CC BY
1370
Лабораторная диагностика
Лайм-боррелиоза
на современном этапе
Тимофеева Е.В.,
младший научный сотрудник клинико-диагностической лаборатории РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск
Дракина С.А.,
кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, заведующая клинико-диагностической лабораторией РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск
Орлова С.В., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории доклинического изучения специфической активности ингибиторов вирусов РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск
Timofeeva E.V., Drakina S.A., Orlova S.V.
Republican Scientific Practical Centre of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus
Laboratory diagnosis of Lyme borreliosis
at the present stage
Резюме. В обзоре представлены методы диагностики Лайм-боррелиоза, приведены достоинства и недостатки каждого из них, а также значимость маркёров в зависимости от стадий заболевания. Изложены стандарты диагностики согласно международным рекомендациям.
Ключевые слова: Лайм-боррелиоз, лабораторная диагностика, иммуноблоттинг, полимеразная цепная реакция, серологические методы, непрямая реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ. Summary. In this paper presents methods of diagnosis Lyme borreliosis, are the advantages and disadvantages of each, as well as the importance of markers, depending on the stages of the disease. In this review we set out standards of diagnostics in accordance with international recommendations.
Keywords: Lyme borreliosis, laboratory diagnostics, Western-blot, polymerase chain reaction, serological methods, indirect immunofluorescence, enzyme-linked immunosorbant assay.
Лайм-боррелиоз (ЛБ) - это полиорганное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетой B. burgdorferi sensu lato и передаваемое трансмиссивным путем через иксодовых клещей. B. burgdorferi sensu lato представляет собой комплекс бактерий [35], включающий более 10 геновидов борре-лий. Не все боррелии данного комплекса являются патогенными для человека, доказана патогенность трех геновидов: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii [23].
Картина болезни Лайма описывалась рядом исследователей, начиная с 1883 г. Но лишь в 1977 г., когда были выявлены случаи развития артрита после предшествующей эритемы у группы детей в городе Лайм (штат Коннектикут, США), - заболевание получило свое название и было установлено, что оно вызывается неизвестной спирохетой.
В 1982 г. эта спирохета была выделена у иксодового клеща и ее назвали B. Burgdorferi. Впоследствии она обнаруживалась у больных ЛБ как в США, так и в Европе. Заболевание регистрируется более чем в 40 штатах Северной Америки, почти во всех странах Европы и Азии [32, 33].
Для Беларуси болезнь Лайма до недавнего времени представляла собой новую, практически неизученную форму инфекционной патологии. Проведенные в 1994-1996 гг. исследования по изучению иммунной прослойки населения Беларуси к возбудителям ЛБ в совокупности с определением естественной зараженности боррелиями основных переносчиков заболевания (клещей Ixodes ricinus [4]) позволили доказать наличие эпидемиологически активных природных очагов данной инфекции практически во всех областях республики. Первый в Беларуси
случай Лайм-боррелиоза был выявлен в 1993 г. у жительницы города Минска на основании клинико-эпидемиологических данных и результатов серологического анализа [5].
Клинически заболевание протекает с преимущественным поражением кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой системы и характеризуется склонностью к хроническому либо латентному течению инфекции [6, 21].
Клиническое течение ЛБ разделяют на три стадии:
1. Стадия локальной инфекции с развитием патологического процесса в месте внедрения возбудителей, для которой характерны мигрирующая эритема (МЭ) и боррелиозная лимфоцитома (БорЛ); развивается в течение дней-недель после укуса клеща;
2. Стадия диссеминации (распространения) боррелий от места их первичного
внедрения. Различают раннюю диссе-минированную стадию - недели-месяцы после укуса клеща, позднюю - месяцы-годы после укуса. К ранней относят множественную МЭ, ранний нейроборрелиоз (НБ) и лайм-кардит, к поздней - поздний НБ, хронический атрофический акродер-матит (ХАА);
3. Стадия органных поражений как результат длительного патологического воздействия возбудителей.
Разделение на стадии условно и во многом основывается на клинических проявлениях, а также временных характеристиках от момента инфицирования. Заболевание может переходить последовательно из одной стадии в другую или миновать какую-либо из них, а также впервые проявляться в любой стадии без наличия предшествующей. Известны случаи наложения стадий [31]. По уровню заболеваемости и тяжести клинического течения Лайм-боррелиоз представляет собой одну из актуальных проблем современной инфекционной патологии [2, 10, 27, 30].
Диагноз Лайм-боррелиоза может рассматриваться как достоверный при наличии следующих критериев:
- клинические симптомы, типичные для Лайм-боррелиоза или совместимые с ним: мигрирующая эритема, боррелиоз-ная лимфоцитома, хронический атрофи-ческий акродерматит; менингополинев-рит, миелит, энцефалит; перимиокардит, кардиомиопатия, кератит, увеит, папил-лит, панофтальмия; артрит (артралгия), энтезопатия; миозит (миалгия); гепатит;
- доказательство инфекции Borrelia burgdorferi (IgG, IgM, IgA);
- исключение заболеваний со сходными симптомами.
Необходимо наличие всех трех критериев [1].
В связи с разнообразием клинических проявлений ЛБ для диагностики используется широкий круг лабораторных тестов. Диагностическая ценность тестов различная и зависит как от особенностей самого теста, так и от применения его в определенные периоды заболевания.
Наиболее специфичными считаются методы, прямо выявляющие возбудитель: культивирование на питательных средах, обнаружение боррелии с помощью световой (в том числе маркирование специфическими моноклональными антителами) или электронной микроскопии. Однако ввиду их низкой диагностической ценности, обусловленной небольшой плотностью спирохет в клинических образцах, и затратности (культуральные методы) широкого применения в практической
медицине они не нашли. Метод темно-польной микроскопии применяется для определения спонтанной инфицирован-ности клещей боррелиями. В настоящее время применяется молекулярно-вирусо-логический метод полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения специфической ДНК. Для подтверждения диагноза наряду с ПЦр используются и серологические методы на выявление антител к бор-релии. Результативность диагностических тестов зависит от используемого антигена (геновида), от формы и стадии болезни, от предшествующего лечения антибиотиками. На практике наиболее доступны им-муноферментный (ИФА), метод непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ), а также иммуноблоттинг (ИБ) [22].
Полимеразная цепная реакция. Метод ПЦР очень чувствительный и теоретически позволяет установить присутствие нескольких единичных молекул ДНК или РНК микроорганизма в анализируемом биологическом образце. Использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной Borrelia burgdorferi sensu lato, становится общепризнанным [28].
Только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи:
1) проводить диагностику острой инфекции при позднем появлении антител к Borrelia burgdorferi;
2) осуществлять этиологическую диагностику клещевого боррелиоза у иммуно-супрессированных пациентов;
3) оценивать эффективность противо-бактериальной терапии;
4) оценивать широту распространения клещевого боррелиоза.
Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения Лайм-боррелиоза представляет по следующим причинам: а) способ культивирования культур сложный и трудоемкий; б) наборов для антигенной диагностики не существует; в) реакция образования антител к возбудителю замедлена, и определение их возможно уже в стадии разгара болезни.
Применение метода ПЦР
для диагностики Лайм-боррелиоза
При проведении ПЦР в качестве мишеней используются различные геномные локусы боррелий. На сегодняшний день полностью известна структура генома одного штамма боррелий американского происхождения - B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), который и является референс-штаммом всей группы Borrelia burgdorferi. Однако генетическая структура одних и тех же генных локусов
у различных геновидов боррелий отличается большой степенью их гетерогенности. Это обстоятельство накладывает определенные ограничения на выбор мишени для ПЦР и, следовательно, на подбор праймеров такой структуры, которая гарантировала бы исключительную специфичность не только в отношении всего комплекса B. Burgdorferis.l., но и возможность их идентификации до геновида [14].
Метод ПЦР для диагностики борре-лиоза не унифицирован. Для получения большей достоверности результатов желательно использование нескольких диагностических ПЦР-систем. В клинической диагностике ЛБ использование метода ПЦР целесообразно по нескольким причинам. Во-первых, он позволяет определять наличие ДНК боррелий в различном биологическом материале: клещ, кожный биоптат, кровь, моча, цереброспинальная и суставная жидкости и др. Высокая чувствительность этого метода позволяет определять инфици-рованность пациента на 7-14-й день от момента присасывания клеща, часто еще в инкубационном периоде. Таким образом, реализуется возможность раннего лабораторного подтверждения диагноза боррелиоза. Во-вторых, ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель до геновида, осуществлять диагностику боррелиозных микст-инфекций, выявлять случаи повторных заражений, проводить контроль эффективности терапии по элиминации возбудителя и в отношении разных геновидов боррелий.
Оптимально проведение контрольного исследования через месяц после окончания лечения. За это время в случае эффективной терапии ДНК и РНК боррелий полностью выводятся из организма человека.
Серологические методы диагностики
Лайм-боррелиоза
Серологические методы диагностики Лайм-боррелиоза направлены на определение наличия и концентрации специфических антител в организме больного. Лабораторные тесты по выявлению антител к возбудителям благодаря своей надежности, доступности и относительной простоте в техническом выполнении остаются методами выбора в диагностике боррелиоза.
Наряду с такими традиционно классическими тестами, как непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ), используются и относительно новые методы - иммуноферментный анализ и им-муноблоттинг. Специфичность и чувствительность всех этих тестов различная, что
вызывает необходимость их использования в комбинации.
На конечный результат при каждом серологическом исследовании до известной степени влияют особенности течения заболевания и выраженность антительного ответа у конкретного больного. Знания закономерностей антительного ответа на иммунодоминантные антигены боррелий необходимы для оценки результатов серологических исследований.
Антитела у больных ЛБ обнаруживаются обычно на 3-6-й неделе от начала заболевания. Образование иммуноглобулинов класса М предшествует появлению 1дЭ. В редких случаях появление 1дМ отсрочено или они вообще не обнаруживаются на всем протяжении заболевания. Поэтому на ранних стадиях ЛБ часто регистрируются ложноотрицатель-ные результаты. Уровень антител в крови больных повышается медленно, - в этом состоит особенность боррелиозной инфекции. Низкая чувствительность серологических тестов не позволяет выявить их количество. В острой стадии у пациентов с мигрирующей эритемой антитела обнаруживаются в 20-80% случаев, в зависимости от используемого серологического теста и длительности болезни. При безэритемной форме положительные результаты серологических тестов наблюдаются несколько чаще. По мере прогрессирования заболевания возрастает число сероположительных результатов исследований (1дМ могут быть обнаружены почти в 90% случаев, 1дв - в 70%). Наиболее активно антитела класса 1дв вырабатываются при диссеми-нации возбудителей, а также у пациентов с хроническим течением ЛБ.
Важным условием серологического обнаружения антител является способность иммунной системы больного адекватно отвечать на антигенный раздражитель. Отдельные случаи серонегативного ЛБ у больных с прогрессирующим течением заболевания и определенными клиническими проявлениями боррелиоза во многом обусловлены состоянием имму-носупрессии этих пациентов.
Непрямая реакция
иммунофлюоресценции (НРИФ)
НРИФ широко используется, оставаясь наиболее дешевым и доступным для широкого круга медицинских учреждений методом, не требующим особого оснащения лабораторий для его проведения. Однако НРИФ, как и другие серологические тесты, не всегда способен верифицировать диагноз из-за сложного имму-нопатогенеза при боррелиозах.
В ходе реакции специфические антитела регистрируются в виде комплексов (антиген + специфическое антитело + сыворотка против глобулинов человека, меченная флюоресцином), которые фиксируются на корпускулярном антигене и светятся в ультрафиолетовых лучах. Визуализацию комплекса «антиген-антитело» осуществляют с помощью иммуно-флюоресцентной антисыворотки против иммуноглобулинов человека и с учетом результатов анализа в люминесцентном микроскопе [13]. Для исследования пригодны сыворотка крови, ликвор, внутрисуставная жидкость. Использование поливалентных (против всех классов иммуноглобулинов) или специфических (против определенных классов иммуноглобулинов) антисывороток, меченных ФИТЦ, позволяет определять как общее количество специфических антител, так и антител определенных классов. Одновременное применение меченных флю-оресцином сывороток против 1дв и 1дМ повышает частоту обнаружения специфических антител незначительно (на 2-3%).
Чувствительность этой серологической реакции составляет 40-50% при специфичности 96-98% (по некоторым данным, до 80%). Такой уровень специфичности НРИФ позволяет принимать за положительный результат разведение сыворотки 1:40 и выше.
В качестве антигенов для НРИФ можно применять различные геновиды боррелий, относящихся к комплексу В. Burgdorferi е.!.
Получение положительных результатов НРИФ во многом зависит от сроков заболевания. В первые 2-4 недели болезни у пациентов с мигрирующей эритемой подтвердить диагноз серологически удается только у трети больных. В последующие 1-3 месяца - еще примерно у 30%. Таким образом, при исследовании парных сывороток больных и переболевших, взятых с интервалом не менее 30 дней, ретроспективно удается подтвердить ЛБ в 60-70% случаев. Диагноз безэритемной формы ЛБ всегда требует лабораторного, в том числе и серологического, подтверждения, однако, учитывая особенности иммуногенеза при этом заболевании (отсроченное по времени нарастание титров антител), в ранние сроки заболевания (конец первого месяца) диагноз можно подтвердить приблизительно в 50% случаев, протекающих без эритемы.
С помощью данного теста сложно оценить эффективность проведенного этиотропного лечения, поскольку даже
после элиминации возбудителей титры специфических антител сохраняются на прежнем уровне относительно долго (от 3 до 6 месяцев). Часто у переболевших, у которых в начале заболевания результат НРИФ расценивался как отрицательный, затем регистрируется нарастание титров антител, что не связано с персистенцией возбудителей, а является результатом запаздывания иммунного ответа.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Использование для ИФА очищенных антигенов боррелий, а также рекомби-нантных антигенов обусловливает высокую степень специфичности теста.
ИФА имеет некоторое преимущество перед НРИФ, заключающееся в большей его чувствительности и возможности объективной оценки полученных результатов. Однако ИФА, выигрывая в чувствительности у НРИФ, проигрывает ей в специфичности. Таким образом, именно эти реакции (НРИФ и ИФА) являются методами выбора для первого этапа пошаговой серологической диагностики ЛБ. [23]
Один из путей совершенствования лабораторной диагностики - разновидность ИФА для определения специфических иммуноглобулинов класса IgM и IgG, связанных в иммунных комплексах с антигенами боррелий [9, 34]. В отличие от «традиционного» ИФА, в данном случае проводится предварительная обработка исследуемого материала (обычно сыворотки крови или ликвора) с целью «высвобождения» специфических иммуноглобулинов класса IgM и IgG из соответствующих иммунных комплексов. Метод имеет широкие перспективы для диагностики на ранних стадиях заболевания, так как чувствительность и специфичность его достигает 98% [16].
Метод иммуноблоттинга
(Western-blot)
В качестве подтверждающего теста при серологической диагностике клещевых боррелиозов используют метод иммунноблоттинга (ИБ) с «нативными» цельноклеточными лизатами или реком-бинантными антигенами боррелий [8, 23]. Данный метод позволяет определить спектр специфических антител, синтезируемых у обследованного больного к различным антигенам боррелий.
Гуморальный иммунный ответ человека на боррелиозную инфекцию может быть представлен антителами к более чем 20 антигенам B.burgdorferi. При этом часть иммунодоминантных белков бор-релий кодируется генами хромосомы, например белки р83/100, р73, р66, р60, р58, флагеллин (р41), ВтрА (р39); дру-
гие - генами внехромосомных плазмид: Osp А, Osp В, Osp С, Osp Е, Osp I Osp 17, Vis E, р30 и р21. Состав белков-антигенов и их соотношение могут значительно отличаться не только среди боррелий разных геновидов (у которых гетерогенность ряда поверхностных белков достигает 40%), но также в изолятах одного геновида [18, 19]. Кроме того, как показано выше, в процессе развития инфекции у B. burgdorferi значительно изменяется уровень экспрессии некоторых иммуно-доминантных липопротеинов. Поэтому спектр специфичности антител у инфицированных пациентов может варьировать в зависимости от геновида возбудителя, а также и у одного больного на разных стадиях заболевания ЛБ [29,37]. Так, на I стадии ЛБ в организме больных появляются иммуноглобулины класса М против фла-геллина, Оsр С и Vis E [21, 33, 36]. Обнаружение в крови обследуемых пациентов антител к B. burgdorferi не обязательно сопровождается клинической манифестацией ЛБ, и наоборот - у 30% больных боррелиозом с кольцевой мигрирующей эритемой специфические IgM на первой стадии ЛБ могут не определяться. При нейроборрелиозах в 80% случаев антитела в спинномозговой жидкости больных появляются через 2 недели после укуса клеща, в 100% случаев - после 7 недель. При этом тест на наличие антител в крови больного может быть отрицательным [17].
На II стадии боррелиоза IgM к антигенам B. burgdorferi у инфицированных лиц постепенно замещаются на иммуноглобулины класса G. Максимальное количество специфических IgG синтезируется, как правило, через 1,5-3 месяца после инфицирования, а к концу II стадии они доминируют в иммунном ответе.
По мере развития заболевания расширяется спектр антител человека к антигенам возбудителя, IgG на II стадии ЛБ продуцируются как к приведенным выше белкам (флагеллину, Оsр С и Vis E), так и новым: р39, р58, р60, р66, р75 [7, 26, 36]. У некоторых больных IgM к белку Оsр С могут определяться в крови в течение нескольких месяцев.
На III стадии боррелиоза иммунный ответ характеризуется еще более широким спектром специфичности продуцируемых антител. В этот период более 80% синтезируемых иммуноглобулинов класса G реагируют с белками р83/100, р58, р43, р39, р30, р21, Оsр17 и р14 [19]. Вместе с тем антитела к белку ОsрС обнаруживаются очень редко, поскольку экспрессия этого липопротеина при хронизации заболевания значительно снижена [12].
Как показано рядом авторов, наиболее важные иммунодоминантные белки, имеющие диагностическое значение при БЛ - белки 17-19, 23 (Оэр С), 30, 31 (Оэр А), 34 (Оэр В), 39, 41 (флагеллин), 83 и 94 [1, 3, 7, 15, 17, 20]. Белки 55, 60, 66 и 73 kDa, чаще проявляющие перекрестную реактивность с другими спирохетами и даже более отдаленно родственными микроорганизмами, считаются неспецифическими и при интерпретации результатов учитываются реже [25].
В связи с вышеизложенным, имму-ноблоттинг представляет собой высокоинформативный метод обнаружения антител, обладающий более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими [38]. С целью повышения диагностической точности Американский центр контроля болезней предложил проверять положительные или пограничные результаты скрининговых тестов с помощью иммуноблоттинга, используя стандартизированные критерии серопозитивности метода [15]
Согласно этим рекомендациям, серологическое тестирование на болезнь Лайма считается положительным, если в одной сыворотке как скрининговый метод, так и ИБ дали положительные результаты. Особое значение имеет оценка результатов или критериев серопозитив-ности в данном методе. В США, где распространен один геновид возбудителя, для воспроизводимости и точности оценки результатов рекомендован стандартный набор антигенов, содержащихся в наиболее распространенных штаммах боррелий. В других регионах Северного полушария разработка адекватных критериев оценки ИБ пока не привела к заметным успехам, поскольку антигенная гетерогенность циркулирующих изолятов боррелий существенно отражается на результатах ИБ. Европейским исследователям не удается создать единое «интерпретационное правило» для оценки ИБ, которое имело бы достаточный уровень чувствительности и специфичности.
Единых критериев интерпретации результатов иммуноблоттинга при диагностике ЛБ не разработано [3, 11]
Обнаружение специфических антител в ликворе и других биологических жидкостях У 60-90% больных с поражениями центральной нервной системы при ЛБ специфические антитела могут определяться в ликворе. Однако их обнаружение не является решающим фактором для подтверждения боррелиозного поражения центральной нервной системы, по-
скольку антитела могут проникать в суб-арахноидальное пространство из крови. Для выяснения причастности боррелий к клинической симптоматике нарушений ЦНС необходимо выяснить наличие синтеза антител к боррелиям, обусловленное существующим патологическим процессом. При боррелиозном поражении нервной системы приблизительно в 60% случаев происходит местный синтез 1дМ и 1дв глиальной тканью. Крайне редко в цереброспинальной жидкости у больных с ЛБ обнаруживается изолированное продуцирование 1дМ. Для выявления специфических антител в ликворе обычно используют НРИФ или ИФА, но предпочтение отдается иммуноблоттингу. [20] Количество антител в субарахноидаль-ном пространстве зависит от их величины в сыворотке крови, проницаемости гема-тоэнцефалического барьера и пропорции интратекального синтеза.
Иммуноблоттинг может использоваться в тех случаях, когда наблюдается выравнивание концентраций специфических антител в ликворе и сыворотке крови. Определение широкого спектра антител в ликворе, специфичных к разным белкам боррелий, отсутствие некоторых из них при исследовании сыворотки крови свидетельствует о преимущественно интратекальном синтезе антител.
Серологические исследования лик-вора при ЛБ необходимо оценивать совместно с результатами других исследований цереброспинальной жидкости (цитологических, биохимических и т.д.).
Подобный подход можно использовать у больных ЛБ с поражением других органов и систем, например при поражениях опорно-двигательного аппарата (исследование внутрисуставной жидкости).
Интерпретация результатов
серологической диагностики ЛБ
Лабораторная (микробиологическая) диагностика ЛБ, в том числе серологическая, преследует несколько целей:
1) верификация боррелиозной инфекции;
2) первичное или повторное заболевание в пределах одного эпидсезона (рецидив заболевания или повторное заражение);
3) определение длительности заболевания и активности инфекционного процесса (при хроническом течении);
4) установление этиологического диагноза (определение геновида боррелий).
Из всех серологических диагностических тестов только иммуноблоттинг может дать наиболее исчерпывающие ответы на поставленные выше вопросы.
Именно с помощью данного исследования можно выявить специфические антитела к определенным белкам борре-лий. Выявление IgM, а также IgG к фла-геллину (p41 и его фракции p41i), Osp C свидетельствует об относительно небольшом промежутке времени, прошедшем с момента инфицирования (ранняя стадия ЛБ). Выявление широкого спектра антител к антигенам (p83/100, p75, Oms66/ p66, Osp A, BmpA/p39, p18, p21) свидетельствует о продолжительном периоде времени, прошедшем с момента инфицирования (даже в случаях бессимптомного течения заболевания).
Случаи, когда после проведенного лечения и выписки из стационара у пациента вновь выявляются признаки ЛБ на фоне повышенного содержания IgM и IgG (к флагеллину), следует расценивать как случаи повторного заражения. Данный метод позволяет провести дифференциальную диагностику между антительным ответом на специфичные и неспецифичные белки боррелий. С помощью данного метода невозможно идентифицировать геновид бор-релий, которым обусловлены особенности клинической картины заболевания.
Всегда следует помнить о возможности получения в серологических тестах ложно-отрицательных или ложноположительных результатов исследования. Ложноотрица-тельные результаты серологических исследований могут наблюдаться у пациентов с проявлениями иммунодепрессивных состояний (неопластические процессы, СПИД и др.), а также на ранних стадиях ЛБ.
Использование диагностических тест-систем, основу которых составляет ограниченный набор антигенов (например, только Osp A), может привести к ситуации, когда отрицательный результат исследования обусловлен тем, что иммунная система человека не продуцирует против этих антигенов специфические антитела, поскольку у боррелий, перси-стирующих в организме человека, эти белки отсутствуют.
Ложноположительные результаты в серологических исследованиях возможны из-за «эффекта перекреста» при наличии у пациентов других (инфекционных и неинфекционных) заболеваний. Например, у больных трепанематозами (возбудители T. pallidum и T phagedenis) и другими спирохетозами (возбудители клещевого возвратного тифа B. persica, B. hermsii, B. duttoni и др.), поскольку указанные микроорганизмы имеют многие сходные антигенные детерминанты с таковыми у возбудителей Лайм-боррелиоза.
Для исключения подобных ошибок перед исследованием следует проводить «истощение» сыворотки антигенами этих спирохет. Ложноположитель-ные реакции могут регистрироваться у больных с ревматоидным артритом, системными заболеваниями соединительной ткани, при неопластических процессах. Технология «истощения» (предварительная адсорбция ревматоидного фактора) позволяет значительно снизить вероятность получения ложных результатов.
Неопределенные (сомнительные) результаты реакций возможны при взаимодействии некоторых низкоспецифичных белков боррелий (p66, p75) с антителами к поверхностным белкам многих грамотрицательных (Yersinia enterocolitica O3, E. coli, Campylobacter jejuni, N. meningitidis, H. influenzаe) и грамположительных бактерий (пневмококки, стафилококки) и даже микобакте-рий туберкулеза. Сомнительные результаты серологических исследований могут наблюдаться при некоторых вирусных заболеваниях (цитомегаловирус, вирус Epstein-Barr) в результате поликлональ-ной активации В-лимфоцитов.
Следует особо подчеркнуть, что в случаях, когда у пациентов при неоднократных исследованиях постоянно обнаруживаются повышенные титры IgM (без сероконверсии), то это следует расценивать как ложноположительный результат. Причины этого явления часто остаются невыясненными.
Микробиологическая диагностика ЛБ должна проводиться комплексно, с использованием нескольких диагностических тест-систем, включая современные молекулярно-биологические методы исследования. Однако переоценка диагностической значимости лабораторных тестов, без учета клинической картины заболевания, может стать причиной гипердиагностики ЛБ и привести к комплексу лечебно-диагностических ошибок.
За последние годы в мире накоплен большой опыт по лабораторной диагностике ЛБ, который свидетельствует, что в случаях, когда арсенал исследователя ограничен одним методом, подтвердить диагноз бывает трудно. Поэтому возникает необходимость использовать несколько различных тестов прямой и непрямой микробиологической диагностики для достижения одной цели - достоверности диагноза ЛБ. В широкой клинической практике немаловажное значение имеет не только высокая специфичность и чувствительность того или иного теста, но и
его экономичность, доступность и простота для технического выполнения.
Совершенствование серологического метода для диагностики ЛБ позволило в большинстве стран мира перейти от принципа трехшагового лабораторного подтверждения диагноза (НРИФ, ИФА, иммуноблоттинг) на двухшаговый (НРИФ (ИФА), иммуноблоттинг). Последней комбинации двух тестов, как показывает опыт, вполне достаточно для серологической диагностики ЛБ [24].
Для исключения возможных ложнопо-ложительных результатов первого этапа исследования применяется иммуноблот-тинг, позволяющий обнаружить специфические антитела против определенных антигенов боррелий. Если первый этап (ИФА, НРИФ) оказался отрицательным, то нет необходимости в более детальном исследовании с помощью иммуно-блоттинга, поскольку результат, вероятно, также будет отрицательным. Однако в этих случаях нельзя окончательно исключить боррелиозную инфекцию у пациента, ведь заболевание (особенно на ранних стадиях развития) может протекать без достаточной выработки специфических антител (серонегативное течение). Поэтому при клинических подозрениях на ЛБ через 3-4 недели исследование следует повторить. При обнаружении в сыворотке крови диагностически значимых титров антител или при их 4-кратном увеличении (что бывает не более чем в 5% случаев) результат оценивается как положительный, подтверждающий боррелиозную инфекцию.
Во многих случаях серонегативно-го ЛБ при отрицательных результатах НРИФ и ИФА результаты исследования с помощью иммуноблоттинга также отрицательные. Таким образом, даже использование тонких, высокоспецифичных и чувствительных тест-систем не исключает возможности получения ложноотри-цательных результатов на ранних стадиях развития болезни.
В отдельных случаях, когда результаты иммуноблоттинга сомнительные, исследование следует повторить через 1-2 недели.
Если пограничный или положительный результат первого этапа подтверждается вторым этапом, то серологически диагноз достоверен. По результатам им-муноблоттинга, анализируя спектр имеющихся специфических антител к конкретным белкам боррелий, можно косвенно судить о стадии развития заболевания (ранние или поздние проявления ЛБ), а также о повторном заболевании или его рецидиве в пределах одного эпидсезона.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Лобзин Ю.В., Рахманова А.Г., Антонов В.С., Усков А.Н. и др. Эпидемиология, этиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика клещевых боррелиозов: рекоменд. для врачей. - СПб., 2000. - 52 с.
2. Лукашова Л.В., Лепехин А.В., Жукова Н.Г. и др. Иксодовые клещевые боррелиозы (этиология, эпидемиология, патогенез, клинические проявления, диагностика, лечение, профилактика): учеб.-метод. пособие. - Томск, 2004. - 74 с.
3. Офицеров В.И. // Новости Вектор-Бест. - 2003. -№2 (28).
4. Трофимов Н.М., Ерофеева Н.И., Школина Т.В. и др. // Мед. паразитол. - 1997. - № 4. - С. 32-36.
5. Трофимов Н.М., Щерба В.В., Ерофеева Н.И. и др. // Здравоохр. - 2000. - №1. - С.20-22.
6. Brouqui P., Bacellar F, Baranton G. et al. // Clin. Microbiol. Infect. - 2004. - Vol. 10. - P.1108-1132.
7. Bruckbauer H, Preac-Mursic V, Fuchs R, Wilske B. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1992. -Vol.11. - P. 1-9.
8. Brunner М, Sigal L.H. // J. Infect. Dis. - 2000. -Vol.182, N7. - P. 534 - 539.
9. CarroiiJA, El-Hage N, MillerJ.C. et al. // Infect. Immun. - 2001. - Vol.69. - P. 5286-5293.
10. Casjens S. et al. // Mol. Microbiol. - 2000. -Vol.35. - P. 490-516.
11. Centers for Disease Control and Prevention. Recommendations for test performance and interpretation from the Second national Conference
on Serologic Diagnosis of Lyme Disease. - MMWR (Morbid. Mortal. Wkl. Rep). - 1995. - Vol.44. -P. 590-591.
12. Dressler F, Whalen J.A., Reinhardt B.N., Steere A.C. // J. Infect. Dis. - 1993. - Vol.167. -P. 392-400.
13. Fraser C.M., Casjens S, Huang W.M. et al. // Nature. - 1997. - Vol.390. - P. 580-586.
14. Gajovic O, Todorovc Z, Nesic L, Lazic Z. // Med. Pregl. - 2010. - Vol.63 (11-12). - P.839-843.
15. GallagherS, Chakavarti D. // J. Vis. Exp. -2008. -Vol. 16. - P.759. - Vol. 10. - P. 3791.
16. Goossens H.A., Bogaard A.E., Nohlmans M.K. // Clin. Labor. - 2001. - Vol.47, N1-2. - P. 41-49.
17. Hansen K, Lebech A.-M. // Ann. Neurol. - 1991. -Vol.30. - P. 197-205.
18. Hauser U, Krahl H, Peters H. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P. 427-436.
19. Hauser U, Lehnert G, Lobentanzer R, Wllske B. // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol.35. - P. 1433-1444.
20. Hofman H. // J. Infection. - 2006. - Vol.24. -P. 470-472.
21. Lawrenz M.B., Hardham J.M., Owens RT. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol.37. - P.3997-4004.
22. Maria E. Aguero-Rosenfeld, Guiqing Wang et al. // Clin Microbiol Rev. - 2005. - Vol. 18(3). - P. 484-509.
23. Oschmann P., Kiaiczy P. et al. (eds.) Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis. - Bremen (Germany), 1999. - 144 p.
24. Robertson J. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2000. -Vol.38. - P. 2097-2102.
25. Robertson J, Guy E, Andrews N. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol.38. - P. 2097-2102.
26. Roessler D, Hauser U, Wllske B. // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 2752-2758.
27. Schnarr S, Wahl A, Jurgens-Saathoff B. et al. // Scand. J. Rheumatol. - 2002. - Vol.31. - P. 184186.
28. Schwan TG, Piesman J., Golde WT. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1995. - Vol.92. - P.2909-2913.
29. Schwan T.G., Piesman J. // J. Clin. Microbiol. -2000. - Vol.38. - P. 383-388.
30. Sibilia J., Jaulhac B, Limbach FX. // Rev. Med. Interne. - 2002. - Vol.23. - P. 378-385.
31. Sjöwall J. Clinical and immunological aspects of
Lyme Borreliosis: Lingcöping University Med. Dis. N1225 (Sweden). - Lingcöping, 2011. - 134 p.
32. Steere A.C., Broderick T.FMalawista S.E. // Am. J. Epidemiol. - 1978. - Vol.108. - P. 312-321.
33. Steere A.C. // N. Engl. J. Med. - 1989. - Vol.321. -P. 586-596.
34. Stevenson B., Schwan T.G., Rosa P.A. // Infect. Immun. - 1995. - Vol.63. - P. 4535-4539.
35. Wang G., Wormser G.P, Schwartz I. Molecular medical microbiology. - London: Academ. Press, 2001.- P. 2059-2092.
36. Wllske B., Fingerle V, Herzer P. et al. // Med. Microbiol. Immunol. - 1993. - Vol.182. - P.255-270.
37. Wllske B, Fingerle V, Hauser U. et al. // Zent. Bl. Bacteriol. - 1999. - Vol.289. - P. 675-677.
38. Wilske B. // Intern. J. Med. Microbiol. - 2002. -Vol.291. - N33. - P. 314-319.
Поступила 24.07.2012г.
ЭТО МШН® ЗНАТЬ
НЕСТЕРОИДНЫЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СРЕДСТВА И РИСК СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ. РЕЗУЛЬТАТЫ СЕТЕВОГО МЕТААНАЛИЗА РАНДОМИЗИРОВАННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) являются одними из наиболее часто назначаемых препаратов в клинической практике. В 2004 г. после завершения рандомизированного клинического исследования (РКИ) APPROVe (Adenomatous Polyp Prevention on Vioxx), показавшего значительное увеличение риска сердечно-сосудистых событий при длительном приеме рофекоксиба, препарата был отозван с фармацевтического рынка. Это событие инициировало оценку безопасности сначала других ингибиторов циклооксигена-зы-2 (ЦОГ-2), а затем и традиционных неселективных НПВС. Однако результаты РКИ были не вполне определенными, а стандартные метаанализы были не способны объединить данные многочисленных РКИ.
Учитывая важность проблемы для принятия клинического решения о назначении НПВС в том или ином случае, швейцарские ученые выполнили сетевой метаанализ РКИ, позволяющий провести прямые и непрямые сравнения сердечно-сосудистой безопасности различных НПВС.
Несмотря на сохраняющуюся неясность (очень широкие доверительные интервалы ОР), результаты сетевого мета-анализа РКИ продемонстрировали увеличенный риск сердечно-сосудистых осложнений при терапии любыми НПВС, независимо от селективности в отношении к ЦОГ-2. В целом наиболее безопасным оказался напроксен.
Таким образом, заключают авторы публикации, поскольку безопасные фармакологические возможности для терапии хронической мышечно-скелетной боли ограничены, при назначении НПВС пациенты и врачи всегда должны принимать во внимание сердечно-сосудистый риск в каждом конкретном случае.
Trelle S, Reichenbach S, Wandel S. et al. // BMJ. - 2011. - Vol. 342. - P. c7086.
ПРИ СОВРЕМЕННОМ ЛЕЧЕНИИ ИНФАРКТА МИОКАРДА ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОМЕГА-3 ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ СОМНИТЕЛЬНА. ДАННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ OMEGA В клиническом исследовании GISSI-Prevenzione, основные результаты которого были опубликованы в 1999 г., показано, что у пациентов с недавно перенесенным инфарктом миокарда (ИМ) применение высокоочищенных омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ю-3 ПНЖК) в дозе 1 г/сут сопровождается статистически значимым снижением риска общей и сердечно-сосудистой смертности. Но особенно впечатляла эффективность ю-3 ПНЖК в отношении снижения риска внезапной сердечной смерти (ВСС). Тем не менее прием ю-3 ПНЖК в GISSI-Prevenzione был открытым, а большинство участников не получали современную (с точки зрения XXI века) терапию. В частности, при включении только 5,0% пациентов перенесли реваскуляризацию миокарда, и только 4,7% больных получали липидснижающую терапию.
Первичной целью рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования OMEGA была оценка эффективности высокоочищенных ю-3 ПНЖК в отношении ВСС у больных перенесших ИМ и получающих рекомендованную в настоящее время профилактическую терапию.
В исследовании OMEGA показано, что современное лечение ИМ приводит к низкому риску ВСС, общей смертности и основных нежелательных цереброваскулярных и сердечно-сосудистых событий в течение первого года наблюдения. В исследовании не найдено доказательств дополнительной (по сравнению с плацебо) эффективности высокоочищенных ю-3 ПНЖК во вторичной профилактике данных неблагоприятных исходов после ИМ. Тем не менее недостаточная статистическая мощность исследования не позволяет полностью исключить потенциальную пользу ю-3 ПНЖК в более крупных испытаниях с более длительным сроком наблюдения.
Rauch B., Schiele R, Schneider S. et al. // Girculation. - 2010. - Vol.122, № 21. - P. 2152-2159.
