CC BY
93
Том 153, кн. 3
Естественные науки
2011
УДК 547.1'128.577.15.025
КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА КРЕМНИЯ И Zn(II) КАК МОДУЛЯТОР АКТИВНОСТИ ПРОТЕИНАЗ
А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева, О.И. Медведева, Вл.В. Горбачук, Л. С. Якимова, И.И. Стойкое, Н.А. Улахович
Аннотация
Проведена модификация поверхности наночастиц на основе диоксида кремния (SiO2(NH2)n) 3-аминопропилтриметоксисиланом. Средний размер частиц составил 43.6 нм. Индекс полидисперсности PDI 0.25. Оценена биохимическая активность системы протеиназ Candida albicans в присутствии SiO2(NH2)n. Установлено, что введение SiO2(NH2)n как в гомогенную систему индуцируемой протеиназы SAP2, так и в гетерогенную систему конститутивного фермента SAP4 приводит к изменению протеолити-ческой активности. Увеличение концентрации SiO2(NH2)n в растворе приводит к снижению степени полидисперсности и к уменьшению диаметра наночастиц. Методом Скэтчарда определены константы связывания в системах [SAP2 - SiO2(NH2)n], [гемоглобин - SiO2(NH2)n]. И гемоглобин, и SAP2 связываются с наночастицами по одному участку биомолекулы: KA 8.9-106 и 7.65-107 моль1 соответственно. Логарифмы значения констант устойчивости составили 4.73 ± 0.20 и 5.25 ± 0.04 для координационных форм [Zn(II) - SAP2 C. alb.] и [Zn(II) - SAP4 C. alb.] соответственно. Одновременное введение в систему SAP2 C. alb - Hb ионов Zn(II) и наночастиц на основе диоксида кремния приводит к ярко выраженному эффекту ингибирования протеолиза субстрата. Причем действие композиции значительно эффективнее, чем действие отдельных компонентов.
Ключевые слова: аминомодифицированные наночастицы, секреторная аспараги-новая протеиназа Candida albicans, константы аффинности, константы устойчивости.
Введение
Подавляющее большинство вирусов и бактериальных культур обеспечены системой собственных ферментов, регулирующих их активность как патогенной субстанции [1]. Ионы металлов известны как активные регуляторы ферментативной активности [2-5]. Среди ионов биофильных ^металлов, большинство из которых имеют переменную степень окисления, можно выделить ионы 2п(П). Низкая окислительно-восстановительная активность делает ион 2п(П) стабильным в биологических средах, потенциал которых постоянно изменяется. Поэтому ионы 2п(П) являются идеальными для регулирования реакций, которые требуют участия редокс-стабильных ионов. К данному типу реакций относятся и протеолитические реакции. При комплексообразовании 2п(П) имеет энергию стабилизации кристаллическим полем, равную нулю в любом лигандном окружении и геометрии. Во всех соединениях с ферментами 2п(П) в основном присутствует в виде тетраэдрических координационных соединений,
в которых ион металла связан с тремя или четырьмя аминокислотными остатками белковых цепей. Однако иногда наблюдается и пятичленная координация (тригональная бипирамида) или шестичленная координация с октаэдрической ориентацией донорных атомов [6].
Использование металлокомплексов в регулировании ферментативной активности позволяет сочетать специфичность и в зависимости от природы лиганда программировать изменение активности фермента. ГРП (гиперразветвленные полимеры) на основе органических и неорганических соединений обладают полифункциональностью в сочетании с наноразмерностью молекул [7]. Разветвленные структуры на основе диоксида кремния, образующие наноразмер-ные частицы, являются интересными объектами для создания многокомпонентных модуляторов ферментативной активности. Отсутствие токсичности и легкость получения коллоидных частиц SiO2 обусловили повышенный интерес к ним как к потенциальным комплексообразователям с биологическими субстратами. Образование комплекса биомолекулы с частицей связано не только с образованием специфических водородных связей, но и с поверхностным зарядом и его распределением на поверхности [8, 9].
Модификация нетоксичных наночастиц SiO2 аминосилильными группами позволит получить многофункциональные соединения, сочетающие способность к эффективному комплексообразованию с возможностью водородного связывания с биосубстратами. Подобный подход хорошо зарекомендовал себя в области создания лекарственных препаратов нового поколения [10] и будет использован в настоящей работе для создания композиций, обладающих анти-протеиназной активностью.
1. Экспериментальная часть
Использовали следующие реагенты и растворители: коллоидный раствор силикатных частиц LUDOX TM40 (Sigma-Aldrich), 3-аминопропилтриметокси-силан (Aldrich, 97%), растворы ZnCl2, в качестве субстрата использовали бычий гемоглобин (Hb) (Sigma-Aldrich), нитратцеллюлоза, секреторные аспарагиновые протеиназы Candida albicans (С. alb.) индуцируемого (SAP2) и конститутивного (SAP4) типов, толуол, этилацетат, гексан (Sigma-Aldrich), глутаровый альдегид (Reanal). Деионизированную воду с удельным сопротивлением > 18.0 МОм^м получали с помощью системы Millipore-Q.
ИК-спектры поглощения в вазелиновом масле и ИК-спектры нарушенного полного внутреннего отражения регистрировали на фурье-спектрометре Spectrum 400 (Perkin Elmer): разрешение 1 см-1, накопление 64 скана, время регистрации 16 с, диапазон съемки 4000-400 см-1.
Электронные спектры поглощения записывали на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer) в области длин волн 190-900 нм, при температуре 36 ± 0.01 °С с использованием термостатирующей системы, включающей тер-мостатируемый держатель кювет, проточный термостат Julabo MB-5A и термостаты Пельтье PTP-1. Для измерения использовали кварцевые кюветы, толщина которых равна 1 см. Точность измерения оптической плотности (А) составляла ±1%.
Распределение по размерам силикатных частиц и индекс полидисперсности в разбавленных дисперсиях при 20 °C были определены на анализаторе размеров частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK). Инструмент оснащен 4 мВ He-Ne-лазером, работающим на длине волны бЗЗ нм. Измерения были проведены при угле детектирования 173°, позиция измерения внутри кварцевых и полисти-рольных кювет была определена автоматически.
Термограммы разложения частиц были получены с помощью метода совмещенной термогравиметрии (ТГ) и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) на термоанализаторе STA 449 C Jupiter (Netzsch Co, Германия). Скорость нагрева 10 K/мин в атмосфере аргона с общим потоком 20 мл/мин. Для этого l0-20 мг образцов синтезированных силикатных частиц нагревали в диапазоне температур 303-1173 K.
Модификация поверхности силикатных частиц З-аминопропилтриме-токсисиланом. К 19 мл коллоидного раствора частиц SiO2 в течение 30 мин добавляли по каплям 12.5 мл 1%-ного раствора 3-аминопропилтриметоксиси-лана (б4.5 ммоль) в воде первой степени очистки. Затем реакционная смесь перемешивалась со скоростью l200 об/мин при комнатной температуре в течение 72 ч.
Качественное определение наличия аминогрупп в силикатных частицах.
Реакцию проводили по методике [ll]. Раствор 5 мл 0.1%-ного салицилового альдегида в метаноле перемешивали со 100 мкл коллоидного раствора SiO2(NH2)n частиц. Наличие первичных аминогрупп подтверждено с помощью УФ-спект-роскопии (полоса поглощения в области 404 нм).
ИК-спектр (KBr, v/cм-1): 47l, 719, 78б, ll05, ll77 (Si-O-Si), 9б0 (CH2), 1490 (Si-O-H-NH2+), 1б29 (NH3+).
Количество органических фрагментов -(CH2)3NH2 на поверхности частиц SiO2(NH2)n определяли с помощью ТГ-ДСК-анализа и УФ-спектрофотометрии при X 404 нм, оно составило 1.S9-10-3 моль/мл.
В работе использовали индуцируемую SAp2 C. alb в растворе и конститутивную SAP4 C. alb, закрепленную на поверхности нитратцеллюлозной мембраны, выделенные согласно литературной методике [12-14]. Исходные концентрации SAP2 C. alb. и SAP4 C. alb. в разведении l : 10 определены методом иммуноферментного анализа [15] и составили б.79-10-7 и 2.7Ы0б моль/л соответственно.
Изготовление нитратцеллюлозных мембран с иммобилизованной конститутивной SAP Candida albicans. Нитратцеллюлоза (0.0б г) растворялась в смеси органических растворителей - этилацетата (1.75 мл) и толуола (0.25 мл). При изготовлении матриц с включенным ферментом добавляли 0.1б мл конститутивной SAP4 C. alb. (cSAP в матрице 2.22-10- моль/см ). После перемешивания добавляли 0.0б мл глутарового альдегида (25%, марки Reanal) и затем 23 капли гексана в качестве коагулянта. После тщательного перемешивания из этой смеси на стеклянной поверхности чашки Петри (d 90 мм) получалась пленка, которая высушивалась в потоке воздуха. Готовые пленки хранились в холодильнике при температуре 4 °С. Площадь рабочей поверхности матрицы составляла б см .
Определение протеолитической активности протеиназ Candida albicans.
Активность фермента определялась в стандартных условиях по увеличению скорости каталитической реакции по сравнению с некаталитической. Скорость реакции указывалась как изменение концентрации субстрата (мг/л) за единицу времени (мин).
При определении каталитической активности SAP2 C. alb. в 5 мл буферного раствора (рН 4.26), содержащего гемоглобин Hb (снь = 126 мг/л), добавляли 0.1 мл SAP2 C. alb., перемешивали и переносили в кварцевую спектрофотометриче-скую кювету, инкубировали в течение 15 мин при температуре 36 °С, регистрировали интенсивность поглощения полученного раствора при X 407 нм.
При определении протеолитической активности SAP4 C. alb., иммобилизованной на полимерной нитратцеллюлозной мембране, в раствор субстрата вносили нитратцеллюлозную мембрану площадью 6 см2 с иммобилизованной SAP4 C. alb. (концентрация фермента на поверхности cSAP = 2.22-10- моль/см ).
Концентрацию Hb в растворе после взаимодействия с протеиназой C. alb. определяли по градуировочному графику зависимости величины поглощения от концентрации гемоглобина, описываемому следующим уравнением:
Abs = (-0.1 ± 0.09) + (534483.3 ± 34537.5) • CHb, R = 0.99379. (1)
Активность фермента определялась по формуле
A = 1, (2)
где А - активность, t - время, ACHb - изменение концентрации Hb:
АС = С - С
Hb исх(НЪ) ост(НЬ) *
В качестве растворов сравнения использовали растворы без Hb.
2. Обсуждение результатов
Так как современные методы синтеза частиц 8Ю2(КН2)„ позволяют получать частицы с заданными размерами в очень широком интервале [16], мы выбрали коммерчески доступный прекурсор (ЬИБОХ ТМ40) - коллоидную суспензию частиц с размерами порядка 10 нм.
Модификация поверхности наночастиц 8Ю2 проведена 3-аминопропилтри-метоксисиланом согласно литературной методике [11] по схеме:
н21\1-
h2n
h3co" \
oh
i . oh
ho ho ho
-och3
och3
nh2
Сохранив объемные соотношения приливаемого водного раствора 3-амино-пропилтриметоксисилана и коллоидного раствора частиц 8Ю2, повысили концентрацию модифицируемых коллоидных частиц до 40% вместо 10% по весу.
2
Распределение частиц по интенсивности
£ л ь о о
X
m
s
0
1
ф
; :......'й
( \\ '■
т : ; : \: ____ : : IV /ЗРЧ : : 'W Ч ;
0.1
10 100 Размер (d, нм)
юоо
10000
Рис. 1. Распределение по интенсивности частиц, модифицированных 3-аминопропиль-ными фрагментами, диспергированных в воде
Рис. 2. Данные измерений методом ТГ-ДСК, проведенных для частиц модифицированных 3-аминопропильными группами
Получена коллоидная суспензия модифицированных наночастиц на основе диоксида кремния (8Ю2(КН2)„) и охарактеризована методом динамического светорассеяния. По результатам 6 измерений разбавленной в 10 раз суспензии были построены зависимости распределения размера частиц от интенсивности рассеивания света (рис. 1), объема и количества частиц. Средний размер частиц по интенсивности светорассеяния равен 43.6 нм. Индекс полидисперсности РБ1, определенный на основании построенной модели, составил 0.25.
По данным ТГ-ДСК-анализа (рис. 2) разложение частиц происходит в две ступени, первая из которых соответствует удалению молекул растворителя -воды (3.37% по массе) [17], а вторая ступень - разложение органической части, химически привитой к поверхности силикатной частицы (5.75% по массе).
В ИК-спектре 8Ю2(КН2)„ узкая полоса поглощения 1105 см-1 с плечом 1177 см-1, полосы 786, 719 и 471 см-1 соответствуют деформационным колебаниям 8Ю-8ьгрупп, полоса в области 1629 см-1 соответствует суперпозиции асимметрических деформационных колебаний КН3-группы. Сигнал в области 1670 см-1
относится к колебаниям адсорбированных молекул воды. Симметрические деформационным колебания NH3+ группы, связанной в виде SiO--H"NH2+ проявляются при 1490 см- . Полоса 960 см- соответствует деформационным вращательным колебаниям СЩ-группы. Группа сигналов, соответствующих колебаниям OH-групп, находится в области 3000-3500 см-1.
Активность системы протеиназ Candida albicans в присутствии амино-модифицированных силикатных наночастиц. Биохимическая активность SiO2(NH2)n оценена по отношению к секреторным аспарагиновым протеиназам (SAP) гриба Candida albicans: SAP2 (Protein Date Bank: doi: 10.2210/pdb 1zap/pdb) и SAP4 (Protein Date Bank: doi: 10.2210/pdb 2qzx/pdb), определяющим высокую патогенную активность грибкового аллергена Candida albicans [18].
Система аспарагиновых протеиназ C. alb. неразрывно связана с уровнем иммунитета и в настоящее время включает в себя 10 изоферментов, обладающих различными функциями и определяющих локализацию и тяжесть кандидаин-фекции [19, 20]. Основной интерес представляют два типа протеиназ Candida, взаимосвязанных друг с другом: индуцируемые SAP C. alb., проявляющие антигенные свойства, и конститутивные SAP C. alb., обладающие преимущественно сорбционными функциями и являющиеся необходимыми для последующей секреции и функционирования протеиназ первой группы. Установлено, что действие каскада протеиназ Candida неразрывно связано с работой аналогичной системы протеиназ ВИЧ [21, 22]. По данным УФ-спектрофотометрии определены параметры каталитической активности индуцируемой SAP2 C. alb. в растворе и конститутивной SAP4, ковалентно закрепленной на поверхности нитратцеллю-лозной мембраны. Субстратом является гемоглобин (табл. 1).
Табл. 1
Оптимальные условия протеолитического действия SAP2 и SAP4 по отношению к гемоглобину
Фермент Csap CHb, мг/л рН tинк, мин Активность, мг/л-мин
SAP2 2.26-10-7 моль/л 126 4.26 15 4.83 ± 0.20
SAP4 2.22-10-7 моль/см2 126 4.35 25 0.88 ± 0.40
Введение 8Ю2(КН2)„ как в гомогенную систему индуцируемой протеиназы 8АР2, так и в гетерогенную систему конститутивного фермента 8АР4 приводит к изменению протеолитической активности (табл. 2).
Влияние наноразмерного модулятора зависит от типа фермента и системы:
- на индуцируемую 8АР2 в растворе 8Ю2(КН2)„ модулятор оказывает сильное активирующее действие;
- на иммобилизованную конститутивную 8АР4 8Ю2(КН2)„ оказывает сильный ингибирующий эффект.
Методом динамического светорассеяния установлены степень полидис-перности (рис. 3) и размеры 8Ю2(КН2)„ (рис. 4) в зависимости от концентрации аминного фрагмента -(СН2)3КН2.
Табл. 2
Каталитическая активность 8АР2 и 8АР4 по отношению к гемоглобину в присутствии и в отсутствие 8Ю2(ЫН2)„ в зависимости от концентрации аминного фрагмента -(СН2)3КН2
С-(СН2)3КН2 8АР2 8АР4
Активность, мг/л-мин Эффект Активность, мг/л-мин Эффект
0 4.83 ± 0.04 0.88 ± 0.03
2-10-12 25.00 ± 0.37 А 0 I
5-1012 26.00 ± 0.52 А 0.27 ± 0.01 I
2-10-11 24.15 ± 0.36 А 0.18 ± 0.01 I
5-1011 38.27 ± 0.95 А 0 I
11010 20.13 ± 0.30 А 0 I
5-1010 32.20 ± 0.80 А 0 I
110-9 25.36 ± 0.51 А 0 I
5-10-9 36.23 ± 0.91 А 0 I
1-10-8 24.15 ± 0.36 А 0 I
5-10-8 28.18 ± 0.56 А 0 I
1-10-7 25.36 ± 0.51 А 0 I
5-10-7 21.34 ± 0.32 А 0 I
1-10-6 88.55 ± 2.66 А 0 I
5-10-6 24.15 ± 0.36 А 0 I
5-10-5 28.18 ± 0.56 А 0 I
I - ингирование ферментативной активности, А - активация ферментативной активности.
||
МИ1Н1П
Рис. 3. Диаграмма зависимости коэффициента полидисперсности 8Ю2(КН2)Я от концентрации аминного фрагмента -(СН2)3КН2
Увеличение концентрации наночастиц на основе диоксида кремния в растворе приводит к снижению степени полидисперсности и к уменьшению диаметра наночастиц. Выявлено, что увеличение степени полидисперсности и изменение размера наночастиц не оказывают значительного влияния на силу активирующего эффекта (табл. 3). Однако при концентрации -(СН2)3КН2-фрагмента 1-10"6 моль/л с монодисперсностью системы (РШ 0.18) и размерах наночастиц 102 нм наблюдается значительное усиление активирующего эффекта.
Возможно, это связано с пространственной комплементарностью модулятора к аллостерическому или активному центрам фермента в данных условиях, что и позволяет наблюдать скачкообразный активирующий эффект.
1400 1200 1000 800
НМ
600 400 200 0
1х10-'М*10 !1 5x1010 5*10^ 6*10® l*10'' 4.4*10'' S.¡¡*]0''' 1 3*10"^моль/л
Рис. 4. Диаграмма зависимости диаметра SiO2(NH2)„ от концентрации аминного фрагмента -(CH2)3NH2
Табл. 3
Каталитическая активность SAP2 в зависимости от степени полидисперсности Siü2(NH2)„
PdI Активность, мг/л-мин
0.18-0.25 4.5 ± 0.1
13.9 ± 0.5
3.6 ± 0.2
3.9 ± 0.2
0.25-0.31 4.1 ± 0.1
4.1 ± 0.1
3.8 ± 0.2
3.8 ± 0.3
6.1 ± 0.1
0.31-0.33 3.2 ± 0.1
4.5 ± 0.2
0.41-0.47 5.8 ± 0.2
Методом УФ-спектрофотометрии с обработкой данных по методу Скэтчарда оценено связывание SiO2(NH2)„ с протеиназами C. alb. и специфическим субстратом - гемоглобином (рис. 5, 6).
Данные электронных спектров поглощения использованы для расчета константы аффинности специфических взаимодействий (рис. 7).
И гемоглобин, и SAP2 связываются с наночастицами на основе диоксида кремния по одному участку биомолекулы: KA 8.9-10 и 7.65-10 моль- соответственно. Наночастицы SiO2(NH2)„ связываются с гемоглобином только при концентрации -(СН2^Н2-фрагмента 1.00-10-8 - 2.21-10-7 моль/мл. При понижении концентрации SiO2(NH2)„ связывание с гемоглобином отсутствует. Связывание SiO2(NH2)„ с протеиназой происходит во всем диапазоне исследуемых концентраций модулятора и является более специфичным, на что указывает значение константы аффинности.
Аффинность SiO2(NH2)„ к компонентам фермент-субстратной системы может быть объяснена образованием молекулярных комплексов в кислой среде между
ЛГ
/А
/ \
340 360 J60 4M 4:0 440 460 490 НЮ 520
0.06 0.05 0.64
003 0 02 0.01 ООО
300
Рис. 5. Электронные спектры поглощения Рис. 6. Электронные спектры поглощения Hb (1), Hb в присутствии SiO2(NH2)n (2) SAP C. alb. (1), SAP C. alb. в присутствии
SiO2(NH2)n (2)
Й 0.4
*, а
î. f -
0.4 0.6 0.4 X, bic n. ll
1.0 12 1.4
Рис. 7. График Скэтчарда для нахождения констант связывания субстрат - модулятор в системе [SAP2 - SiO2(NH2)„] (а) и в системе [Hb - SiO2(NH2)n] (б)
частицами, имеющими положительный поверхностный заряд -(CH2)3NH3+, и отрицательно заряженными ионизированными карбоксильными группами аспа-рагиновой кислоты активного центра или многослойной адсорбцией с участием силикатных наночастиц на поверхности белка за счет электростатического взаимодействия, что приводит к структурным и функциональным изменениям белков системы SAP C. alb. - Hb.
1
2
б
Активность системы протеиназ Candida albicans в присутствии ZnCl2.
Введение в раствор, содержащий SAP C. alb., хлорида цинка ZnCl2 приводит к гиперхромному эффекту при одинаковых исходных концентрациях SAP2 или SAP4. Гиперхромный эффект возрастает при увеличении концентрации ZnCl2.
Рассчитанные на основании данных электронной спектроскопии по методу сдвига равновесий логарифмы значения констант устойчивости и максимальные доли накопления для координационных форм [Zn(II) - SAP C. alb.] представлены в табл. 4.
Табл. 4
Характеристические параметры координационных систем [Zn(II) - SAP C. alb.] в растворе
Комплекс lg в Состав комплекса Доля накопления (а, %)
[Zn(II) - SAP2] 4.73 ± 0.20 1 : 1 96.4 ± 0.1
[Zn(II) - SAP4] 5.25 ± 0.04 1 : 1 94.1 ± 0.1
Табл. 5
Константы аффинности и стехиометрия взаимодействия в системах [Zn(II)-SAP C. alb.]
Система Стехиометрия КА, моль 1
[Zn(II) - SAP2] 1 : 1 (3.10 ± 0.2) ■ 106
[Zn(II) - SAP4] 1 : 1 (1.10 ± 0.01) ■ 109
во -8070 -ВО -504030 -20100-
к
—г~ 50
""I— 200
150 X, моль/л
—I— 250
—I-
300
—I-
350
—I
400
Рис. 8. Графики Скэтчарда для нахождения связывания комплекса [Zn(II) - SAP2 C. alb.] рабочая концентрация ZnCl2 4-10-8 моль/л (а) и [Zn(II) - SAP4 C. alb.] (б)
б
а
Для оценки аффинности связывания ZnCl2 с SAP C. alb. использовали экспериментальные данные, представленные в координатах Скэтчарда (рис. 8). Методом Дюрантона [23] определена стехиометрия связывания в системах [Zn(II) - SAP C. alb]. Константы аффинности и стехиометрия взаимодействия в системах [Zn(II) - SAP C. alb] представлены в табл. 5.
Суммируя данные экспериментов по определению констант устойчивости классическим методом сдвига равновесий и данные по константам аффинности и стехиометрии взаимодействия в системах [Zn(II) - SAP C. alb], полученные с помощью классических биохимических подходов, можно отметить, что Zn(II) несомненно образует координационное соединение с SAP C. alb. Отметим, что SAP C. alb. состоит из двух доменов, в центре каждого из которых существуют две последовательности Asp-Thr-Gly (DTG) / Asp-Ser-Gly (DSG), формирующие активный центр фермента. Два каталитических остатка аспарагиновой кислоты Asp 32 и Asp 218, находящиеся на расстоянии водородной связи друг от друга,
действуют совместно по отношению к вторгающимся молекулам субстрата, осуществляя разрыв пептидной связи [18]. При взаимодействии SAP с ZnCl2 происходит координация иона Zn(II) с депротонированным при рН 4.5 остатком аспарагиновой кислоты Asp 57, отвечающим за связывание металлов с ферментом, с образованием комплекса 1 : 1. Оставшиеся два места заняты про-тивоионом Cl- и растворителем (Н2О). Координированный ион Zn(II) имеет тетраэдрическое окружение:
SAP ,ЛЛЛЛЛЛ As
tiZf
I Zn......
O^ \.....
Cl-
H2O
Оценена активность SAP2 и SAP4 C. alb. в присутствии Znd2 при различных концентрациях в условиях ферментативного гидролиза (табл. 6).
Табл. 6
Каталитическая активность 8ЛР2 и 8ЛР4 по отношению к гемоглобину в присутствии 2пС12 (снь = 2-10-6 моль/л, сЗЛР = 1.91-10"9 моль/л, рН 4.5)
cZnCl2 SAP2 SAP4
Активность, мг/л-мин Эффект Активность, мг/л-мин Эффект
0 4.83 ± 0.04 0.88 ± 0.03
1-10-8 2.54 ± 0.03 I 0.19 ± 0.01 I
5-10-8 2.9 ± 0.04 I 0.22 ± 0.02 I
1-10-7 3.02 ± 0.04 I 0.13 ± 0.01 I
5-10-7 6.44 ± 0.13 I 0.28 ± 0.02 I
1-10-6 3.86 ± 0.06 I 0.3 ± 0.02 I
5-10-5 2.5 ± 0.05 I 0.25 ± 0.02 I
1-10-4 2.37 ± 0.04 I 0.31 ± 0.02 I
5-10-4 2.4 ± 0.03 I 0.28 ± 0.02 I
1-10-3 2.84 ± 0.04 I 0.25 ± 0.01 I
5-10-3 2.52 ± 0.03 I 0.25 ± 0.01 I
В диапазоне концентраций 1-10-8 - 1-10-6 и 110-5 - 1-10-2 моль/л Zn(II) проявляет ингибирующее действие с максимальным эффектом при концентрации 110- и 110- моль/л и активирующее действие при концентрации 5-10- моль/л по отношению к протеиназе SAP C. alb.
Полученные данные свидетельствуют о необратимом характере действия эффекторов на каталитическую активность SAP C. alb.
Влияние композиции ZnCl2 и наночастиц на основе диоксида кремния на активность Candida albicans. В табл. 7 представлена каталитическая активность SAP2 C. alb., находящейся в растворе, и иммобилизованной SAP4 в присутствии SiO2(NH2)„ с концентрацией -(С^зМ^-фрагмента 1-10-7 моль/л при различных концентрациях ZnQ2. Для ферментов SAP2, SAP4 в зависимости от концентрации эффектора наблюдаются как эффект ингибирования, так и эффект активации ферментативной активности.
Табл. 7
Протеолитическая активность SAP2 и SAP4 C. alb. в присутствии SiO2(NH2)n (c-(CH2)3NH2 = = 1-10-7 моль/л) и ионов Zn(II)
cZn2+ SAP2 SAP4
Активность, мг/л-мин Эффект Активность, мг/л-мин Эффект
0 4.83 ± 0.04 0.88 ± 0.03
5-1012 2.39 ± 0.03 I 0.25 ± 0.01 I
5-1011 1.13 ± 0.01 I 0.76 ± 0.02 I
5-10-10 0.85 ± 0.01 I 0 I
110-9 0.88 ± 0.01 I 0.76 ± 0.02 I
5-10-9 0 I 0 I
1-10-8 1.10 ± 0.02 I 0 I
5-10-8 0.98 ± 0.01 I 0 I
1-10-7 0.35 ± 0.01 I 0 I
5-10-7 1.17 ± 0.02 I 0 I
1-10-6 1.48 ± 0.02 I 0 I
5-10-6 0.57 ± 0.01 I 0.25 ± 0.01 I
1-10-5 0 I 0 I
5-10-5 0 I 0 I
1-10-4 0 I 0.25 ± 0.01 I
5-10-4 0 I 0.25 ± 0.01 I
1-10-3 0 I 0.25 ± 0.01 I
Одновременное введение в систему SAP2 C. alb - Hb ионов Zn(II) и SiO2(NH2)n приводит к ярко выраженному эффекту ингибирования протеолиза субстрата. Причем действие композиции значительно эффективнее, чем действие отдельных компонентов, и даже позволяет зафиксировать кардинальную смену эффекта активации в присутствии SiO2(NH2)n или ионов Zn(II) при концентрации 1-10-7 моль/л на значительный эффект ингибирования.
Действие композиции на систему SAP4 C. alb. - Hb приводит к эффекту полной инактивации иммобилизованного фермента в диапазоне концентраций Zn(II) 5-10-9 - 1-10-6 моль/л и к ослаблению эффекта ингибирования в диапазоне концентраций 1-10-4 - 1-10-3 моль/л.
Полученный массив и сопоставление данных позволяют утверждать, что эффект подавления каталитической активности присутствует, как правило, при использовании композиции: SiO2(NH2)n - ZnCl2. Несомненно, подобные эффекты связаны с образованием в данной системе полиядерного комплекса Zn(II) с нано-частицами, с координацией ионов Zn(II) по азоту аминогрупп, закрепленных на поверхности наноразмерной силикатной платформы.
3. Выводы
Продемонстрирована потенциальная возможность управления каталитической активностью протеиназ Candida albicans различных групп с использованием в качестве модуляторов неорганических наноразмерных частиц и низкомолекулярных соединений металлов. Кооперативное действие двух компонентов системы обусловлено образованием супрамолекулярных комплексов наночастиц на основе диоксида кремния и хлорида цинка с протеиназой Candida albicans. Вероятно, образование молекулярного комплекса осуществляется за счет элек-
тростатического притяжения между отрицательно заряженными остатками аспа-рагиновой кислоты в активном центре фермента и положительно заряженной поверхностью SiO2(NH2)n, а ионы цинка связываются по специальному центру связывания для ионов металлов (Asp 57). Таким образом, осуществляется кооперативное влияние обоих эффекторов на конформацию фермента, что существенным образом сказывается на изменении каталитической активности ферментов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 09-03-92669-ННФ), программы грантов Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук (МК-6390.2010.3) и Министерства образования и науки РФ (№ 16.552.11.7008).
Summary
A.R. Mukhametzyanova, M.P. Kutyreva, O.I. Medvedeva, Vl.V. Gorbachuk, L.S. Yaki-mova, I.I. Stoikov, N.A. Ulakhovich. Composition Based on Silica Nanoparticles and Zn(II) as a Modulator of Proteinases Activity.
Superficial modification of silica-based nanoparticles (SiO2(NH2)n) with 3-aminopropyl-trimethoxysilane was made. The average size of the particles was 43.6 nm. The index of poly-dispersity (PDI) was 0.25. Biochemical activity of the system of proteinases Candida albicans in the presence of SiO2(NH2)n was estimated. It was established that the introduction of SiO2(NH2)n both in a homogeneous system of inducible proteinase (SAP2) and a heterogeneous system of constitutive enzyme (SAP4) leads to a change in the proteolytic activity. The increase in the concentration of SiO2(NH2)n in a solution leaded to the decrease in the polydispersity and the diameter of nanoparticles. The Scatchard method was used to determine the affinity constants in the systems [SAP2 - SiO2(NH2)n] and [hemoglobin - SiO2(NH2)n]. Both hemoglobin and SAP2 interacted with nanoparticles by one site of the biomolecule: KA 8.9-106 mol-1 and 7.65-107 mol-1, respectively. The logarithms of stability constants were 4.73 ± 0.20 and 5.25 ± 0.04 for coordination forms [Zn(II) - SAP2 C. alb.] and [Zn(II) - SAP4 C. alb.], respectively. Simultaneous introduction of Zn(II) ions and silica-based nanoparticles in SAP2 C. alb -Hb system leaded to a pronounced effect of inhibition of the substrate proteolysis. The effect of the composition was much stronger than that of its separate components.
Key words: amine-modified nanoparticles, secretory aspartic proteinase Candida albi-cans, affinity constants, stability constants.
Литература
1. Borg-von Zepelin M., Meyer I., Thomssen R., Wurzner R., Sanglard D., Telenti A., Monod M. HIV-Protease inhibitors reduce cell adherence of Candida albicans strains by inhibition of yeast secreted aspartic proteases // J. Invest. Dermatol. - 1999. - V. 113, No 5. - P. 747-751.
2. Медянцева Э.П., Вертлиб М.Г., Будников Г.К. Ионы металлов как эффекторы ферментов // Усп. химии. - 1998. - Т. 67, № 3. - С. 252-260.
3. Баскова И.П., Завалова Л.Л. Ингибиторы протеолитических ферментов медицинской пиявки (Hirudo medicinalis) // Биохимия. - 2001. - Т. 66, Вып. 7. - С. 869-883.
4. Крупянко В.И. Распределение ингибирующей активности среди катионов двухвалентных металлов // Биохимия. - 1988. - Т. 53, Вып. 6. - С. 905-911.
5. Williams R.J.P. My past and a future role for inorganic biochemistry // J. Inorgan. Bio-chem. - 2006. - V. 100, No 12. - P. 1908-1924.
6. Shaller M., Januschke E., Schackert C., Woerle B., Korting H.C. Different isoforms of secreted aspartyl proteinases (Sap) are expressed by Candida albicans during oral and cutaneous candidosis in vivo // J. Med. Microbiol. - 2001. - V. 50, No 8. - P. 743-747.
7. Gao G., Yan D. Hyperbranched polymers: from synthesis to applications // Prog. Polym. Sci. - 2004. - V. 29, No 3. - P. 183-275.
8. Smith J.E., Wang L., Tan W. Bioconjugated silica-coated nanoparticles for bioseparation and bioanalysis // Trends Anal. Chem. - 2006. - V. 25, No 9. - P. 848-855.
9. Vertegel A.A., Siegel R.W., Dordick J.S. Silica nanoparticle size influences the structure and enzymatic activity of adsorbed lysozyme // Langmuir. - 2004. - V. 20, No 16. -P. 6800-6807.
10. Reul R., Nguen J., Kissel T. Amine-modified hyperbranched polyesters as non-toxic, biodegradable gene delivery systems // Biomaterials. - 2009. - V. 30, No 29. - P. 5815-5824.
11. Pham K.N., Fullston D., Sagoe-Crentsil K. Surface modification for stability of nano-sized silica colloids // J. Colloid Interface Sci. - 2007. - V. 315, No 1. - P. 123-127.
12. White T.C., Miyasaki S.H., Agabian N. Three distinct secreted aspartyl proteinases in Candida albicans // J. Bacteriol. - 1993. - V. 175, No 19. - P. 6126-6133.
13. Borg-von Zepelin M., Beggah S., Boggian K., Sanglard D., MonodM. The expression of the secreted aspartyl proteinases Sap4 to Sap6 from Candida albicans in murine macrophages // Mol. Microbiol. - 1998. - V. 28, No 3. - P. 543-554.
14. Методы экспериментальной микологии: Справ. - Киев: Наукова думка, 1982. - 340 с.
15. Кутырева М.П., Медянцева Э.П., Халдеева Е.В., Глушко Н.И., Будников Г.К. Определение антигена Candida albicans с помощью амперометрического иммунофер-ментного сенсора // Вопр. мед. химии. - 1998. - Т. 44, Вып. 2. - С. 172-178.
16. Davies G.-L., Barry A., Gun'ko Yu.K. Preparation and size optimisation of silica nanoparticles using statistical analyses // Chem. Phys. Lett. - 2009. - V. 468. - P. 239-244.
17. Gellermann C., Storch W., Wolter H. Synthesis and characterization of the organic surface modifications of monodisperse colloidal silica // J. Sol-Gel Sci. Technol. - 1997. -V. 8, No 1-3. - P. 173-176.
18. Abad-Zapatero C., Goldman R., Muchmore S.W., Hutchins C., Stewart J., Navaza J., Payne C.D., Ray T.L. Structure of a secreted aspartic protease from C. albicans with a potent inhibitor: Implications for the design of antifungal agents // Protein Sci. - 1996. -V. 5, No 4. - P. 640-652.
19. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В., Кутырева М.П., Фассахов Р.С. Сопоставление некоторых факторов вирулентности клинических штаммов Candida albicans // Микол. фитопат. - 2008. - Т. 42, № 5. - С. 475-480.
20. Галимзанова Р.Р., Кутырева М.П. Соединения на основе цинка и марганца, как модуляторы патогенной активности грибкового аллергена Candida albicans // Усп. мед. микологии. - 2006. - Т. 7. - С. 6-7.
21. Кутырева М.П., Галимзанова Р.Р., Улахович Н.А., Глушко Н.И. Влияние ионов Zn(II) и Mn(II) на каталитическую активность индуцируемой протеиназы Candida albicans // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53, Вып. 1. - С. 72-85.
22. Галимзанова Р.Р., Кутырева М.П., Улахович Н.А., Глушко Н.И., Иванова А.А., Черкасов Р.А., Забиров Н.Г. Координационные соединения индуцируемой протеиназы Candida albicans с катионами d-металлов как регуляторы ферментативной активности // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2006. - Т. 148, кн. 4. - С. 56-67.
23. Duranton J., Adam C., Bieth J.G. Kinetic mechanism of the inhibition of cathepsin G by alpha 1-antichymotrypsin and alpha 1-proteinase inhibitor // Biochemistry. - 1998. -V. 37, No 32. - P. 11239-11245.
Поступила в редакцию 10.06.11
Мухаметзянова Алсу Ринатовна - аспирант кафедры неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: alsumuhametz@mail.ru
Кутырева Марианна Петровна - кандидат химических наук, доцент кафедры неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: mkutyreva@mail.ru
Медведева Ольга Игоревна - студент Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
Горбачук Владимир Валерьевич - младший научный сотрудник, аспирант кафедры неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
Якимова Людмила Сергеевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник кафедры органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
Стойков Иван Иванович - доктор химических наук, профессор кафедры органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
Улахович Николай Алексеевич - доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета.
