CC BY
49
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 612.741.001.6
А. М. Фархутдинов, А. Ю. Теплое
МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ЭКЗОГЕННОЙ АТФ НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦ МЫШИ
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Введение. Известно, что стрессовая реакция способна изменять модулирующее действие АТФ (аденозин-5’-три-фосфорной кислоты) на параметры сокращения поперечно-полосатых мышц теплокровных животных [6, 7]. Ранее нами изучалась возможность влияния пуринов на дыхательные мышцы. На полосках диафрагмы мыши было показано, что экзогенная АТФ способна обратимо изменять характеристики ее сокращения на холиномиметик — карбахолин (Кх) [3, 5]. В качестве возможного объяснения механизмов обнаруженного эффекта мы предположили влияние АТФ на холиноопо-средованные процессы возбуждения мышечных волокон (МВ). Принимая во внимание сложное строение диафрагмы, она является «смешанной» мышцей, было предложено расширить это исследование, изучив влияние АТФ на функциональные характеристики «быстрой» и «медленной» скелетных мышц (СМ).
Целью настоящей работы явилось выявление роли холиноопосредованных процессов возбуждения в механизмах влияния АТФ на различные поперечно-полосатые мышцы. Исследовалось влияние экзогенной АТФ на: 1) параметры сократительного ответа СМ, вызываемого холиномиметиком Кх и 2) уровень неквантовой секреции ацетилхо-лина (Ах) в зоне концевой пластинки.
Материалы и методы. Эксперименты проводились на белых мышах обоего пола, массой тела 17-22 г. В эксперимент животное забиралось под вводным наркозом, который достигался посредством внутрибрюшного введения раствора нембутала (эта-минал натрия; из расчета 5 мкг сухого вещества на 100 г животного, разведенного водой для инъекций). Эвтаназию проводили кровопусканием с соблюдением Правил проведения работ на экспериментальных животных. У животных забирались три мышцы. Посредством торакотомии — диафрагма (m. diaphragma), припаровки голени: «быстрая»— длинный разгибатель пальцев (m. extensor digitorum longus — m.EDL) и «медленная» — камбаловидная (m. soleus) мышцы.
Изучение функционального состояния СМ проводилось двумя методами. В первом изучалось сокращение СМ, которое вызывалось агонистом — холиномиметиком Кх. Ме-ханомиографические исследования проводились на препарате изолированной мышцы в условиях изометрии. Изометрический режим достигался предварительным растяже-
© А. М. Фархутдинов, А. Ю.Теплов, 2010
нием препарата мышцы в ванночке в течение 20 минут с силой 0,5 г при постоянной перфузии раствором типа Кребса и температуре 20-21°С. Сокращение СМ регистрировалось фотоэлетрическим преобразователем [1]. Агонист Кх добавлялся в ванночку при остановленной перфузии, с 30 минутными интервалами, в субмаксимальной концентрации (2 • 10-4 М для диафрагмы, 5 • 10-4 М для камбаловидной и 7 • 10-4 М для длинного разгибателя пальцев). Детально условия регистрации сокращения на Кх «быстрой» и «медленной» мышц голени мыши iv vitro описаны нами ранее [4]. Между сокращениями СМ отмывалась чистым перфузионным раствором. Оценка сократительной реакции велась по комплексу сократительных параметров, включающему в себя время развития максимального напряжения (СТ), силу (Рос) и скорость (Уос) сокращения, которая определялась отношением Рос/СТ. Влияние АТФ на СМ оценивали по различиям сократительных характеристик до и после 5 минутной инкубации ткани с этим агентом в концентрации 1 • 10-4 М.
Вторая экспериментальная методика позволяла изучать влияние АТФ на состояние постсинаптической мембраны МВ в области концевой пластинки [11]. Неквантовую секрецию Ах измеряли с помощью стеклянных микроэлектродов (сопротивлением 8-12 М£, заполненных 2,5 М KCl). Для определения ее величины сначала армином устранялось действие ацетилхолинэстеразы, после чего на мышцу в течении 8-12 минут апплицировался блокатор Н-холинорецепторов d-тубокурарин (10-5М). Разница значений мембранного потенциала (МП) до и после аппликации d-тубокурарина соответствует величине неквантовой секреции Ах (Н-эффект). Влияние АТФ на состояние постсинаптической мембраны МВ определяли по разнице значений Н-эффекта до и после 5 минутной перфузии мышцы с этим веществом в концентрации 1 • 10-4 М.
Результаты анализировались путем сравнения данных, полученных на мышцах без АТФ (контроль) и с инкубацией АТФ (опыт). Статистическая обработка велась с использованием параметрического критерия Стьюдента.
Результаты. Параметры сокращения изолированных мышц на Кх в субмаксимальной концентрации до (контроль) и после (опыт) их инкубации с АТФ представлены в табл. 1-3.
Таблица 1. Параметры сокращения (Х±Эх) изолированных полосок m.diaphragma мыши на Кх (2 • 10-4 М) до (контроль) и после (опыт) 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкЫ)
(п = 10) СТ (сек) Рос (мг) Voc (мг/сек)
Контроль 10,7+1,1 335,2+93,4 25,6+5,6
Опыт 7,3+0,5 426,2+110,0 47,8+8,0
р * *** **
% 68% 126,8% 187%
Примечание: СТ — время развития максимального напряжения; Рос — сила сокращения; Уос — скорость сокращения; * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.
Показано, что у диафрагмальной мышцы мыши Кх в субмаксимальной концентрации (2 • 10-4М) вызывал сокращение силой 335,2±93,4 мг и скоростью 25,6±5,6 мг/сек. Предварительная инкубация мышцы с АТФ приводила к увеличению силы и скорости сокращения.
Изучение неквантовой секреции Ах в МВ «смешанной» показало, что МП покоя, изначально составляющий — 71,0±1,9 мВ (п = 102), в присутствии ТБК возрастал до
Таблица 2. Параметры сокращения (Х±Эх) изолированных полосок ш.БОЬ мыши на КХ (7 • 10-4 М) до (контроль) и после (опыт) 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкЫ)
(п = 8) СТ (сек) Рос (мг) Voc (мг/сек)
Контроль 4,25±0,39 75,2±5,43 17,9±0,69
Опыт 1,88 ±0,18 52,4±5,8 29,2±1,48
р *** *** ***
% 44,2% 69,7% 163,1%
Примечание: СТ — время развития максимального напряжения; Рос — сила сокращения; Уос— скорость сокращения; * р < 0,05; **р< 0,01; *** р < 0,001.
Таблица 3. Параметры сокращения (Х±вх) изолированных полосок m.soleus мыши на КХ (5 • 10-4 М) до (контроль) и после (опыт) 5-минутной инкубации ее с АТФ (100 мкЫ)
(п = 8) СТ (сек) Рос (мг) Voc (мг/сек)
Контроль 11,1 ±0,9 185,4±7,4 17,1±0,9
Опыт 8,8±0,5 232,6±10,2 26,9±1,7
р ** *** ***
% 77.9% 125,5% 157,3%
Примечание: СТ — время развития максимального напряжения; Рос — сила сокращения; Voc — скорость сокращения; * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.
-75,9±0,7 мВ (n = 102). Динамика МП указывает, что Н-эффект в контроле составлял 4,9±0,3 мВ. АТФ вызвала снижение этого показателя до 1,5±0,5 мВ (р < 0,05).
В экспериментах, выполненных на длинном разгибателе пальцев, обнаружено, что Кх в субмаксимальной концентрации (7 • 10-4М) вызывал сокращение силой 72,5±19,5 мг и скоростью 17,9±3,1 мг/сек. Инкубация с АТФ приводила к уменьшению силы и увеличению скорости сокращения.
Изучение неквантовой секреции Ах в МВ «быстрой» мышцы продемонстрировало, что МП покоя, изначально составляющий -72,3±0,6 мВ (n = 85), в присутствии ТБК возрастал до -77,8±1,6 мВ (n = 85). Следовательно, Н-эффект в контроле составлял 5,5±0,6 мВ (n = 85). После влияния АТФ этот показатель достоверно не изменялся, составляя в описанных условиях эксперимента 5,7±0,9 мВ (n = 72).
На камбаловидной мышце было установлено, что Кх в субмаксимальной концентрации (5 • 10-4М) вызывал сокращение силой 180,5±6,8 мг и скоростью 16,6±1,3 мг/сек. Инкубация с АТФ приводила к увеличению силы сократительного ответа и его скорости.
Изучение неквантовой секреции Ах в МВ «медленной» мышцы показало, что МП покоя, изначально составляющий-70,9±1,7 мВ (n = 160), в присутствии ТБК возрастал до -75,9±1,3 мВ (n = 160). Динамика МП указывает, что Н-эффект в контроле составлял 5,0±0,7 мВ. АТФ вызвала снижение этого показателя до 1,0±0,5 мВ (р < 0,05).
Применение аденозина в той же концентрации, что и АТФ, не изменяло сократительных свойств всех исследованных СМ и не влияло на неквантовую секрецию Ах.
Обсуждение. Анализ результатов исследования выявил механизмы, определяющие изменение сократительной функции поперечно-полосатых мышц in vitro при влиянии экзогенной АТФ. В характере изменений силового показателя для различных мышц наблюдаются принципиальные различия, как количественные, так и по направленности. У «медленной» и «смешанной» сила сокращения возрастает (рис. 1А, 3А). У
«быстрой» —снижается (рис. 2А). Сила сокращения в нашей экспериментальной модели зависит в первую очередь от чувствительности СМ к холиномиметику [2]. По этой причине для объяснения механизмов обнаруженных изменений было изучено влияние экзогенной АТФ на неквантовую секрецию Ах в области концевой пластинки. Показано, что у различных мышц АТФ по-разному изменяет этот показатель. У «медленной» и «смешанной» неквантовая секреция Ах снижается (рис. 1Б, 3Б), у «быстрой» —остается без изменений (рис.2Б).
500
450
400
350
300 МГ 250
200
150
100
50
0
А Б
Рис. 1. Функциональные характеристики изолированной полоски диафрагмы мыши до (1) и после (2) влияния АТФ (1 • 10-4 М, 5 минут):
А) сила сокращения, вызванного КХ (2 • 10-4 М) (n = 10); Б) величина Н эффекта (n = 102)
Характер изменений обоих показателей у двух первых мышц (рис. 1, 3) позволяет утверждать, что увеличение силы сокращения на Кх является следствием повышения чувствительности постсинаптической мембраны к холиномиметику. У «быстрой» же мышцы снижение силы сокращения не связано с изменением величины Н-эффекта (рис. 2).
Причина различий в функциональных сдвигах может определяться волоконным составом СМ. Как известно, m.soleus мыши содержит 50-60% «медленных» МВ, m.EDL на 97-100% состоит из «быстрых» [10]. M. diaphragma мыши, занимающая промежуточное положение, содержит 88,6% быстрого миозина [8]. Изменение силы предположительно является следствием изменения чувствительности МВ к Кх, что может находиться в прямой зависимости от площади синаптического образования. Размеры концевой пластинки у m.soleus в 3 раза протяженнее, чем у m.EDL [9]. На первый взгляд, это и определяет чувствительность к экзогенной АТФ по уровню неквантовой секреции Ах у «медленной» и «смешанной» мышц и отсутствие таковой у «быстрой». Однако нам представляется маловероятным, что функциональные, к тому же обратимые, сдвиги являются следствием исключительно морфологических, структурных констант СМ. Скорее, в основе обнаруженных изменений у мышц с различным фенотипом лежат функциональные свойства их холиновозбудимых мембран, определяемые, например,
Рис. 2. Функциональные характеристики изолированной ш.ЕЮЬ мыши до (1) и после (2) влияния АТФ (1 • 10-4 М, 5 минут):
А) сила сокращения, вызванного КХ (7 • 10-4 М) (п = 8); Б) величина Н эффекта (п = 72)
Рис. 3. Функциональные характеристики изолированной ш.во1еив мыши до (1) и после (2) влияния АТФ (1 • 10-4 М, 5 минут):
А) сила сокращения, вызванного КХ (5 • 10-4 М) (п = 8); Б) величина Н эффекта (п = 160)
различиями в механизмах выделения кофакторов синаптической передачи (одним из которых и является АТФ).
В противоположность разнонаправленности изменений силы скорость сокращения у всех мышц возрастает: до 187% от контроля у диафрагмы (р < 0,01), 163% —длинного разгибателя пальцев (р < 0,05) и 170% у камбаловидной мышцы (р < 0,01). Этот показатель определяется либо динамикой Са-зависимых процессов возбуждения СМ [12], либо функцией иных внутриклеточных посредников [3]. Вектор изменений скорости свидетельствует об отсутствии принципиальных различий у всех трех мышц в характере работы механизмов внутриклеточной передачи, вызванной пуринами.
Подводя итоги, можно заключить следующее. Во-первых, изменения контрактиль-ных характеристик поперечно-полосатых мышц мыши после действия экзогенной АТФ обусловлены рядом причин. Во-вторых, обнаружены механизмы, определяющие различия реакции на АТФ у разных мышц. Если увеличение скорости, определяемое предположительно Са-зависимыми механизмами для всех исследованных мышц носят однонаправленный характер, то в холиноопосредованных процессах возбуждения у разных СМ имеются существенные различия. Для «медленной» и «смешанной» мышц вектор изменения силы кореллирует с изменением Н-эффекта (рис. 1, 3). В данном случае вариабельность сократительной функции обусловлена, в первую очередь, динамикой холиноопосредованных процессов возбуждения мембраны МВ. Увеличение силы сокращения в нашей экспериментальной модели является следствием возрастания чувствительности постсинаптической мембраны к холиномиметику и обусловлено снижением неквантовой секреции Ах в зоне концевой пластинки — уменьшение механизмов десен-ситизации холинорецепторов. У «быстрой» мышцы, волокна которой обладают гораздо меньшей площадью синаптического соединения, снижение силы не связано с изменениями Н-эффекта (рис. 2). Раскрытие причин обнаруженного факта требует проведения дальнейших исследований.
Выводы.
1. Экзогенная АТФ изменяет сократительную функцию изолированных поперечнополосатых мышц мыши. Сила сокращения на карбахолин у «медленной» и «смешанной» мышц возрастает, у «быстрой» — снижается.
2. Увеличение силы сокращения полоски m.diaphragma и изолированной m.soleus мыши на карбахолин, вызываемое экзогенной АТФ является следствием увеличения чувствительности мышечной мембраны к холиномиметику, обусловленного снижением неквантовой секреции ацетилхолина в зоне концевой пластинки.
Литература
1. Ахметзянов Р. Х. Измерение силовых характеристик мышечных волокон с помощью фотоэлектрического преобразователя / Р. Х. Ахметзянов, Е. Б. Филиппов // Физиол. ж. СССР. 1986. Т. 72 (3). С. 387-390.
2. Наследов Г. А. Тоническая мышечная система позвоночных. Л.: Наука, 1981. 187 с.
3. Роль протеинкиназы С в механизмах влияния АТФ на сократительную функцию изолированной полоски диафрагмы мыши / А. Ю. Теплов, С. Н. Гришин, А. Л. Зефиров, А. У. Зи-ганшин // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2006. №4. С. 389-392.
4. Теплов А. Ю. Влияние белковой сенсибилизации на сократительные свойства «быстрых» и «медленных» мышц мыши in vitro // Нижегородский медицинский журнал. 2006. №3. С. 2124.
5. ATP influence on mechanisms of the contraction and reception of mediator in mouse diaphragm muscle / A. Teplov, S. Grishin, A. Deviataev, A. Zefirov // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 2003. №4-6 (Vol. 24). P. 332.
6. Burnstock G. Cellular distribution and functions of P2 receptor subtypes in different systems / G. Burnstock, G.E. Knight // Int Rev Cytol. 2004. №240. P. 31-304.
7. Burnstock G. Introduction: P2 receptors // Curr Top Med Chem. 2004. №4 (8). P. 793-803.
8. Blank S. Biochemical characteristics of mammalian diaphragms / S. Blank, V. Chen, C. D. Ianuzzo // Respir Physiol. 1988. №74 (1). P. 115-25.
9. Fahim M. A. Topographic comparison of neuromuscular junctions in mouse «slow» and «fast» twitch muscles / M. A. Fahim, J. A. Holley, N. Robbins // Neuroscience. 1984. №13 (1). P. 227-235.
10. Florendo J. A. Electrophysiologic differences between mouse extensor digitorum longus and soleus / J. A. Florendo, J. F. Reger // Exp Neurol. 1983. №82 (2). P. 404-412.
11. Galkin A. V. ATP but not adenosine inhibits nonquantal acetylcholine release at the mouse neuromuscular junction // Eur. J. Neurosci. 2001. №13(11). P. 2047-2053.
12. Hood D. A. Coordination of metabolic plasticity in skeletal muscle / D. A. Hood, I. Irrcher, V. Ljubicic, A.M. Joseph // J. Exp. Biol. 2006. №209 (Pt 12). P. 2265-2275.
Статья поступила в редакцию 22 января 2010 г.
