CC BY
15
DOI: 10.24412/2074-5036-2022-3-68-75 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: плазмида, липофектамин, вирус ящура, матричная РНК, 146S компонент. Keywords: plasmid, lipofectamine, FMD virus, matrix RNA, 146Sparticles.
Доронин М. И., Михалишин Д. В., Гусева М. Н., Михалишин В. В., Жбанова Т. В., Пронин В. В.
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ P JET 1.2 SF GFP-146S FMDV ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ ПРИ ОПОСРЕДОВАННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ 146S КОМПОНЕНТА ВИРУСА ЯЩУРА В СЫРЬЕ ДЛЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН
CONSTRUCTION OF THE PLASMID P JET 1.2 SF GFP-146S FMDV TO OBTAIN POSITIVE CONTROL FOR THE INDIRECT DETERMINATION OF THE CONCENTRATION OF THE 146S PARTICLES OF THE FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS IN THE RAW MATERIALS
FOR INACTIVATED VACCINES
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин М. И., к. б. н., ведущий научный сотрудник, е-mail: doronin@arriah.ru Doronin M. I., PhD in Biological Science, Leading Researcher, е-mail: doronin@arriah.ru Михалишин Д. В., доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией, е-mail: mihalishindv@arriah.ru Мichalishin D. V., Doctor of Veterinary Science, Head of the Laboratory, е-mail: mihalishindv@arriah.ru Гусева М. Н., к. б. н., старший научный сотрудник, е-mail: guseva_mn@arriah.ru Guseva M. N., PhD of Biological Science, Senior Researcher, e-mail: guseva_mn@arriah.ru Михалишин В. В., доктор ветеринарных наук, профессор, эксперт, е-mail: mihalishin@arriah.ru Мichalishin V. V., Doctor of Veterinary Science, Professor, Expert, e-mail: mihalishin@arriah.ru Жбанова Т. В., кандидат биологических наук, заведующая аспирантурой, секретарь диссертационного совета,
е-mail: zhbanova@arriah.ru Zhbanova T. V., PhD of Biological Science, Head of Post-Graduate Study, Secretary of the Dissertation Council,
e-mail: zhbanova@arriah.ru Пронин В. В., доктор биологических наук, профессор, руководитель центра, е-mail: pronin@arriah.ru Pronin V. V., Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Center, е-mail: pronin@arriah.ru
Аннотация. В данной статье рассмотрены основные моменты, касающиеся синтеза модифицированной плаз-миды с помощью технологии Golgen Gate, трансфекции сконструированной кольцевой ДНК в клетки линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH для получения положительного контрольного образца таргетного участка 3Б-гена матричной РНК вируса ящура при опосредованном контроле концентрации 146S компонента в сырье для изготовления инактивированных вакцин. Вектор назначения p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV сконструирован на основе плазмиды p Jet 1.2 sf, содержащей ген флуоресцирующего зеленого белка GFP, целевого участка кДНК вируса ящура (фрагмент 3D-rem в позициях 7639...7844 п. н.) с применением технологии высокопроцессивного клонирования Golden Gate и эндонуклеазы рестрикции BsaI. В ОТ-ПЦР-РВ с применением разработанных нами модифицированных праймеров синтезированы продукты реакции амплификации, содержащие требуемые адапторы. Проведена рестрикция по сайтам узнавания с формированием «липких» концов с последующим простым лигированием по принципу комплементарности синтезированных участков плазмиды и таргентного фрагмента. Осуществлен анализ сконструированного вектора ввода in silico с помощью рестриктазы BsmBI с получением трех фрагментов кДНК ожидаемых размеров: 2527, 162, 69 п. н. Проведена трансфекция клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH in vitro полученной плазмидой p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV с помощью липофек-тамина 3000 и доказана эффективность данной процедуры опосредованно с помощью зеленой флуоресценции белка GFP, экспрессия которого проводилась за счет встроенной в клетки модифицированной плазмиды. Для тест-системы по опосредованному определению концентрации 146S компонента вируса ящура с разработанным положительным контролем мРНК в 95 %-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 99,57-100,00 %, диагностическая специфичность - 98,17-100 %, k-критерий - 1,000, прогно-стичность положительного результата - 100 %, прогностичность отрицательного результата - 100 %, общая точность - 99,65-100,00 %.
Summary. This article discusses the main points concerning the synthesis of a modified plasmid using Golgen Gate technology, its transfection into BHK-21/SUSP/ARRIAH cells to obtain a positive control sample of the target site of the 3D gene of the FMD virus matrix RNA with indirect control of the plasmid concentration 146S particles in raw materials for the production of inactivated vaccines. The target vector p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV is constructed on the basis of the plasmid p Jet 1.2 sf containing the gene of the fluorescent green protein GFP, the target region of the FMD virus cDNA (a fragment of the 3D gene at positions 7639...7844 bp) using the technology of highly efficient Golden Gate process cloning and Bsal restriction endonuclease. The amplification reaction products containing the necessary adapters were synthesized in real time RT-PCR using modified primers. Restriction was performed on recognition sites with the formation of "sticky" ends, followed by simple ligation according to the principle of complementarity of synthesized plasmid sections and target fragments. The constructed insertion vector in silico was analyzed using BsmBI restrictase to obtain cDNA fragments of the expected size: 2527, 162, 69 bp. BHK-21/SUSP/ARRIAH cells were transfected in vitro with the obtained plasmidp Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV using lipofectamine 3000, and the effectiveness of this procedure was proved indirectly using green fluorescence of the GFP protein, the expression of which was carried out by a modified plasmid embedded in cells. For the test system for indirect determination of the concentration of the 146S particles of the FMD virus with developed positive mRNA control in the 95 % confidence interval, diagnostic sensitivity was 99.57-100.00 %, diagnostic specificity - 98.17-100 %, k-criterion - 1000, prognosticality of a positive result - 100 %, prognosticality of a negative result - 100 %, overall accuracy - 99.65-100.00 %.
Введение
В последние годы в области молекулярной биологии произошел прорыв, связанный с открытием различных методов молекулярного клонирования, позволяющих создавать рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, проводить трансфекцию различных клеток с помощью векторных конструкций с последующим управлением процессами репликации, транскрипции и трансляции белковых молекул. Новое направление позволяет исследовать механизмы экспрессии таргетных участков генома, отдельных интересующих генов, в том числе вирусов животных, особенности конструирования матричных РНК и белковых молекул [4].
Основным компонентом для высокопро-цессивного клонирования является векторная система, позволяющая осуществлять трансфекцию таргетного фрагмента в клетку. Плазмидами являются двуцепочечные кольцевые небольшие по размерам молекулы ДНК, которые способны к автономному процессу репликации. Данные нуклеотидные последовательности включают в себя генные регуляторные элементы для управления механизмами экспрессии больших фрагментов ДНК [9].
Существует ряд плазмид, который обеспечивает процесс экспрессии матричных молекул РНК, в частности, p Jet 1.2 sf GFP. Данная плазмида является маркерной, поскольку содержит в своей структуре ген белка, способного к флуоресценции зеленым
цветом (GFP). Представленная плазмидная ДНК может функционировать в бактериальных клетках и обладает устойчивостью к ампициллину (AmpR). Структуру pJet 1.2 sf GFP можно применять для встраивания в нее целевых фрагментов генов или группы генов между T7 promotor и рибозимом вируса гепатита дельта (HDV ribozyme). HDV представляет собой некодирующую молекулу РНК, обнаруженную в структуре данного вируса, которая необходима для репликации нуклеиновой кислоты и является единственным известным вирусом человека, который использует активность рибозима для заражения своего хозяина [17]. Данная особенность позволяет проводить синтез РНК нужной последовательно сти, которую в последующем можно применять в качестве контроля для проведения опосредованного количественного анализа с помощью известных молеку-лярно-биологических методов, в частности, ПЦР. В том случае, если применяется другой тип плазмид, то для аналогичной процедуры требуется использовать промотер U6 [2].
Схема молекулярного клонирования на первом этапе предполагает подбор оптимальной плазмиды, а также амплификацию и очистку таргетного участка молекулы нуклеиновой кислоты. Процесс вырезания целевого фрагмента проводят с применением эн-донуклеаз рестрикции, либо синтезируют из отдельных нуклеотидов химическим способом. На следующем этапе осуществляют процесс линеаризации с помощью рестриктаз.
69
Свободные концы разрезанной плазмиды и амплифицированного таргетного участка модифицируют с помощью различных ну-клеотидных «присадок», а затем проводят лигирование с использованием ДНК-лигаз, рекомбиназ или механизмов репарации in vivo. Сконструированную плазмиду подвергают трансформированию в клетку [19] (рисунок 1).
Одним из удобных и современных подходов в области молекулярного высокопро-цессивного клонирования является технология Golden Gate, которая дает возможность синтезировать множественные упорядоченные вставки нуклеиновой кислоты благодаря эндонуклеазам рестрикции II типа и ДНК-лигазе бактериофага T4 [7]. Эндонуклеазы рестрикции представляют собой ферменты, которые определяют специфические участки в ДНК и вносят разрывы в сайте узнавания, либо на определенном расстоянии от него. При этом рестриктазы проводят гидролиз фосфодиэфирной связи в середине молекулы нуклеиновой кислоты, что важно для проведения молекулярного клонирования [14, 15]. Данные ферменты способны разрезать молекулу ДНК на определенном расстоянии от сайта узнавания и, тем самым, формировать непалиндромные липкие концы. За счет возможности получить любой из 256 различных комбинаций «липких» концов размером по 4 нуклеотидных остатков становится возможным конструирование молекулы нуклеиновой кислоты из большого числа фрагментов. Технология Golden Gate позволяет конструировать более 35 участков с эффективностью экспрессии не менее 95 %. При наличии меньшего количества вставок точность метода возрастает до 100 % [8]. В протоколах представленной технологии применяют следующие эндонуклеазы рестрикции: BsaI, Bsa-HF-v2, BbsI, BbsBI-v2, Esp3I, SapI, BtgZI, BspQI. Наиболее часто в лабораторной практике используют рестриктазу BsaI, которая получена на основе штамма E. coli, несущего клонированный и модифицированный ген BsaI Bacillus stearothermophilus в позициях 6-55 н. о. Одна единица активности (е. а.) данного фермента представляет собой количество рестриктазы, необходимое для
70
расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pXba за 1 час при температуре 37±0,5 °С в реакционной смеси объемом 50 мкл [6, 10, 11]. Сайт узнавания, активность в NEB-буфере, а также рекомендуемый буферный раствор, температуры инкубации и инактивации для эндонуклеазы рестрикции BsaI представлены на рисунке 2.
Готовую плазмиду трансфицируют в клетки для последующей экспрессии генов. В последние годы в научных публикациях [5, 8, 16] появилась информация о применении для осуществления данной процедуры липофек-тамина. Он представляет собой липидные субъединицы, которые могут образовывать липосомы в водной среде, которые захватывают плазмиды. Липофектамин состоит из смеси DOSPA (2,3-диолеоилокси-К- [2(спер-минкарбоксамидо) этил]-К, N-диметил-Г пропаниминий трифторацетата) и липид DOPE в соотношении 3:1. Данный комплекс соединяется с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот, позволяя им преодолевать электростатическое отталкивание от клеточной мембраны [5, 20]. Для того чтобы клетка могла экспрессиро-вать трансген, нуклеиновая кислота должна достичь ядра клетки. Однако трансфициро-ванный генетический материал может быть вовсе разрушен где-то в процессе доставки в цитоплазме. В делящихся клетках липо-сома в комплексе с липофектамином может успешно достигать ядра, проходя через ядерную оболочку после митоза [5, 12].
В последние годы в мировой и отечественной практике стали широко используются методы молекулярно-биологического анализа, в частности, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для количественного анализа содержания вируса в суспензии. Так, в 2017 г. разработан метод ОТ-ПЦР-РВ для определения концентрации 146S иммуногенного компонента вируса ящура в сырье для изготовления вакцин [3]. Для повышения точности проводимого анализа необходимо применять дополнительный положительный контрольный образец таргетного фрагмента матричной РНК вируса ящура, для получения которого требуется
использовать методы молекулярного клонирования.
Цель исследования заключалась в разработке и конструировании плазмиды pJet 1.2 sf GFP-146 S FMDV для получения положительного контроля при опосредованном определении концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для инактивированных вакцин.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали вирус ящура штамма А/Забайкальский/2013, который является производственным и депонирован в Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Выделение РНК осуществляли с помощью фенол-хлороформной экстракции по стандартному протоколу [18].
Обратная транскрипция. Реверсию РНК вируса ящура проводили с применением набора для проведения реверсии с гексамерами (Applied Biosystems).
ПЦР. Реакцию амплификации целевого фрагмента кДНК вируса ящура осуществляли в соответствии с требованиями Руководства МЭБ (OIE) [13].
Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля. Экстракцию ампликонов из 1,0 %-ного агарозного геля проводили с использованием набора реагентов GeneJET Gel Extraction.
Плазмида. В качестве вектора встраивания применяли плазмиду pJet 1.2 sf GFP (размер 2499 п. н., рисунок 3).
Рестрикция. Разрезание фрагментов кДНК и кольцевой плазмиды проводили с помощью рестриктазы Bsa I со следующими сайтами рестрикции и разрезания: GGTCTCNNNNN.
Лигирование фрагментов по «липким» концам осуществляли при смешивании участка кДНК вируса ящура и линеаризированного вектора назначения.
Гель-электрофорез. Для подтверждения факта правильной сборки плазмиды проводили ее рестрикцию с помощью фермента BsmBI. Проводили электрофорез в 1%-ном агарозном геле in silico в программе
Рис. 1. Общая классическая схема молекулярного клонирования (с сайта: https://www.skygen.com, схема модифицирована)
Bsa I
Сайт узнавания: GGTCTCN* CCAGAGNNNNNa
Активность, NEB: NEBuffer 1 NEBuffer 2 NEBuffer 3 NEBuffer 4
75% 75% 100% 100%
Рекомендуемый буфер: HEB: NEBuffer 3
Температура инкубации: 50CC
Тепловая инактивация: 65SC for 20 minutes.
Ссыпки: Bsa I. NEB
Рис. 2. Общая характеристика рестриктазы BsaI (с сайта: http://molbiol.edu.ru)
Рис. 3. Карта плазмиды pJet 1.2 sf GFP с сайтами рестрикции и указанием позиций T7 promoret и HDV ribozime
А
Б
Рис. 4. «Липкие» концы в составе плазмиды p Jet 1.2 sf GFP. А - нуклеотидная последовательность, Б - плазмида
V1
А
Б
Рис. 5. Демонстрация липких концов и результатов лигирования двух фрагментов: плазмиды и участка кДНК вируса ящура (BD-ген). А - нуклеотидная последовательность, Б - собранная плазмида p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV
# Ends Coordinates Length (bp)
1 BsmBI-BsmBI 2570-2338 2527
2 BsmBI-BsmBI 2339-2500 162
3 BsmBI-BsmBI 2501-2569 69
Рис. 6. Результаты гель-электрофореза после разрезания сконструированной плазмиды p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV рестриктазой BsmBI
Рис. 7. Флуоресценция клеток линии BHK-21/SUSP/ ARRIAH после трансфекции сконструированной плазмиды p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV
NEB Cutter. Ожидаемые размеры фрагментов следующие: 2527, 162, 69 п. н.
Трансфекция клеток. Сконструированный вектор использовали для трансфекции клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, которая депонирована в Специализированной коллекции культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН. Для данной процедуры применяли трансфекционный коммерческий препарат липофектамин 3000 (Invitrogen).
Статистическая обработка данных. Определяли следующие диагностические показатели исследуемых тест-систем: диагностическая чувствительность (DSe), диагностическая специфичность (DSp), k-критерий (индекс Каппа Коэна), прогностичность положительного результата (PPV), прогностичность отрицательного результата (NPV), диагностическая точность (DAc) в соответствии с общепринятыми методиками [1].
Результаты исследований и обсуждение
Конструирование плазмиды с целевым участком кДНК вируса ящура для получения контрольной мРНК. В данной работе проводили исследования по конструированию плазмиды, содержащей таргетный фрагмент нуклеиновой кислоты вируса ящура, с целью получения положительного контрольного образца для определения концентрации 146S компонента вируса в сырье для вакцин. Для синтеза модифицированной плазмиды p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV использовали технологию высокопроцессивного клонирования Golden Gate.
Проводили исследования по конструированию модифицированного участка 3D-re^ кДНК вируса ящура в позициях 7639...7844 п. н. (дизайн: CTATGAGGGAGTTGAGCTGGACACTTAC ACCATGATCTCCTACGGAGACGACATCG TGGTTGCAAGTGATTACGATCTGGACTT CGAGGCCCTCAAGCCTCACTTCAAATCT CTTGGTCAAACCATCACCCCAGCTGACA AAAGCGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC ACTCCATCACCGACGTCACTTTCCTCAA AAGACACTTCC). Именно для амплификации данного участка кДНК были выше разработаны олигонуклеотидные праймеры.
72
На концы выбранной последовательности в процессе реакции амплификации «пришивали» следующие адапторные последовательности:
5'-конец: 5' GTA GGT СТС AGCAT 3' 3'-конец: 5' GTA GGT СТС TAAGG 3' (- сайты рестрикции фермента Bsa I).
Представленные адапторы позволили сформировать «липкие» концы, которые образуются после обработки рестриктазой класса II Б. Применяли эндонуклеазу рестрикции BsaI с NEBuffer 3 и активностью 1 е. а. на реакцию.
Адаптор, расположенный на 3'-конце, размещали с учетом функции ВюЕёй «реверсия-комплементарность» в направлении 5'^3'.
Для синтеза модифицированной последовательности проводили реакцию амплификации с применением двух следующих праймеров (подчеркнуты участки для ком-плементарности с последовательностями плазмиды):
F: 5 - GTA GGT CTC AGCAT GTGCTCTACGCGTTGCGTAGACA -3'
R: 5 - GTA GGT CTC TAAGG ACATGGACTATGGAACTGGGTT -3'
В результате получили продукты ПЦР, содержащие таргетный участок и адапторы:
5'GTAGGTCTCAGCTAGTGCTCTACGC GTTGCGTAGACA
CTATGAGGGAGTTGAGCTGGACACTT ACACCATGATCTCCTACGGAGACGACAT CGTGGTTGCAAGTGATTACGATCTGGAC TTCGAGGCCCTCAAGCCTCACTTCAAAT CTCTTGGTCAAACCATCACCCCAGCTGA CAAAAGCGACAAAGGTTTTGTTCTTGGT CACTCCATCACCGACGTCACTTTCCTCA AAAGACACTTCCAACCCAGTTCCATAGT CCATGTGGAATGAGACCTAC 3'
Полученные концевые участки нуклеоти-дов в целевой последовательности и плазми-де отражены на рисунках 4, 5.
Проводили электрофорез для синтезированных ампликонов с их дальнейшим выделением и очисткой.
Плазмиду pJet 1.2 sf GFP и продукты ПЦР обрабатывали рестриктазой BsmBI, в результате этого формировались «липкие» 5'- и 3'-концы. После соединения в одной пробирке всех компонентов (плазмида и модифици-
рованный кодирующий фрагмент) происходило их лигирование по «липким» концам (рисунок 5).
С помощью программы NEBCutter для разрезания плазмид и линейных ДНК рестрикта-зами получили электрофореграмму с тремя фрагментами (первый фрагмент: 2570-2338 п. н., 2527 п. н., второй фрагмент: 2339-2500 п. н., 162 п. н., третий фрагмент: 2501-2569 п. н., 69 п. н.), как отражено на рисунке 6.
Полученной плазмидой провели транс-фекцию клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH in vitro с помощью липофектамин 3000 для синтеза в процессе экспрессии генов плаз-миды, в том числе участка 3D-rera мРНК вируса ящура. Данный липофильный комплекс позволяет увеличить эффективность плаз-мидной ДНК в клеточные линии in vitro путем липофекции [5]. Суспензию полученных клеток после трансфекции культивировали в течение 48 ч, подвергали центрифугированию и полученный супернатант использовали в качестве положительного контроля для ОТ-ПЦР-РВ, поскольку он содержал мРНК вируса ящура. Доказательством трансфек-ции клеток являлось их зеленое свечение благодаря флуоресцирующему белку GFP, экспрессия которого проводилась за счет встроенной плазмиды p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV (рисунок 7).
На заключительном этапе работы проводили ОТ-ПЦР-РВ с разработанным положительным контролем на основе сконструированной плазмиды p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV для опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для инактивированных вакцин. Определили диагностические показатели для данного способа. Для оценки диагностической чувствительности предложенного теста для ящура исследовали 850 образцов суспензий вируса ящура (1 700 000 л сырья), которые являлись заведомо положительными по данным исследования в РСК. Концентрация 146S компонента в данных пробах находилась в диапазоне 0,1-3,0 мкг/ мл. Для определения диагностической специфичности исследовали 200 отрицательных образцов суспензий клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, не инфицированных
73
вирусом ящура. Постановку анализа проводили в соответствии с ранее описанной методикой [3]. При интерпретации результатов исследования положительными считали пробы, которые содержат 146S компонент, отрицательными - пробы, в которых вирус ящура отсутствует и в РСК не формируется профиль для структурных компонентов. В результате в ОТ-ПЦР-РВ определили, что количество истинно положительных проб (а) -850, количество ложноотрицательных (b) - 0, количество ложноположительных проб (с) -0, количество истинно отрицательных (d) -200. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа рассчитали, что Se составила 100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 99,57-100,00 %), Sp -100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,17-100 %), k-критерий - 1,000, PPV -100 %, NPV - 100 %, Ac - 100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 99,65-100,00 %).
Заключение
Сконструировали вектор назначения p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV на основе плазмиды p Jet 1.2 sf, содержащий ген флуоресцирующего зеленого белка GFP, целевого участка кДНК вируса ящура (фрагмент 3D-rern в позициях 7639.7844 п. н.) с применением технологии высокопроцессивного клонирования Golden Gate и эндонуклеазы рестрикции BsaI класса II S. В ОТ-ПЦР-РВ с применением модифицированных праймеров синтезированы продукты реакции амплификации, содержащие требуемые адапторы. Провели рестрикцию по сайтам узнавания с формированием «липких» концов с последующим простым лигированием по принципу ком-плементарности синтезированных участков плазмиды и таргентых фрагментов.
Осуществили анализ полученного вектора ввода in silico с помощью рестриктазы BsmBI с получением фрагментов кДНК ожидаемого размера: 2527, 162, 69 п. н.
Провели трансфекцию клеток ВНК-21/ SUSP/ARRIAH in vitro полученной плазми-дой p Jet 1.2 sf GFP-146S FMDV с помощью липофектамин 3000 и определили высокую эффективность данной процедуры опосредованным способом по детекции зеленой флу-
74
оресценции белка GFP, экспрессия которого проводилась за счет встроенной в клетки модифицированной плазмиды.
Доказали, что для тест-системы по опосредованному определению концентрации 146S компонента вируса ящура с применением разработанного положительного контроля в 95 %-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 99,57-100,00 %, диагностическая специфичность - 98,17-100 %, k-критерий - 1,000, прогностичность положительного результата - 100 %, прогностичность отрицательного результата - 100 %, общая точность - 99,65100,00 %.
Список литературы
1. Васильева Л. А. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве: учеб. пособие / Л. А. Васильева. Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2007. 124 с.
2. Компания iGEM. Информация о разных последовательностях промоторов, терминаторов. URL: http://parts.igem.org/Promoters/Catalog. (Дата обращения: 17.05.2022).
3. Патент РФ № 2619878, G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ определения концентрации 146S компонента вируса ящура в вирусосодержащем сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ: № 2016140460; заявл. 14.10.2016; опубл. 18.05.2017.
4. Ashwini M. Advances in Molecular Cloning / M. Ashwini, S. B. Murugan, S. Balamurugan // Mol Biol (Mosk). 2016, Jan-Feb. V. 50(1). P. 3-9.
5. Dalby B. Advanced Transfection with Lipofectamine Reagent: Primary Neurons, siRNA, and Tigh-Throughput Applications / B. Dalby, S. Cates, A. Harris [et al.] // Methods. 2004. V.33 (2). P. 95-103.
6. Dryden D. T. Nucleoside Triphosphate-Dependent Restriction Enzymes / D. T. Dryden, N. E. Murray, D. N. Rao // Nucleic Acids Research. 2001. V.29 (18). P. 3728-41.
7. Engler C. Golden Gate Cloning / C. Engler, S. Marillonnet // Methods Mol Biol. 2014. V. 1116. P. 119-131.
8. HamediRad M. Highly Efficient Single-Pot Scarless Golden Gate Assembly / M. HamediRad, S. Weisberg, R. Chao // ACS Synth Biol. 2019. V. 8(5). P. 1047-1054.
9. Lessard J. C. Molecular Cloning. / J. C. Lessard // Methods Enzymol. 2013; 529. P. 85-98.
10. Massey A. Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students / A. Massey, H. Kreuzer // Washington, D.C.: ASM Press. 2001. ISBN 1-55581-176-0.
11. Mierzejewska K. Structural Basis of the Methylation Specificity of R.Dpnl / K. Mierzejewska, W. Siwek, H. Czapinska [et al.] // Nucleic Acids Research. 2014. V. 42 (13). P. 8745-54.
12. Ninfa J. P. Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology / J. P. Ninfa, D. P. Balou, M. Benore // Hoboken, N. J.: John Wiley & Sons. 2010. 341 p.
13. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, 2018. Chapter 2.1.8.
14. Revolutionizing Biotechnology with Artificial Restriction Enzymes. Genetic Engineering and Biotechnology News. 10 February 2017. Retrieved 27 May 2021. (reporting on Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes).
15. Roberts R. J. How Restriction Enzymes Became the Workhorses of Molecular Biology. / R. J. Roberts // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. V. 102 (17). P. 59055908.
16. Roberts R. J. REBASE-enzymes and Genes for DNA Restriction and Modification / R. J. Roberts, T. Vincze, J. Posfai [et al.] // Nucleic Acids Research. 2007. V. 35 (Database issue): D269-70.
17. Snap Gene. pJet 1.2. // URL: https:// www.snapgene.com/resources/plasmidfiles/?set
=basic_cloning_vectors&plasmid=pJET1.2 (Дата обращения: 14.04.2022).
18. Vomelova I. Methods of RNA Purification. All ways (should) lead to Rome / I. Vomelova, Z. Vanickova, A. Sedo // Folia Biol (Praha). 2009. V. 55(6). P. 243-251.
19. Weber E. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs / E. Weber, C. Engler, R. Gruetzner [at al.] // PLoS One. 2011 Feb. V. 18;6(2):e16765.
20. Wu P. Recombinant T7 Phage with FMDV AKTIII Strain VP1 Protein is a Potential FMDV Vaccine / P. Wu, X. Yin, Q. Liu // Biotechnol Lett. 2021. V. 43(1). P. 35-41.
Исследование выполнено в рамках научного направления ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Ветеринарное благополучие». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
DOI: 10.24412/2074-5036-2022-3-75-83 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: титр антител против вируса ящура, жидкофазный непрямой вариант ИФА, штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015, генотип A/ASIA/G-VII
Keywords: titer of antibodies against FMD virus, liquid-phase indirect version of ELISA, strain A No.2269/ARRIAH/2015, genotype A/ASIA/G-VII
Доронин М. И., Луговская Н. Н., Михалишин Д. В., Клюкина Н. Д., Оковытая Т. В., Гочмурадов Ы. М.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА ЯЩУРА ШТАММА А №2269/ВНИИЗЖ/2015 ГЕНОТИПА A/ASIA/G-VII С ПОМОЩЬЮ ЖИДКОФАЗНОГО БЛОКИРУЮЩЕГО НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА ИФА
DETERMINATION OF THE TITER OF ANTIBODIES AGAINST THE FMD VIRUS STRAIN A NO.2269/ARRIAH/2015 GENOTYPE A/ASIA/G-VII USING A LIQUID-PHASE BLOCKING
INDIRECT VARIANT OF ELISA
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centrefor Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution. Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur'evets
Доронин М. И., к. б. н., ведущий научный сотрудник, докторант, е-mail: doronin@arriah.ru Doronin M. I., PhD in Biological Science, Leading Researcher, Doctoral Student, e-mail: doronin@arriah.ru Луговская Н. Н., к. б. н., ведущий научный сотрудник, е-mail: lugovskaya@arriah.ru Lugovskaya N. N., PhD in Biological Science, Leading Researcher, e-mail: lugovskaya@arriah.ru Михалишин Д. В., д. в. н., заведующий лабораторией, е-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D. V., Doctor of Veterinary Science, Head of the Laboratory, e-mail: mihalishindv@arriah.ru Клюкина Н. Д., к. в. н., старший научный сотрудник, е-mail: klukina@arriah.ru Klukina N. D., PhD in Veterinary Science, Senior Researcher, e-mail: klukina@arriah.ru Оковытая Т. В., к. б. н., старший научный сотрудник, е-mail: okovitaya@arriah.ru Okovitaya T. V., PhD in Biological Science, Senior Researcher, e-mail: okovitaya@arriah.ru Гочмурадов Ы.М., аспирант, e-mail: gochmuradov@arriah.ru Gochmuradov I. M., Post-Graduate Student, e-mail: gochmuradov@arriah.ru
