CC BY
102
УДК 634.233:634.232:57.086.13
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ВЕГЕТАТИВНЫХ ПОЧЕК ЧЕРЕШНИ И ВИШНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРИОПРОТЕКТОРОВ
В.Г. ВЕРЖУК, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Г.И. ФИЛИПЕНКО, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией
А.В. ПАВЛОВ, младший научный сотрудник Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова, ул. Большая Морская, 42, Санкт-Петербург, 190000, Россия E-mail: vverzhuk@mail.ru
Резюме. Исследования проводили с целью разработки удобной и надёжной методики криоконсервации вегетативных почек вишни (Prunus subg. Cerasus (Mill.) A.Gray, 1856) и черешни (Prunus avium (L.) L., 1755). Изучали влияние двух криопротекторов - глицерина и сахарозы, взятых в различных концентрациях, на сохранение жизнеспособности вегетативными почками этих культур после хранения в парах жидкого азота. Материалом для исследования послужили сорта вишни и черешни, произрастающие в коллекционных садах различных регионов России: южном (Крымская опытно-селекционная станция ВИР) и северозападном (Павловская опытная станция ВИР). Замораживание проводили двухступенчатым методом. Образцы хранили в парах жидкого азота при температуре -183-185°С, размораживали пошагово с интервалом 1'С/мин до 0°С с последующим отмыванием от криопротекторов при 18-20°С в течение 1-2 мин. После размораживания почек их жизнеспособность несколько отличалась у различных сортов, выращенных в разных местах, но у всех образцов была достаточно высокой. У вишни она находилась на уровне 54,2-63,2%, у черешни - 36,0-56,3%. Обнаружена тенденция к сохранению большей жизнеспособности почек после криоконсервации с использованием 40%-ной сахарозы. Предлагаемая методика двухступенчатой крио-консервации почек с использованием криопротекторов менее затратна, чем поддержание коллекции в живом виде в саду. Кроме того, при ее реализации нет необходимости в длительном подготовительном периоде в отличие от криоконсервации черенков. В целом двухступенчатая криоконсервация почек вишни и черешни с использованием в качестве криопротектора 40%-ной сахарозы может быть использована для сохранения генетических ресурсов этих культур.
Ключевые слова: плодовые культуры, вишня, черешня, почки, криоконсервация, криопротектроры. Для цитирования: Вержук В.Г., Филипенко Г.И., Павлов А.В. Криоконсервация вегетативных почек черешни и вишни с использованием криопротекторов // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №7. С. 65-67.
Сохранение генетических ресурсов растений -важная задача, которая имеет прямое отношение к продовольственной безопасности страны. Конвенция о биологическом разнообразии предусматривает сохранение растений как в естественных местах обитания - in situ, так и вне естественных мест обитания - ex situ [1]. Ex situ сохранением генетических ресурсов растений занимаются, главным образом, генетические банки. В Российской Федерации ведущую роль в этом вопросе играет Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР).
Семенные коллекции поддерживают в живом состоянии путем пересевов, а также сохраняют в спе-
циализированных низкотемпературных (4°С, -10°С, -18°С) хранилищах. Генетическое разнообразие вегетативно размножаемых растений поддерживают в виде живых насаждений, коллекция которых на 01.11.2014 г. насчитывала 22750 образцов. Кроме того, 650 образцов плодовых и ягодных культур, а также картофеля сохраняются в условиях культуры тканей in vitro.
С 2003 г. в ВИР активно развивается криоконсервация вегетативно размножаемых культур. Первые шаги в этом направлении были предприняты в институте ещё в 80-е гг. ХХ века [2], но только в последние годы, после создания современного криокомплекса, включающего 8 криотанков (ХБ-0,5), машины для производства жидкого азота, программные замораживатели и другое необходимое оборудование, стало возможно не просто осваивать имеющиеся или разрабатывать новые методики, но и закладывать образцы на длительное хранение. На сегодняшний день в криобанке ВИР в парах жидкого азота при температуре от -183° до -185°С хранится 358 образцов плодовых и ягодных культур в виде черенков и 645 образцов в виде пыльцы, кроме того, хранятся 111 образцов апикальных меристем картофеля.
Использование криоконсервации имеет большие перспективы в деле сохранения генетических ресурсов растений. При сверхнизких температурах биохимические процессы в клетках прекращаются, благодаря чему живые объекты способны храниться сколь угодно долго. Однако клетки могут пострадать из-за образования внутриклеточного льда, если замораживание происходит быстро, или из-за обезвоживания, если замораживание осуществляется медленно [3, 4].
Существует два подхода к решению этой проблемы: подсушивание замораживаемых объектов и использование криопротекторов - веществ, уменьшающих криоповреждения. Первый подход успешно применён при разработке методик криоконсервации пыльцы и семян растений [5-9].
На подсушивании основан также разработанный Ф. Форслайном метод криоконсервации черенков яблони в парах жидкого азота [10], с использованием которого в Национальной лаборатории в Форт-Коллинзе (США) на базовое хранение в парах жидкого азота заложили в общей сложности 1150 из 2500 образцов коллекции рода Malus L. Проверка 600 образцов, заложенных в 1992 г., показала, что 90% из них имели высокую жизнеспособность, их удалось восстановить путём прививок [11]. При закладке образцов коллекции ВИР на криогенное хранение используется метод Форслайна для яблони и его модификации, разработанные в ВИР для других плодовых культур - алычи, абрикоса, винограда, вишни, груши, крыжовника, сливы, смородины чёрной и красной, черемухи, черешни.
Однако закладка растительного материала на длительное хранение по схеме Форслайна требует 1-2 мес. подготовительной работы. Этот период
можно значительно сократить, если использовать другой подход, включающий применение криопро-текторов. Такие методики консервации почек были ранее разработаны в ВИР для черемухи и чёрной смородины [12,13].
В опытах изучали широкий спектр криопротекто-ров - как проникающих в клетки (диметилсульфокси д,этиленгликоль), так и непроникающих (полиэтилен-гликоль, сахароза, РVS-4, PVS-3, Towill), применяли режим двухступечатого замораживания. Кроме того, на жимолости синей проводили опыты по быстрому замораживанию (витрификации) с использованием в качестве криопротекторов РVS-4, PVS-3, Towill [14]. Результаты оказались положительными, но поскольку диметилсульфоксид, РVS-4, PVS-3, Towill токсичны, было решено ограничить их применение, и использовать такие нетоксичные соединения, как глицерин и сахароза. Мы в своем исследовании решили ограничиться двухступенчатым замораживанием, хотя в дальнейшем возможно использование витрификации.
Цель исследования - разработать удобную и надёжную методику криоконсервации почек вишни и черешни с применением криопротекторов.
Условия, материалы и методы. Материалом для исследования послужили почки вишни сортов Встреча (к-38449), Чудо-вишня (к-42141) и черешни сортов Исполинская Бадана (к-43816), Мелитопольская Черная (к-18187) из коллекции Крымской опытно-селекционной станции, а также черешни сорта Первенец (к-11650) из коллекции Павловской опытной станции ВИР.
Черенки нарезали в первой декаде декабря. В дальнейшем для работы с криопротекторами вегетативные почки отделяли от побега со слоем древесины. По каждому сорту опыт проводили в трех повторностях, по 20-30 почек в каждой.
При подготовке к консервации вегетативные почки заливали криопротекторами и выдерживали в них 1 ч при 20°С. В работе использовали глицерин - проникающий криопротектор, не обладающий токсическим действием в отличие от широко распространенного диметилсульфоксида, а также сахарозу - непроникающий криопротектор. Криопротекторы применяли в виде 25 и 40%-ных растворов.
После обработки материал замораживали двухступенчатым методом в замораживателе «Sanyo Medikal Freezer -U442(T)». Сначала температуру снижали на 1°-2°С каждые полчаса до температуры от -30°до -32°С, при достижении которой материал выдерживали 15 мин. На второй ступени процесса охлаждения температуру снижали на 4-5°С в час до температуры от -48°до -50°С. Затем криопробирки помещали в большой криотанк (ХБ-0,5 м3) на хранение в парах азота при температуре от -183° до -185°С. Через несколько недель почки размораживали, повышая температуру на 1°С в минуту до 0°С, а затем отмывали от криопротекторов в проточной холодной воде при 18°-20°С в течение 1-2 мин.
Жизнеспособность почек определяли путем проращивания в стерильных условиях на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавками 1,5 мг/л БАП и 0,2 мг/л ИУК в световой комнате при температуре 21°±1°С и режиме освещенности 16 ч - день / 8 ч - ночь. В качестве контроля брали исходные показатели образцов до криоконсервации.
Результаты и обсуждение. Криоконсервация неизбежно ведёт к снижению жизнеспособности образцов. У большинства сортов доля почек, выживших в опытах с использованием криопротекторов после хранения в жидком азоте, несколько ниже, чем доля выживших черенков при криоконсервации по модифицированной методике Форслайна, проводившейся в предыдущие годы. Поскольку жизнеспособность
Таблица. Влияние криопротекторов на жизнеспособность почек вишни и черешни после хранения в парах жидкого азота при температуре от -183° до -185°С
Сорт № в каталоге Вариант Жизнеспособность почек, %
Вишня (Крымская ОС)
Встреча к-38449 контроль 96,0±2,4
25% раствор сахарозы 54,2±10,4
40% раствор сахарозы 60,0±13,1
25% раствор глицерина 55,6±12,1
40% раствор глицерина 57,1±9,5
Чудо-вишня к-42141 контроль 98,0±1,5
25% раствор сахарозы 61,5±9,7
40% раствор сахарозы 63,2±11,4
25% раствор глицерина 60,0±13,1
40% раствор глицерина 60,9±10,4
Черешня (Крымская ОС)
Исполинская Бадана к-43816 контроль 94,0±2,5
25% раствор сахарозы 52,6±11,8
40% раствор сахарозы 56,0±10,1
25% раствор глицерина 54,2±10,4
40% раствор глицерина 53,3±13,3
Мелитопольская черная к-18187 контроль 90,0±2,8
25% раствор сахарозы 36,0±9,8
40% раствор сахарозы 47,8±10,6
25% раствор глицерина 46,2±10,0
40% раствор глицерина 45,5±10,9
Черешня (Павловская ОС)
Первенец к-11650 контроль 94,0±2,7
25% раствор сахарозы 56,3±12,8
40% раствор сахарозы 55,0±11,4
25% раствор глицерина 45,5±10,9
40% раствор глицерина 52,2±10,6
черенков определяли путём прививки в крону, а жизнеспособность почектолько влабораторныхусловиях, впрямую сопоставлять эти результаты не представляется возможным. Тем не менее, следует отметить, что выживание почек было довольно высоким - не менее 36% (см. табл.). Среди испытанных вариантов криопротекторов несколько лучшие результаты обеспечило применение 40%-ного раствора сахарозы.
Различия между сортами были небольшими. Несколько хуже других перенёс криоконсервацию почек сорт черешни Мелитопольская чёрная с Крымской опытной станции. При использовании черенков этот сорт тоже хуже других переносил криоконсервацию. Видимо, это его индивидуальная особенность. Резких различий по жизнеспособности между образцами
вишни и черешни, выращенными в разных зонах, не наблюдали.
выводы. В целом можно заключить, что методика криоконсервации вегетативных почек вишни и черешни, включающая двухступенчатое замораживание опытного материала с использованием 40%-ного раствора сахарозы в качестве криопротек-тора и размораживание образцов путём повышения температуры на 1°С в минуту до 0°С с последующей отмывкой от криопротекторов в проточной воде при 18°-20°С в течение 1 -2 мин, пригодна для сохранения генетических ресурсов этих культур. Предлагаемая методика криоконсервации образцов вишни и черешни менее затратна, чем поддержание коллекций в живом виде в саду.
Литература.
1. Convention on Biological Diversity, 1993. Article 2. Use of Terms. URL: https://www.cbd.int/convention/articles/default. shtml?a=cbd-02 (дата обращения 30.07.2015).
2. Федосенко В.А. Использование сверхнизких температур для длительного хранения семян // Бюлл. ВИР. 1978. Вып.77. С.53-57.
3. Benson E.E. Plant Conservation Biotechnology. London, Philadelphia: Taylor and Francis, 1999. 309 p.
4. Вольф Дж, Брайант Г. Криобиология и биология обезвоживания клеток. 2004. Университет Нью-Саус-Уэлса, Сидней, Австралия. на англ.яз. / J.Wolfwand G.Bryant. Cryobiology and anhydrobiology of cells. 2004: http://newt.phys.unsw.edu.au/~jw/ cryoblurb.html
5. Sakai A, Noshiro M. Some factors contributing to the survival of crop seeds cooled to the temperature of liquid nitrogen. In: O.H. Frankel, J.G.Hawkes /eds./ Crop genetic resources for today and tomorrow//- London, Cambridqe Univ/ Press, 1975. P.317-326.
6. Молодкин В.Ю. Хранение семян зерновых бобовых и технических культур при сверхнизких температурах// Бюлл. ВИР. 1984. Вып.144. С.182-183.
7. Viability of Fruit Crop Scions and Apple Pollen Stored at Low and Ultralow Temperatures (Crioconservation) / V. Verzhuk, G. Safina, N. Tikhonova, N. Shubin //Agriculture. Scientific articles. 2002. V.78. №2. P.283-288.
8. Криоконсервация - эффективный метод сохранения генетических ресурсов плодовых и ягодных культур / В.Г. Вержук, Г.И. Филипенко, Г.Ф. Сафина, А.В. Павлов, А.С. Жестков// Тр. по прикл. бот., ген. и сел. 2012. Т. 169. С. 270-279.
9. Reed B.M. Plant Cryopreservation:a practical guide. Corvallis, 2008. P.443-464.
10. Development of base collections of Malus germplasm with cryopreserved buds / P.L. Forsline, L.E. Towill, J. Waddell, L. Wiesner // HortScience. 1995. 30. Р. 872.
11. Forsline P.L., McFerson J.R., Lamboy W.F., Towill L.E. Development of base and active collections of Malus germplasm with cryopreserved dormant buds // Acta Hortic. (ISHS), 1998. 484.8. P.75-78. URL: http://dx.doi.org/10.17660/ActaHortic.1998.484.8(дата обращения 30.07.2015).
12. Криоконсервация побегов и почек черемухи (Padus Mill.) с применением различных криопротекторов и режимов замораживания / В.Г. Вержук, А.В. Павлов, Л.Ю. Новикова, С.Ю. Орлова // Сб.тр.: Факторы экспериментальной эволюции организмов. Киев, 2011. Т.11. С.233-237.
13. Жизнеспособность геноплазмы черной смородины (Ribes Nigrum L.), обработанной криопротекторами и без них после хранения в парах жидкого азота / В.Г. Вержук, А.В. Павлов, О.А. Тихонова, Л.Ю. Новикова // Сб. науч.тр. IX съезда Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии». 2012. Т.3. С. 417-421.
14. Жестков А.С., Вержук В.Г., Сорокин А.А. Разработка методики криосохранения покоящихся почек жимолости синей (Lonicera L.) // Цитология. 2006. Т.48. №9. С.763.
cryopreservation of vegetative buds of sweet and sour cherry using cryoprotectors
V.G. Verzhuk, G.I. Filipenko, A.V. Pavlov
Federal Research Centre N.I. Vavilov All-Russian Institute of Plant Genetic Resources, Bolshaya Morskaya str., 42, St. Petersburg, 190000, Russia
Summary. The aim of the study was to develop a convenient and reliable method for cryopreservation of vegetative buds of sour cherry (Prunus subg. Cerasus (MILL.) A. GRAY 1856) and sweet cherry (Prunus avium (L.) L., 1755) with the use of cryopro-tectants. It was studied the effect of two cryoprotectants - glycerol and sucrose in different concentrations - on the viability of vegetative buds of these cultures after storage in vapour phase nitrogen.The research material consisted of sweet and sour cherry cultivars grown in the collection orchards in different parts of Russia: Southern (Krymsk experiment breeding station of VIR) and North-Western (Pavlovsk experiment station of VIR) regions. Freezing was carried out by two-step method. The samples were stored in liquid nitrogen vapor at a temperature of -183...-185 deg C, then they were thawed gradually with the interval of 1 deg C/min up to 0 deg C and with subsequent washing off from the cryoprotectors at 18.20 deg C for 1.2 min.When the buds were defrosted, their viability varied depending on the cultivar and the region of growing, but it was high enough at all the samples. It was 54.2.63.2 % for buds of sour cherry and 36.0. 56.3 % for buds of sweet cherry. It was found a tendency for higher viability of buds after cryopreservation with 40 % sucrose solution. The proposed conservation technique when buds undergoes two-step freezing with different cryoprotectants is less expensive than in vivo maintenance of the collection in orchards. In addition, cryopreservation of buds did not require a long preparatory period, in contrast to cryopreservation of cuttings. In general, two-step cryopreservation of buds of sour and sweet cherries using 40 % sucrose solution as a cryoprotectant can be used for conservation of genetic resources of these cultures.
Keywords: horticultural crop, sour cherry, sweet cherry, buds, cryopreservation, cryoprotectors.
Author Details: V.G. Verzhuk, Cand. Sc. (Biol.), Senior Research (e-mail: vverzhuk@mail.ru); G.I. Filipenko, Cand. Sc. (Agr.), Head of Laboratory; A.V. Pavlov, Junior Research
For citation: Verzhuk V.G., Filipenko G.I., Pavlov A.V. Cryopreservation of vegetative buds of sweet and sour cherry using cryoprotectors. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2015. V.29. №7. pp. 65-67 (In Russ)
