CC BY
172
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.371:578.832.1].012.6
И.Б. Есмагамбетов, Е.С. Седова, Д.Н. Щербинин, А.А. Лысенко, М.Н. Гарас, М.М. Шмаров,
Д.Ю. Логунов
КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСА чЕЛОВЕКА,
экспрессирующего гены консервативных антигенов вируса гриппа а
ИОННОГО КАНАЛА М2 И НУКЛЕОпРОТЕИНА
ФГБУ "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, Москва
Грипп является высококонтагиозным, одним из самых массовых инфекционных заболеваний. Наиболее важное эпидемиологическое значение представляют вирусы группы А. Высокая генетическая изменчивость приводит к постоянной модификации антигенной структуры вируса гриппа, поэтому современные гриппозные вакцины требуют периодического обновления их штаммового состава. На сегодняшний день актуальной является разработка универсальной вакцины, одновременно защищающей против различных штаммов вируса гриппа А, основанной на консервативных антигенах вируса. В качестве кандидатной вакцины против вируса гриппа А перспективным может оказаться использование рекомбинантных аденовирусов человека, экс-прессирующих гены консервативных антигенов вируса. В работе методом гомологичной рекомбинации был получен рекомби-нантный аденовирус человека 5-го серотипа, экспрессирующий гены ионного канала М2 и нуклеопротеина № вируса гриппа А. В состав вирусного генома были включены гены, кодирующие консенсусные для вирусов гриппа А человека последовательности белков М2 и №. Методом вестерн-блота была показана экспрессия антигенов М2 и № полученным рекомбинантным аденовирусом в пермессивной линии эукариотических клеток, а также продемонстрирована высокая иммуногенность препарата при интраназальной иммунизации лабораторных мышей.
Ключевые слова: рекомбинантный аденовирус; вирус гриппа А; ионный канал М2; нуклеопротеин ^; иммунизация.
Грипп - высококонтагиозное заболевание птиц и млекопитающих, возбудителями которого являются РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae. Данное семейство включает 3 группы (А, В и С), из которых наиболее важное эпидемиологическое значение имеют вирусы группы А. Различные штаммы вирусов гриппа этой группы ежегодно вызывают эпидемии, а через нерегулярные интервалы времени - пандемии. Основным методом профилактики гриппа является вакцинация. Терапевтический эффект современных вакцин основан на выработке протективных антител к поверхностным гликопротеинам вируса - гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (КА). Эффективность таких вакцин напрямую зависит от степени сродства антигенной структуры поверхностных гликопротеинов вируса гриппа, входящих в состав вакцины, и штаммов, циркулирующих среди населения в текущий эпидемический сезон. Основной проблемой при вакцинопрофи-лактике гриппа является генетическая изменчивость вируса (антигенный шифт и антигенный дрейф), в результате которой может происходить значительное изменение структуры НА и КА. Таким образом, существует необходимость периодического обновления штаммового состава вакцины. Актуальным является создание универсальных вакцин против гриппа на основе высококонсервативных антигенов вируса. В качестве таких антигенов могут выступать белок М2 и нуклеопротеин КР вируса гриппа А.
М2 является трансмебранным белком, состоящим из 4 идентичных субъединиц, соединенных дисуль-
фидными связями [1]. Данный белок выполняет функцию протон-избирательного ионного канала и является необходимым для высвобождения вирусного генома в процессе проникновения вируса [2, 3]. Согласно данным литературы, антитела против эктодомена белка М2 способны ограничивать размножение вируса и образование вирусных бляшек (in vitro) в монослое клеток [4]. Белок М2 является одним из наиболее консервативных белков вирусов гриппа группы А [5] и способен индуцировать защиту против различных подтипов вируса внутри данной группы [6]. Данные свойства делают перспективным его использование в качестве компонента универсальной вакцины против гриппа.
Нуклеопротеин NP вируса гриппа связывает вирусную РНК и способствует ее транспорту в клеточное ядро. Согласно данным литературы, антигенные изменения в последовательности NP являются очень редкими среди различных штаммов вируса гриппа А [7, 8]. Показано, что кандидатные вакцины на основе вирусных векторов, несущие ген NP вируса гриппа А, способны обеспечивать защиту иммунизированных животных от широкого спектра штаммов [9].
Для создания эффективной вакцины необходимо подобрать оптимальный способ доставки в организм специфических антигенов. Таким способом может быть использование генетической иммунизации, в результате которой происходит доставка генов целевых антигенов непосредственно в клетки организма. Экспрессия в организме генов, кодирующих антигены патогена, имитирует вирусную инфекцию и позволяет добиться высоких уровней как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Одними из наиболее популярных векторов для генетической иммунизации являются рекомбинантные аденовирусы человека, в том числе аденовирус человека 5-го серотипа. Такие векторы способны проникать в различные типы клеток, в том числе профессиональные антигенпрезен-тирующие, подходят для интраназального введения, способны активировать врожденный иммунный ответ и, как правило, не требуют применения адъювантов. Репликативно-дефектные рекомбинантные аденовирусы несут делецию Е1 области генома и могут размножаться только в специальной пакующей клеточной линии 293НЕК. Кандидатные вакцины на основе ре-комбинантного аденовируса человека 5-го серотипа показали свою эффективность против различных патогенов вирусного и бактериального происхождения, в том числе против вируса гриппа А [10, 11].
Таким образом, перспективным подходом к созданию универсальной вакцины против гриппа представляется создание рекомбинантного аденовируса,
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
экспрессирующего гены консервативных белков вируса гриппа M2 и NP.
Однако, согласно данным литературы, экспрессия гена белка М2 вируса гриппа А оказывает токсичное воздействие на различные культуры эукариотических клеток [12, 13]. Показано, что белок М2 препятствует слиянию аутофагосом с лизосомой и макроаутофагии и стимулирует тем самым апоптотический процесс [12]. P. Ilynskii и соавт. показали, что одновременная трансфекция эукариотических клеток плазмидами, несущими гены белка М2 и зеленого флюоресцентного белка GFP, приводит с существенному снижению уровня GFP по сравнению с клетками, трансдуциро-ванными только одной плазмидой [13]. Также есть данные о способности нуклеопротеина NP вируса гриппа А вызывать апоптоз клеток млекопитающих [14]. Согласно данным литературы, экспрессия белка NP способствует движению проапоптотического белка Bax в митохондрии, высвобождению цитохро-ма С и активации индуцирующей апоптоз каспазы 3. Таким образом, экспрессия белков М2 и NP в составе рекомбинантного аденовируса может оказывать токсическое действие на эукариотические клетки и тем самым затруднять сборку вирусных частиц и их накопление.
Целью нашей работы являлось конструирование рекомбинантного аденовируса человека 5-го сероти-па, несущего гены антигенов М2 и NP вируса гриппа типа А под контролем индуцибельного промотора, позволяющего блокировать синтез целевых антигенов. В качестве такого промотора был выбран тетрациклин-зависимый элемент (TRE), позволяющий блокировать экспрессию целевых генов в присутствии тетрацикли-новых антибиотиков. Нами был получен рекомбинант-ный аденовирус Ad5-tet-M2NP, несущий целевые антигены М2 и NP вируса гриппа А, и показана высокая иммуногенность полученного рекомбинантного аденовируса при иммунизации лабораторных мышей.
Материалы и методы
Генетические конструкции и плазмиды. Аминокислотные последовательности белков M2 и NP различных штаммов вируса гриппа А, циркулирующих в человеческой популяции, были взяты из международной базы данных NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi?go=database), и при помощи методов биоинформатики составлены их кон-сенсусные последовательности. Разработана генетическая конструкция M2-NP, содержащая гены, кодирующие консенсусные белки M2 и NP, соединенные между собой последовательностью, кодирующей пептид 2А вируса ящура (UniProtKB/Swiss-Prot P03306). Такая последовательность позволяет осуществлять синтез пептидной цепи каждого белка отдельно с одной мРНК. Генетическая конструкция M2-NP была химически синтезирована (ЗАО "Евроген") и клонирована в плазмиду pAL-TA (pAL-TA-M2-NP).
Плазмиды pShuttle-CMV и pAd-Eazy, использованные для получения рекомбинантного аденовируса человека, были получены в составе коммерческого набора AdEazy Adenoviral vector system (Stratogen).
Для введения в геном рекомбинантного аденовируса тетра-циклинзависимого элемента получена плазмида pShuttle-tet-off-tTA, несущая регуляторные элементы системы tet-off, экспрес-сирующую кассету и участки генома аденовируса человека. Для этого tet-off-элементы клонированы в плазмиду pShuttle-CMV из плазмид pTet-off и pTRE-Tight (Tet-Off & Tet-On Gene Expression System (Clontech)) с использованием эндонуклеаз рестрикции KpnI и EcoRV.
Плазмида pShuttle-tet-M2NP, несущая под контролем тетра-
циклинзависимого элемента гены целевых антигенов вируса гриппа, была получена из плазмид pShuttle-tet-off-tTA и pAL-TA-M2NP при помощи методов молекулярного клонирования с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI и Hindlll.
Плазмида pAd-tet-M2NP, включающая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и экс-прессирующую кассету с целевыми генами под контролем те-трациклинзависимого элемента, получена из плазмид pShuttle-tet-M2NP и pAd-Eazy при помощи гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183.
В работе была также использована плазмида pAd-null, содержащая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса и экспрессирующую кассету, не несущую трансгена.
Культуры клеток. В работе использовали клетки эмбриональной почки человека линии 293НЕК, содержащие область Е1 генома аденовируса человека 5-го серотипа. Клетки вели на среде DMEM, содержащей 10% сыворотку эмбрионов КРС и антибиотики пенициллин и стрептомицин.
Вирусы. Рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа Ad-tet-M2NP, несущий гены антигенов вируса гриппа А, был получен с помощью набора AdEazy Adenoviral vector system (Stratogen). Для получения рекомбинантного аденовируса клетки линии 293HEK были трансфицированы плазмидой pAd-tet-M2NP, предварительно гидролизованной по сайту для эндону-клеазы рестрикции PacI, при добавлении в питательную среду доксициклина в дозе 5 мкг/мл. Клетки инкубировали при 37°С и 5% СО2 до образования характерных аденовирусных бляшек.
Трансфекция клеток. Трансфекцию клеток линии 293НЕК плазмидами проводили при помощи реагента METFECTIN PRO (Biontexlaboratories), согласно инструкции производителя.
Антитела. В работе использовали моноклональные антитела мыши (14С2) к белку М2 вируса гриппа А (Abcam, ab5416), моно-клональные антитела мыши (В248М) к белку NP вируса гриппа А (Abcam, ab110661), поликлональные антитела лошади к IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой (Amersham, ab NXA931).
Вестерн-блот. Для детекции экспрессии генов, кодирующих белки М2 и NP в составе плазмиды pShuttle-tet-M2NP, а также в составе рекомбинантного аденовируса Ad5-tet-M2NP в культуре клеток 293НЕК, применяли метод вестерн-блоттинга с использованием антител к целевому антигену и антивидовых антител, меченных пероксидазой. В качестве исследуемых образцов использовали лизированный клеточный осадок, предварительно троекратно отмытый фосфатно-солевым буфером и прогретый 5 мин при 98°С с диэтилтриэтолом. Белковый электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле. Для блоттинга использовали нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (Amershem, RPN303D). Забивку мембраны проводили в фосфатно-солевом буфере с 0,05% твина 20 (TPBS) и 5% сухом обезжиренном молоке. Отмывку от несвязавшихся антител проводили троекратно в TPBS. Детекцию результатов проводили при помощи набора ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham, RPN2132).
Определение титра рекомбинантного аденовируса. Титр рекомбинантного аденовируса Ad5-tet-M2NP выражали в бляш-кообразующих единицах (БОЕ) и определяли с помощью реакции бляшкообразования на линии клеток 293HEK [15]. Транс-дуцированные вирусом клетки инкубировали под покрытием, содержащим 0,5% агарозы в среде DMEM с 10% сывороткой эмбрионов КРС. Через 10 дней оценивали количество вирусных бляшек, образовавшихся на клеточном монослое.
Лабораторные животные. В работе были использованы мыши-самки линии BALB/c, массой 17-20 г. Все работы выполняли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных".
Иммунизация животных. Мыши были разделены на группы по 10 особей в каждой. Животные из опытной группы были однократно интраназально иммунизированы рекомбинантным аденовирусом Ad5-tet-M2NP в количестве 108 БОЕ/мышь. Животным из контрольных групп вводили аденовирус Ad-null в том же количестве и PBS. Через 3 нед после иммунизации у мышей отбирали сыворотку крови для оценки уровня антител к целевым антигенам вируса гриппа А.
Иммуноферментный анализ (ИфА). Для определения титра IgG к белкам вируса гриппа М2 и NP в сыворотке крови им-
Таблица 1
Консенсусная аминокислотная последовательность белка М2 вируса гриппа А
Консенсусная последовательность
A/Leшngrad/134/17/1957(H2N2)
A/Texas/50/2012(H3N2)
A/Hawaii/22/2012(H3N2)
A/Brisbane/59/2007(ШШ)
A/CaHfomia/07/2009(ШШ)
Консенсусная последовательность
A/Leшngrad/134/17/1957(H2N2)
A/Texas/50/2012(H3N2)
A/Hawaii/22/2012(H3N2)
A/Brisbane/59/2007(ШШ)
A/CaHfomia/07/2009(ШШ)
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAANПGILHLILWILDRLFFKC 50 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAAЯЮILHLILWILDRLFFKC 50 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAANПGILHLILWILDRLFFKC 50 MSLLTEVETPTRSEWECRCSDSSDPLVIAANПGILHLILWITDRLFFKC 50 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAA:ПGIFHLILWIГОRLF¡Ж: 50 MSLLTEVETPГRЖWЖCRC^DSSDPLV^AANIIGILHLILWIIXDRLFFKC 50 IYRRFKHGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQNAVDADD£HFVSIELE 97 ЖYR£FKHGLKRGi4STEGVPESMREEYRKEQQ¿AVDГDD¿HFVSIELE 97 FYR£FKHGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQNAVDADD¿:HFVSIELE 97 FYRIFKHGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQNAVDADD:HFVSIELE 97 IYR^FKHGLKRGPSTEGVPESMREEYREEQQNAVDADDDЯFVSIELE 97 IYRRFKГGLKRGPSTEGVPESMREEYOOEQQ,SAVDFDDGHFVMELE 97
Примечание. Подчеркиванием обозначены отличия в последовательностях белков М2 различных штаммов вируса гриппа А от кон-сенсусной последовательности.
Таблица 2
Консенсусная аминокислотная последовательность белка NP вируса гриппа А
Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg /RIЮ3/2012 (ШШ) A/Brisbane/59/2007 (H1N1) A/Califomia/07/2009 (H1N1) Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg /RIЮ3/2012 (ЮШ) A/Brisbane/59/2007 (ШШ) A/Califomia/07/2009 (H1N1) Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg /RIЮ3/2012 (ЮШ) A/Brisbane/59/2007 (H1N1) A/Califomia/07/2009 (H1N1) Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg ЖП03/2012 (ЮШ) A/Brisbane/59/2007 (H1N1) A/Califomia/07/2009 (ШШ) Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg /RIЮ3/2012 (ЮШ) A/Brisbane/59/2007 (H1N1) A/Califomia/07/2009 (H1N1) Консенсусная последовательность A/Leningrad/134/17/1957 (ШШ) A/Saint-Petersburg /RIЮ3/2012 (ЮШ) A/Brisbane/59/2007 (H1N1) A/Califomia/07/2009 (H1N1)
D1бGERQNATEIRASVGRMIG34_S50DYEGRLIQNSLTIER65_R97R 98 D16GERQNATEIRASVG^MLD34_S50DYEGRLIQNSLTIER65_£97R 98 D16GДRQNATEIRASVG£MLD34_S50DДEGRLIQNSLTIE£65_R97R 98 D GERQNATEIRASVGRMЮ .W DYEGRLIQNSLTIER .,Í97R 98
G16GERQOATEIRASVGRMIG34_S50DYOGRLIQNSiTIER65_R97R 98 VDGKWMRELVLYDKEEIRRГWRQANNGEDATAGLTШMГWHSNLN 144 VDGKWMRELVLYDKEEIRRГWRQANNGDDATAGLTHMMГWHSNLN144 VDGKWMRELVLYDKEEIRRГWRQANNGEDAT:GLTШMГWHSNLN 144 VDGKWERELVLYDKEEIRRIWRQANNGiDDATAGLTШMIWHSNLN 144 VDGKWMRELДYDKXEIRRFWRZANNGEDATAGLTШMIWHSNLN 144 DA146^R162^G179AAVKGVGTMVMELIRMIKTRV201 ^R236AMM 2^ ■ -V ■ ■ DI146^R162^d179AAVKGVGTMVMELIRMIKTR^201^R2з6AMM ^ ■ ^ ■ ■ DA146-£162_G179AAVKG^GTMVMELIRMFKTR¿:201 .. 240. ■ Т257.. .
DT1/1,;.. . .G1,0AAVKGVGTMVLELIRMIKTRLm
146 162 179 201
240''' ^57"
K236AMM:
DA146.R162.G179AAVKGVGTIAMELIRMIRTRV201.R236AMM240.I V YGPAVASGYDFEKEGYSLVGГОPFKLLQNSQVYSLI
323" ■Hзз5SAAF 339
V280YGPAVASGYEFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQVYSLI323.N335SAAF 339 A280YGPAVSSGYDFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQIYSLI323.N335SAAF 339 V280YGPAVASGYDFEKEGYSLVGVDPFKLLQTSQVYSLI323.N335SAAF339 V280YGLAVASGHDFEREGYSLVGЮPFKLLQNSQVVSLM323...H335SAAF339 EDLRVSSFIRGTKVI354.N372ENMDTMDSSTLELRSR384.RASAGQISV 408 EDLRVSSFIRGTKVI354.N372ENMDTMESSTLELRSR384.RASAGQISV 408 EDLRLLSFIRGTKVS354.N372ENMDNMGSSTLELRSG384...RASAGQTSV408 EDLRVSSFIRGTRVL354.N372ENMDAIVSSTLELRSR384.RASAGQIST 408 EDLRVSSFIRGKKVT4... V372ETMDSNDSSTLELRSR384... KASAGQISV 408
QPTFSVQRNLPFEKATVMAAFTGNTEGRTSDMRAEПRMMES4,
.К 498
QPTFSVQRNLPFOKPT^MAAFTGNÍ4EGRTSDMRAEIIRMMEG450.D 468 QPTFSVQRNLPFEK:T^MAAFTGNTEGRTSDMRAEПRMMEG^ .N 498
QPTFSVQRNLPFEЛATVMAAF:GN^EGRTSDMRIEVIRMMES4,0-: 498
Примечание. Подчеркиванием обозначены отличия в последовательностях белков NP различных штаммов вируса гриппа А от кон-сенсусной последовательности.
257
QPTFSVQRNLPFOKAT/MAAFдGNTEGRTSDMRAEIIAMMES4-0.N 498
ЭКCПEPИМEHТАЛЬHЫE CТАТЬИ
мунизированных мышей использовали метод непрямого ИФА. В лунки планшета с высокой сорбирующей емкостью вносили рекомбинантный белок NP (Sino Biological кат. номер 11675-V08B) или эктодомен белка М2 (MSLLTEVETPIRNEWGCR-CNDSSD), полученный путем химического синтеза, в концентрации 5 мкг/мкл. После сорбции антигенов при 4°С в течение ночи в лунки планшета вносили двукратные разведения сывороток иммунизированных животных и после инкубации в течение 1 ч при 37°С вторичные антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой. После инкубации и отмывки оценивали количество связавшегося конъюганта с помощью TMB-индикаторной смеси. Оптическую плотность окрашенного продукта определяли при длине волны 450 нм. За титр антител принимали разведение сыворотки, превышающее в 2 раза контрольные значения по единицам оптической плотности.
Результаты и обсуждения
Нами был проведен анализ аминокислотных последовательностей белков M2 и NP различных штаммов вируса гриппа типа А. При помощи методов биоинформатики было выравнено более 7 тыс. аминокислотных последовательностей белка М2 и более 6 тыс. аминокислотных последовательностей белка NP различных штаммов вируса гриппа типа А, выделенных от человека. Последовательности получены из международной базы данных Influenza Data Base. Были разработаны консенсусные аминокислотные последовательности данных антигенов (табл. 1 и 2).
На следующем этапе работы нами разработана генетическая конструкция, содержащая целевые гены, кодирующие белки М2 и NP, консенсусные между различными штаммами вирусами гриппа А. Нуклео-тидные последовательности генов, кодирующих белки М2 и NP, соединены между собой через сайт 2А, кодирующий пептид QLLNFDLLKLAGDVESNPGP Picornavirus aftae (штамм A10-61), который позволяет осуществлять синтез пептидной цепи каждого белка
отдельно с одной мРНК [16, 17]. Преимущество такой конструкции - отсутствие необходимости использования отдельной экспрессионной кассеты для каждого гена.
Чтобы избежать возможного токсического действия белков М2 и КР на эукариотические клетки при получении вирусных частиц, сконструирована плазмида, в которой целевые гены находятся под контролем индуцибельного промотера. Для этих целей нами выбрана система Те^ойй, позволяющая блокировать экспрессию подконтрольных генов путем добавления доксициклина. Система Те^ойй основана на использовании двух экспрессионных кассет в одной плазмиде. Первая кассета содержит целевые гены под контролем тетрациклинзависимого элемента TRE, состоящего из tetO-оператора и находящегося за ним минимального промотора цитомегаловируса человека (minCMV). Для активации экспрессии целевого гена необходимо, чтобы с TRE-элементом связался тетрациклинкон-тролируемый трансактиватор (ЯА). Ген ЛА находится во второй экспрессионной кассете под контролем промотора CMV и экспрессируется конститутивно. Доксициклин или тетрациклин способны блокировать ЛА и предотвращать его связывание с TRE, что ведет к прекращению экспрессии целевых генов в первой экспрессионной кассете. Таким образом, при трансфекции эукариотических клеток плазмидами, в состав которых включена Те^ойй-система, добавление в культуральную среду доксициклина приводит к ин-гибированию экспрессии целевого трансгена.
Нами была получена плазмида pShuttle-tet-M2NP, несущая гены, кодирующие целевые антигены вируса гриппа, под контролем Те^ой-системы (рис. 1, а). Данная плазмида также содержит участки гомологии с геномом аденовируса человека 5-го серотипа, что позволяет
Рис. 1. Схема плазмиды pSh-tet-M2NP и результаты иммуноблот-анализа. а - схема плазмиды pSh-tet-M2NP. CMV - промотор цитомегаловируса человека, TRE - тетрациклинзависимый элемент, mCMV - минимальный ци-томегаловирусный промотор, tTA - тетрациклинконтролируемый трансактиватор, LITR - левые концевые инвертированные повторы, RITR - правые
концевые инвертированные повторы, delta E1 - делеция области E1 генома аденовируса. б - иммуноблот-анализ экспрессии гена M2 в составе плазмиды pSh-tet-M2NP. 1 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-tet-M2NP в отсутствие доксициклина; 2 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-tet-M2NP в присутствии доксициклина; 3 - клетки, трансфицированные плазмидой pShuttle-CMV. в - иммуноблот-анализ экспрессии гена NP в составе плазмиды pSh-tet-M2NP. 1 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-tet-M2NP в отсутствие доксициклина; 2 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-tet-M2NP в присутствии доксициклина; 3 - клетки, трансфицированные плазмидой pShuttle-CMV.
использовать ее для рекомбинации с полноразмерным вирусным геномом и получения вирусных частиц (см. рис. 1, а). Уровень экспрессии генов, кодирующих белки М2 и ОТ, в составе плазмиды pShuttle-tet-M2NP был оценен методом вестерн-блоттинга (см. рис. 1, б, в). Клетки линии 293НЕК трансфицированы плазмидой pShuttle-tet-M2NP и культивировались в присутствии доксициклина и без него. Экспрессию целевых генов детектировали с помощью моноклональных антител к белкам М2 и Была показана экспрессия генов М2 и № в составе плазмиды pShuttle-tet-M2NP в отсутствие доксициклина. Значимого уровня экспрессии генов М2 и NP в присутствии доксициклина детектировано не было. Таким образом, система 1е1-о1Т позволяет эффективно блокировать экспрессию генов М2 и NP в составе плазмиды pShuttle-tet-M2NR
Для получения рекомбинантного аденовируса, несущего гены целевых антигенов, поставлена гомологичная рекомбинация между плазмидой pShuttle-tet-М2№ и плазмидой pAd-Eazy, несущей полноразмерный геном аденовируса человека 5-го серотипа [10].
Рис. 2. Схема генома аденовируса Ad5-tet-M2NP и результаты иммуноблот-анализа.
а - схема генома рекомбинантного аденовируса Ad-tet-M2NP: CMV - промотор цитомегаловиру-са человека, TRE - тетрациклин-зависимый элемент, mCMV - минимальный цитомегаловирусный промотор, tTA - тетрациклин-контролируемый трансактиватор, LITR - левые концевые инвертированные повторы, RITR - правые концевые инвертированные повторы, delta E1 - делеция области E1
генома аденовируса.
б - иммуноблот-анализ экспрессии гена M2 в составе рекомбинантного аденовируса Ad5-tet-M2NP. 1 - не трансдуцированные клетки 293HEK; 2 - клетки 293HEK, трансдуцированные рекомбинант-ным аденовирусом Ad5-null, не несущим трансгена; 3 - клетки 293HEK, трансдуцированные аденовирусом Ad5-tet-M2NP, 4 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-M2NP. в - иммуноблот-анализ экспрессии гена NP в составе рекомбинантного аденовируса Ad5-tet-M2NP. 1 - не трансдуцированные клетки 293HEK; 2 - клетки 293HEK, трансдуцированные рекомбинант-ным аденовирусом Ad5-null, не несущим трансгена; 3 - клетки 293HEK, трансдуцированные реком-бинантным аденовирусом Ad5-tet-M2NP, культивируемые в отсутствие доксициклина, 4 - клетки 293HEK, трансфицированные плазмидой pShuttle-M2NP.
В результате рекомбинации получена плазмида pAd-tet-M2NP, содержащая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса и генетическую конструкцию M2-2A-NP под контролем системы экспрессии tet-off (рис. 2, а).
Плазмидой pAd-tet-M2NP, предварительно гидроли-зованной рестриктазой PacI, трансфицированы клетки линии 293НЕК. Клетки культивировали в присутствии доксициклина и без него. На 7-10-е сутки после транс-фекции на монослое клеток, трансфицированных плаз-мидами pAd-null и pAd-tet-M2NP в присутствие докси-циклина, наблюдали образование специфических аденовирусных бляшек. В клетках, трансфицированных плазмидой pAd-tet-M2NP, в отсутствие доксициклина детектировать образование аденовирусных бляшек не удалось, что косвенно подтверждает данные о возможной токсичности антигенов вируса гриппа M2 и NP для эукариотических клеток.
Таким образом, нами получен рекомбинантный аденовирус, несущий гены, кодирующие антигены вируса гриппа А M2 и NP под контролем тетрациклин-зависимого промотора. Полученный аденовирус был размножен путем многократных пассажей в клетках линии 293НЕК в присутствии доксициклина и сконцентрирован в градиенте хлорида цезия. В результате был получен препарат с концентрацией 7-1012 вирусных частиц и титром 109 БОЕ/мл.
Экспрессия генов М2 и NP в составе рекомбинантного аденовируса Ad5-tet-M2NP подтверждена методом вестерн-блоттинга на культуре клеток 293HEK в отсутствии доксициклинна (см. рис.
2 б и в).
Нами была оценена имму-ногенность полученного аденовирусного препарата на мышах линии Balb/c. Мыши однократно иммунизированы Ad5-tet-M2NP в количестве 108 БОЕ/мышь, в качестве контрольных использовали животных, получивших Ad-null (108 БОЕ/мышь) и PBS. Через 21 день после иммунизации у мышей отбирали образцы сыворотки крови и анализировали их на наличие специфических антител к белкам М2 и NP при помощи непрямого ИФА. Было показано, что в сыворотках крови иммунизированных мышей присутствуют значимые уровни антител к антигенам вируса гриппа. Средний геометрический титр (СГТ) антител к белку М2 составил 43053, или 15,39 log2, а к белку NP - 3200, или 11,64 log.. В контрольных группах СГТ был менее 50. Данные, полученные нами при помощи ИФА, представлены на рис.
3 и свидетельствуют о том, что
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
17- а 18н 6
15- <D О 16- o i-
? 13- I11- £ /ч Ё 14-(0 a.
£ 9- CJ a v о 7- 8 CM j? 10-
^^ 1
PBS Ad-null Ad5-tet-M2NP PBS Ad-null Ad5-tet-M2NP
Рис. 3. Титры антител к антигенам M2 и NP в сыворотке крови мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ad5-tet-
M2NP.
а - титры антител к антигену M2. PBS - отрицательный контроль, Ad-null - мыши, получавшие рекомбинантный аденовирус, не несущий трансгена,
Ad5-tet-M2NP - мыши, получавшие рекомбинантный аденовирус Ad5-tet-M2NP. б - титры антител к антигену NP. PBS - отрицательный контроль, Ad-null - мыши, получавшие рекомбинантный аденовирус, не несущий трансгена, Ad5-tet-M2NP - мыши, иммунизированные рекомбинантным аденовирусом Ad5-tet-M2NP.
рекомбинантный аденовирус Ad5-tet-M2NP обладает достаточно высокой степенью иммуногенности и способен индуцировать образование значимых уровней антител к консервативным антигенам вируса гриппа А. Следует отметить, что нет надежных данных о протективном действии анти-NP-антител. Показано, что при гриппозной инфекции происходит выработка сильного Т-клеточного иммунного ответа к антигену NP, и скорее всего именно он должен вносить существенный вклад в протективность будущей вакцины. Поэтому в дальнейшем планируется изучение не только гуморального, но и клеточного иммунного ответа к целевым антигенам при иммунизации лабораторных животных.
В результате проделанной работы был получен препарат рекомбинантного аденовируса 5-го сероти-па, несущего гены, кодирующие консенсусные среди вирусов гриппа А человека антигены М2 и NP (Ad5-tet-M2NP). Для блокирования экспрессии целевых антигенов в составе экспрессирующей кассеты был использован тетрациклинзависимый индуцибельный промотор. Полученный аденовирус способен экс-прессировать целевые антигены вируса гриппа А в эукариотических клетках и индуцировать выработку специфических антител к антигенам М2 и NP у иммунизированных животных. Таким образом, полученный препарат рекомбинантного аденовируса может быть перспективным для создания кандидатной гриппозной вакцины и требует дальнейшего изучения иммуногенности и протективных свойств на лабораторных животных.
Сведения об авторах:
Есмагамбетов Ильяс Булатович - мл. научн. сотр. лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России; e-mail: dmitrovbo\@ mail.ru;
Седова Елена Сергеевна - канд. биол. наук, научн. сотр. лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России; e-mail: sedova-es@yandex.ru;
Щербинин Дмитрий Николаевич - мл. научн. сотрудник лаборатории молекулярной биотехнологии
ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, e-mail: dim284@inbox.ru
Лысенко Андрей Александрович - канд. биол. наук, научн. сотр. лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ "НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, e-mail: andrei.lvsenko@gmail.com
Гарас Максим Николаевич - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, e-mail: max.garas@yandex.ru Шмаров Максим Михайлович - д-р биол. наук, зав. лабораторией молекулярной биотехнологии ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, e-mail: mmshmarov@gmail.com
Логунов Денис Юрьевич - д-р биол. наук, зав. лабораторией клеточной микробиологии ФГБУ НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, e-mail: ldenisy@ yahoo.com
ЛИТЕРАТУРА
1. HolsingerL., Lamb R. Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabilized by formation of disulfide bonds. Virology. 1991; 183: 32-43.
2. Holsinger L., Nichani D., Pinto L., Lamb R. Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis. J. Virol. 1994; 68: 1551-63.
3. TakedaM., Pekosz A., ShuckK., Pinto L., Lamb R. Influenza A virus M2 ion channel activity is essential for efficient replication in tissue culture. J. Virol. 2002; 76: 1391-9.
4. Treanor J., Tierney E., Zebedee S., Lamb R., Murphy B. Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replicationin mice. J. Virol. 1990; 64: 1375-7.
5. Ito T., Gorman O., Kawaoka Y., Bean W., Webster R. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins. J. Virol. 1991; 65: 5491-8.
6. Schotsaert M., De Filette M., Fiers W., Saelens X. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments. Expert Rev. Vaccines. 2009; 8: 499-508.
7. Scholtissek C., Ludwig S., Fitch W.M. Analysis of influenza A virus nucleoproteins for the assessment of molecular genetic mechanisms leading to new phylogenetic virus lineages. Arch. Virol. 1993; 13 (3-4): 237-50.
8. ShuL.L., Bean W.J., Webster R.G. Analysis ofthe evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990. J. Virol. 1993; 67 (5): 2723-9.
9. AntrobusR.D., BerthoudT.K., Mullarkey C.E., HoschlerK., Coughlan L., Zambon M. et al. Coadministration of Seasonal Influenza Vaccine and MVA-NP+M1 Simultaneously Achieves Potent Humoral and CellMediated Responses.Mol. Ther. 2013. doi: 10.1038/mt.2013.162.
10. Седова Е.С., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Барыков Ю.А., Верховская Л.В., Логунов Д.Ю. и др. Протективные свойства кандидатных генно-инженерных вакцин против вируса гриппа птиц, созданных на основе рекомбинантных аденовирусных векторов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 3: 44-8.
11. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А. и др. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа H5. Acta Naturae. 2010; 2(1): 119-26.
12. GannageM., Dormann D., AlbrechtR., Dengjel J., Torossi T., Ramer P. et al. Matrix protein 2 of influenza A virus blocks autophagosome fusion with lysosomes. Cell Host. Microbe. 2009; 6(4): 367-80.
13. Ilyinskii P., Gabai V., Sunyaev S., Thoidis G., Shneider A. Toxicity of influenza A virus matrix protein 2 for mammalian cells is associated with its intrinsic proton-channeling activity. Cell Cycle. 2007; 6 (16): 2043-7.
14. Tripathi C., Batra J., Cao W., Sharma K., Patel J., Ranjan P. et al. Influenza A virus nucleoprotein induces apoptosis in human airway epithelial cells: implications of a novel interaction between nucleo-protein and host protein Clusterin. Cell Death Dis. 2013; 4: 562-74.
15. Butel J., Melnick J., Rapp F. Detection of biologically active adeno-virions unable to plaque in human cells. J. Bacteriol. 1966; 92(2): 433-8.
16. Donnelly M., Luke G., Mehrotra A., Li X., Hughes L., Gani D. et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. J. Gen. Virol. 2001; 82: 1013-25.
17. SzymczakA., Workman C., Wang Y., Vignalil K., Diliogloul S., Vanin E. et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 2004; 22 (5): 589-94.
REFERENCES
1. Holsinger L., Lamb R. Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabilized by formation of disulfide bonds. Virology. 1991; 183: 32-43.
2. Holsinger L., Nichani D., Pinto L., Lamb R. Influenza A virus M2 ion channel protein: a structure-function analysis. J. Virol. 1994; 68: 1551-63.
3. TakedaM., Pekosz A., ShuckK., Pinto L., Lamb R. Influenza A virus M2 ion channel activity is essential for efficient replication in tissue culture. J. Virol. 2002; 76: 1391-9.
4. Treanor J., Tierney E., Zebedee S., Lamb R., Murphy B. Passively transferred monoclonal antibody to the M2 protein inhibits influenza A virus replication in mice. J. Virol. 1990; 64: 1375-7.
5. Ito T., Gorman O., Kawaoka Y., Bean W., Webster R. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins. J. Virol. 1991; 65: 5491-8.
6. Schotsaert M., De Filette M., Fiers W., Saelens X. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments. Expert Rev. Vaccines. 2009; 8: 499-508.
7. Scholtissek C., Ludwig S., Fitch W. Analysis of influenza A virus nucleoproteins for the assessment of molecular genetic mechanisms leading to new phylogenetic virus lineages. Arch. Virol. 1993; 13 (3/4): 237-50.
8. ShuL.L., Bean W.J., WebsterR.G. Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1993 to 1990. J. Virol. 1993; 67 (5): 2723-9.
9. AntrobusR.D., BerthoudT.K., MullarkeyC.E., Hoschler K., Coughlan L., ZambonM. et al. Coadministration of seasonal influenza vaccine and MVA-NP+M1 simultaneously achieves potent humoral and cellmediated responses. Mol Ther. 2013. doi: 10.1038/mt.2013.162.
10. SedovaE.S., ShmarovM.M., TutykhinaI.L., Barykov Yu.A., Verkhovs-kaya L.V., Logunov D.Yu. et al. Protective properties of candidate
gene engineering vaccines against avian influenza virus, developed on the basis of recombinant adenoviral vectors. Zhurnal Microbiología. 2010; 3: 44-8 (in Russian).
11. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., BogachevaE.A., Barykova Yu.A. et al. Induction of a protective het-erosubtypic immune response against the influenza virus by using recombinant adenoviral vectors expressing hemagglutinin of the influenza H5 virus. Acta Naturae. 2010; 2(1): 119-26 (in Russian).
12. Gannage M., Dormann D., Albrecht R., Dengjel J., Torossi T., Ramer P. et al. Matrix protein 2 of influenza A virus blocks autophagosome fusion with lysosomes. Cell Host Microbe. 2009; 6(4): 367-80.
13. Ilyinskii P., Gabai V., Sunyaev S., Thoidis G., Shneider A. Toxicity of Influenza A Virus Matrix Protein 2 for Mammalian Cells is Associated with its Intrinsic Proton-Channeling Activity. Cell Cycle. 2007; 6 (16): 2043-7.
14. Tripathi C., Batra J., Cao W., Sharma K., Patel J., Ranjan P. et al. Influenza A virus nucleoprotein induces apoptosis in human airway epithelial cells: implications of a novel interaction between nucleo-protein and host protein Clusterin. Cell Death Dis. 2013; 4: 562-74.
15. Butel J., Melnick J., Rapp F. Detection of Biologically Active Adeno-virions Unable to Plaque in Human Cells. J. Bacteriol. 1966; 92(2): 433-8.
16. Donnelly M., Luke G., Mehrotra A., Li X., Hughes L., Gani D. et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein cleavage mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal skip. J. Gen. Virol. 2001; 82: 1013-25.
17. Szymczak A., Workman C., Wang Y., Vignalil K., Diliogloul S., Vanin E. et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat. Biotechnol. 2004; 22 (5): 589-94.
Поступила 03.09.13
CONSTRUCTION OF RECOMBINANT ADENOVIRAL VECTOR EXPRESSING GENES OF THE CONSERVATIVE INFLUENZA PROTEINS M2 AND NUCLEOPROTEIN
I. B. Esmagambetov, E. S. Sedova, D. N. Shcherbinin, A. A. Lysenko, M. N. Garas, M. M. Shmarov, andD. Y. Logunov
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
Influenza is a highly contagious and one of the most massive infection diseases. General epidemiological significance has a strain, which belongs to subtype A. A high degree of genetic variety leads to the permanent changes in the antigenic structure of the influenza virus. Therefore, the current influenza vaccines require periodic updating of the composition of strains. Presently, it is important to develop a universal vaccine that can protect against different strains of influenza A virus at the same time and is based on the conserved antigens of the influenza virus. The recombinant adenovirus vectors expressing genes of conserved viral antigenes may be a promising candidate vaccine against influenza A. Using the method of the homologous recombination, we developed in this study recombinant adenovirus of fifth serotype that expresses genes of the ion channel M2 and nucleoprotein NP of the influenza virus A. Genes of the consensus protein M2 and NP of human influenza A virus were included into the structure of the viral genome. The expression of the antigens M2 and NP using recombinant adenovirus vector was detected by a Western blot assay. The immunogenicity of the developed recombinant adenovirus vector was demonstrated by the intranasal immunization of laboratory mice.
Key words: Recombinant adenovirus, influenza virus A, M2 ion channel, nucleoprotein NP, immunization
