukman М. M. //Clin. Res. — 1979. — Vol. 7. — P. 529—535.
18. Johnson R. C., Zhu D., Augustinvoss H. G., Pauli B. U.
111. Cell Biol. — 1993. — Vol. 12, N 6. — P. 1423—1433.
19. KhalafM. R„ Bevan P. C„ Hayhoe F. G. H. //J. clin. Path. — 1986. — Vol. 39, N 8. — P. 891—897.
20. KhalafM. R., Hayhoe F. G. H. //Histochem. J. — 1987. — Vol. 19, N 6—7. — P. 385—395.
21. Kramers М. Т. C., Catovsky D. //Br. J. Haemat. — 1978. — Vol. 38, N 1, —P. 453—461.
22. Menrad A., Speicher D., WackerJ., Herlyyn M. //Cancer Res. — 1993.— Vol. 53, N 6. — P. 1450—1455.
23. Morell A., Losa G. A., Carell S. et al. IIAmer. J. Haemat. — 1986. — Vol. 21, N 3. — P. 289—298.
24. Poeius P. A., Baumrucker C. R., McNamara J. P., Bauman D. E. //Biochem. J. — 1980. — Vol. 188, N 2. — P. 565— 568.
25. Shipp M. A., Look Th. //Blood. — 1993. — Vol. 82, N 4. — P. 1052—1070.
26. Spinazze S., Verroni M. A., Murone Y. et al. //Tumori. —
1986. — Vol. 72, N 1. — P. 71—75.
27. Stansfeld A. G., Diebold J., Kapanci Y. et al. //Lancet. —
1988'. — Vol. 1. — P. 292—293.
28. Suzuki Y, Ischizaka H., Kaneda H., Taniguchi N. //Histochem. Cytochem. — 1987. — Vol. 35. — P. 3—7.
29. Tew K. D. //Cancer Res. — 1994. — Vol. 54, N 16. — P. 4313—4320.
30. Van der Valk P., Meier J. L. M. //Histopathology. — 1988. — Vol. 13, N 4. — P. 367—384.
Поступила 30. 06. 97/Submitted 30. 06. 97
