CC BY
37
Комплексное сперматологическое обследование пациентов с муковисцидозом
М.И. Штаут1, Л.В. Шилейко1, С.А. Репина3, С.А. Красовский2, Г.В. Шмарина1, Т.М. Сорокина1, Л.Ф. Курило1, В.Б. Черных1' 3
ФГБНУ «Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ФГБУ «НИИпульмонологии ФМБА России»; Россия, 105077Москва, 11-я Парковая ул., 32, корп. 4; 3ФГБОУВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России;
Россия, 117513 Москва, ул. Островитянова, 1
Контакты: Вячеслав Борисович Черных chernykh@med-gen.ru
Введение. Муковисцидоз (МВ) — частое генетическое заболевание, связанное с мужским бесплодием. Почти у всех мужчин с МВ диагностируют бесплодие и азооспермию вследствие обструкции семявыносящих путей.
Цель — исследование показателей эякулята, нарушения секреции семенной жидкости и состояния сперматогенеза у мужчин с МВ. Материалы и методы. Обследованы 44 мужчины с легочной (п = 20) и смешанной (п = 24) формами МВ. Выполнены стандартное спермиологическое исследование, количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из осадка эякулята, биохимическое исследование семенной плазмы (фруктоза, а-гликозидаза, лимонная кислота).
Результаты. У 77,3 % пациентов выявлена азооспермия, у 13,6 % — олигозооспермия тяжелой степени (<1 млн/мл), у 9,1 % — другие сперматологические диагнозы (олиго-, астено- и нормозооспермия). Признаки обструкции семявыносящих путей и аплазии семенных пузырьков обнаружены у 91 % пациентов. Азоо- и олигоспермия, рН <7,0 и низкое содержание фруктозы в семенной жидкости у мужчин с МВ обусловлены двусторонней обструкцией семявыносящих протоков и аплазией семенных пузырьков. Заключение. Криптозооспермия и незрелые половые клетки, обнаруженные в осадке эякулята у всех пациентов с азооспермией, свидетельствуют об аплазии, а не о врожденном отсутствии семявыносящих протоков. У большинства мужчин с МВ выявлены признаки поражения семявыносящих протоков и придаточных половых желез, нарушения сперматогенеза. У пациентов с легочной формой МВ, в отличие от его смешанной формы, возможно сохранение мужской фертильности вследствие проходимости семявыносящих путей при отсутствии тяжелых форм патозооспермии.
Ключевые слова: муковисцидоз, мужское бесплодие, обструктивная азооспермия, семявыносящие протоки, семенные пузырьки, сперматогенез, незрелые половые клетки, эякулят, мейоз
DOI: 10.17650/2070-9781-2017-18-4-69-76
Comprehensive semen examination in patients with cystic fibrosis M.I. Shtaut1, L. V. Schileiko1, S.A. Repina3, S.A. Krasovsky2, G. V. Shmarina1, T.M. Sorokina1, L.F. Kurilo1, V.B. Chernykh1,3
1Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorechie St., Moscow 115478, Russia;
2Pulmonology Research Institute, Federal Biomedical Agency; 32,11'h Parkovaya St., Moscow 105077, Russia;
3N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow 117997, Russia 1
K
Introduction. Cystic fibrosis (CF) is a common genetic disorder associated with male infertility. Almost all men with CF are infertile due to obstructive azoospermia. £
The objective is to evaluate semen parameters, excretion of seminal fluid, and spermatogenesis in CF patients. ™
Materials and methods. We examined 44 male CF patients with pancreatic sufficiency (n = 20) and pancreatic insufficiency (n = 24). £ Standard semen analysis, quantitative karyological analysis of immature germ cells from ejaculate sediment, biochemical semen analysis " (fructose, a-glucosidase, citric acid) were performed.
Results. Semen analysis diagnosed azoospermia in 77.3 % patients, severe oligozoospermia (< 1 million/ml) and other diagnoses (oligozoo-spermia, asthenozoospermia, normozoospermia) in 13.6 % and 9.1 % patients, respectively. The signs of obstruction of the vas deferens and s aplasia of seminal vesicles were observed in 91 % patients. Azoospermia, oligospermia, pH <7.0 and low content of fructose in the semen samples result from bilateral obstruction of the vas deferens and aplasia of the seminal vesicles. ^
Conclusion. Cryptozoospermia and immature germ cells, detected in ejaculate sediment in all azoospermic patients with CF, indicated aplasia, but not congenital absence of the vas deferens. The majority of CF patients presented signs of seminal ducts obstruction and impaired spermatogenesis and seminal fluid secretion. In contrast to pancreatic-sufficient CF male patients, pancreatic-insufficient CF patients can be fertile and have no obstruction of seminal ducts and severe pathozoospermia. =
Key words: cystic fibrosis, male infertility, obstructive azoospermia, vas deferens, seminal vesicles, spermatogenesis, immature germ cells, 0 ejaculate, meiosis
Е га Е
Введение
Муковисцидоз (МВ) — частое моногенное заболевание (встречаемость МВ в России в среднем составляет 1 на 8—10 тыс. населения), вызванное мутациями гена CFTR и имеющее аутосомно-рецессивный тип наследования [1]. К настоящему времени идентифицировано более 2 тыс. мутаций и 250 полиморфизмов этого гена. Кодируемый данным геном белок МВТР (муковисци-дозный транспортный регулятор) функционирует в составе цАМФ (циклический аденозинмонофосфат) — зависимого ионного канала на апикальной поверхности эпителиальных клеток, обеспечивая трансмембранный транспорт ионов хлора, натрия, бикарбоната и некоторых молекул [2]. В результате мутации нарушается функция белка хлорного канала, участвующего в водно-электролитном обмене эпителия, выстилающего просветы протоков внешней секреции, в том числе органы репродуктивной системы [3]. Нарушение функции МВТР приводит к системному прогрессирующему поражению: хроническому воспалению желез внешней секреции, в первую очередь бронхолегочной системы (легочная форма МВ) и/или поджелудочной железы (смешанная форма МВ), при этом форма и тяжесть заболевания зависят от типа мутаций CFTR или генотипа [1].
У большинства мужчин, страдающих МВ, поражаются семявыносящие протоки (vas deferens), семенные пузырьки. У них часто отмечают аномалии развития и кисты эпидидимиса и микролитиаз предстательной железы [4]. Изменения на уровнях тканей и клеток включают поражения соединительной ткани, сперма-тогенного эпителия и клеток Сертоли [5, 6]. У 97—98 % взрослых мужчин, больных МВ, диагностируют бесплодие вследствие обструктивной азооспермии [4]. Для них характерен небольшой (на нижней или близкий к нижней границе нормы) или сниженный объем (менее 1,5 мл) эякулята относительно нормативных значений (вплоть до выраженной олигоспермии), а также сдвиг в сторону кислой среды семенной жидкости (pH <7,0). Биохимические показатели эякулята характеризуют состояние органов мужской половой системы: уровень лимонной кислоты и цинка отражает секреторную функцию предстательной железы, нейтральной а-гликозидазы — проходимость и секреторную функцию эпидидимиса. При исследовании эякулята мужчин с МВ внимание обращают на уровень фруктозы (основной источник энергии для сперматозоидов), секреция которой происходит в семенных пузырьках [7]. В зависимости от механизма возникновения азооспермии ее разделяют на обструктивную и необструктивную. Первая вызвана нарушением проходимости семявы-носящих путей, частой причиной которых являются мутации гена МВ. В некоторых случаях отмечают сочетание нарушения сперматогенеза различной степени, двустороннее или одностороннее нарушение проходимости семявыносящих путей.
Целью работы являлось исследование нарушений проходимости семявыносящих путей, экскреторной функции половых желез и состояния сперматогенеза у мужчин с МВ.
Материалы и методы
Группу обследованных пациентов составили 44 мужчины в возрасте от 17 до 39 лет с клинически и генетически подтвержденным диагнозом «муковисцидоз». Из них 20 больных имели легочную форму МВ и 24 — смешанную. Пациенты направлены из ФГБУ «НИИ пульмонологии ФМБА России» в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», где им проводилось обследование с 2009 по 2017 г.
Всем пациентам выполняли стандартное спермио-логическое исследование согласно рекомендациям ВОЗ (2010 г.) [7], а также количественный кариологический анализ (ККА) соотношения разных стадий сперматогенеза незрелых половых клеток (НПК) из эякулята (патент проф. Л.Ф. Курило на изобретение № 2328736 от 01.02.2007 г. «Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза»). Данный метод позволяет оценивать процесс сперматогенеза и его нарушения на различных стадиях без проведения биопсии яичка [8, 9]. ККА НПК проводили на суховоздушных препаратах половых клеток из суспензии эякулята после окрашивания по Романовскому—Гимзе. На 500—1000 полей зрения полученных препаратов морфологически идентифицировали НПК на следующих стадиях сперматогенеза: сперматоциты на стадиях предпахитенного развития (прелептотены, лептотены и зиготены профазы I), пахитены, диплотены профазы I, метафазы I и II мейоза и две объединенные стадии сперматогенеза (сперматоциты II + сперматиды, так как стадия сперматоцитов II относится к непродолжительной профазе II мейоза). Один из характерных признаков нарушений сперматогенеза — образование двуядер-ных сперматоцитов II и дву- и четырехъядерных сперматид. Они формируются в результате неполного расхождения хромосом в ана- и телофазе делений или незавершенной цитотомии при образовании дочерних клеток. При наличии такой патологии вычисляли долю дву- и четырехъядерных НПК от общей суммы сперматоцитов II + сперматид. Также в общую сумму подсчитанных ядер НПК включены и трудно идентифицируемые ядра незрелых половых клеток. При обнаружении на препаратах 1000 и более сперматозоидов подсчитывали индекс НПК (число НПК на 1000 сперматозоидов). Для каждого образца анализировали 200—300 ядер НПК (если таковые были). Параллельно учитывали другие типы клеток (эпителиальные, лейкоциты) [10].
Биохимическое исследование маркеров семенной плазмы (лимонная кислота, фруктоза и нейтральная а-гликозидаза) выполняли с помощью общепринятых
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
4
методик в соответствии с рекомендациями упомянутого руководства ВОЗ [7]. Для оценки их содержания в семенной жидкости использовали коммерческие диагностические наборы: для лимонной кислоты — FertiPro Citric Acid Test, для фруктозы — FertiPro Fructose Test, для нейтральной а-гликозидазы — EpiScreen Plus™ Neutral Alpha-Glucosidase, а исследование проводили в соответствии с протоколами их производителя (FertiPro NV, Бельгия). В качестве референсных значений содержания в семенной жидкости фруктозы (13 мкмоль/ 2,4 мг на эякулят), лимонной кислоты (2,4 мкмоль/10 мг на эякулят) и нейтральной а-гликозидазы (20 мЕд на эякулят) приведены данные T.G. Cooper и соавт. [11].
Статистический анализ результатов выполняли с использованием программы StatSoft Statistica 8 (Dell Technologies, США). Статистическое сравнение полученных данных проводили, применяя критерий Ман-на—Уитни, значимыми считали различия при уровне вероятностиp <0,01.
Результаты
По результатам стандартного спермиологического исследования из 44 мужчин в выборке пациентов с МВ у 34 (77,3 %) выявлена азооспермия, у 6 (13,6 %) — крипто-/олигозооспермия тяжелой степени (концентрация сперматозоидов в эякуляте менее 1 млн/мл), у 4 (9,1 %) — другие сперматологические диагнозы, среди которых: олигоастенотерато- (n = 2), астеноте-рато- (n = 1) и нормозооспермия (n = 1) [1] (табл. 1).
Обнаружено существенное различие в структуре сперматологических диагнозов между группами пациентов (рис. 1). Группу с легочной формой МВ представляли мужчины с различными сперматологическими диагнозами (от нормо-, астено- и олигозооспермии различной степени до азооспермии). У всех пациентов со смешанной формой МВ обнаружены только тяже-
азооспермия / azoospermia олигозооспермия с концентрацией <1 млн/мл / oligozoospermia with concentration <1 million/ml олигозооспермия с концентрацией >1 млн/мл / oligozoospermia with concentration >1 million/ml астенозооспермия / asthenozoospermia нормозооспермия / normozoospermia
Рис. 1. Структура спермиологических диагнозов в группах пациентов: а — с легочной (n = 20), б — со смешанной (n = 24) формами муковисци-доза (цифрами дано число пациентов с данным диагнозом) Fig. 1. Structure of spermiological findings in patient groups: а — with pancreatic-sufficient (n = 20), б — with pancreatic-insufficient (n = 24) cystic fibrosis (numbers of patients with this diagnosis are indicated)
лые формы патозооспермии (азоо-/криптозооспермия) и олигозооспермия тяжелой степени.
У 3 пациентов (у 2 с легочной формой МВ и 1 со смешанной формой) спермиологическое исследование проводили двукратно, у 2 из них в обоих исследованиях выявлена азооспермия, у 3-го пациента диагностирована олигозооспермия тяжелой степени (0,1 млн/мл) в первичном анализе, в повторном — азооспермия.
Объем полученных образцов эякулята варьировал от 0,2 до 6 мл, при этом объем менее 1,5 мл выявлен у 38 (86,4 %) пациентов с МВ. Олигоспермию значимо чаще (р = 0,007) встречали в группе мужчин со смешанной формой МВ — 95,8 % (у 23 из 24), чем у пациентов с легочной формой МВ — 70 % (у 14 из 20).
Таблица 1. Результаты стандартного спермиологического исследования у пациентов с муковисцидозом (МВ), среднее значение (диапазон) Table 1. Results of standard sperm examination in patients with cystic fibrosis (CF), median (range)
Группа пациентов
Эя Ej кулят culate
объем, мл pH вязкость, мм концентрация сперматозоидов, млн/мл
Смешанная форма МВ, n = 24 Pancreatic-insufficient CF, n = 24 0,53 ± 0,47 (0,2 —1,8) 6,0 ± 0,5 (5,5—6,5) 18,0 ± 32,0 (5— -50) 0,002 ± 0,048 (0,00— 0,05)
Легочная форма МВ, n = 20 Pancreatic-sufficient CF, n = 20 1,7 ± 4,3 (0,35— 6,00) 6,79 ± 1,11 (5,6— 8,0) 17,2 ± 42,8 (5— -60) 20,962 ± 222,038 (0 —243)
Всего пациентов с МВ, N = 44 Total number of CF patients, N = 44 1,1 ± 4,9 (0,2— 6,0) 6,4 ± 0,9 (5,5—8,0) 17,6 ± 42,4 (5— -60) 10,48 ± 232,52 (0— 243)
E га E
Таблица 2. Результаты количественного кариологического анализа соотношения разных стадий сперматогенеза незрелых половых клеток (НПК) у пациентов с муковисцидозом (МВ)
Table 2. Results of quantitative karyological analysis of the ratio between different stages of immature germ cell (IGC) in patients with cystic fibrosis (CF)
4 ТОМ 18 / VOL. 18 2 0 17
Группа пациентов Сперматоциты I на допахитенных стадиях,% Сперматоциты I и сперматиды, % Нерасхождение ядер НПК, % Неидентифицированные
Patient group Spermatocytes I and Non-disjuncted IGC nuclei, %
Prepachytene spermayocytes I, % spermatids, % Non-identined igc nuclei, %
Контрольная (рефе-ренсные значения*) Control (reference values*) 0,66 ± 0,16 91,99 ± 0,89 22,98 ± 2,65 5,85 ± 0,85
Смешанная форма МВ, n = 24 Pancreatic-insufficient CF, n = 24 2,58 ± 8,12 (0-38) 92,9 ± 29,9 (63-100) 14,27 ± 11,48 (0-48,8) 5,88 ± 8,31 (0-30,7)
Легочная форма МВ, n = 20 Pancreatic-sufficient CF, n = 20 2,34 ± 2,41 (0-7,2) 88,83 ± 8,37 (63-100) 17,82 ± 15,96 (0-66) 6,44 ± 7,12 (0-28,4)
Смешанная и легочная формы МВ, n = 44 Pancreatic-sufficient and pancreatic-insufficient CF, n = 44 2,69 ± 8,10 (0-38) 91,48 ± 9,84 (63-100) 15,85 ± 13,52 (0-66) 5,97 ± 7,46 (0-30)
*Референсные значения взяты из статьи Л.Ф. Курило и соавт. [8]. *Reference values were taken from L.F. Kurilo et al. [8].
E
W
E
Олигоспермия отмечена у 37 (92,5 %) из 40 пациентов с МВ, имеющих азоо- или олигозооспермию тяжелой степени. У 1 пациента со смешанной формой МВ и азооспермией, обследованного дважды, при первичном спермиологическом исследовании обнаружен нормальный (1,8 мл) объем эякулята, а при повторном — сниженный (1,0 мл). Среди 4 пациентов с МВ, имеющих олиго- (п = 2), астено- (п = 1) и нормозоо-спермию (п = 1), только у пациента с астенозооспер-мией показатель объема эякулята был ниже нормативных показателей (1,0 мл при первичном анализе, 0,5 мл — при повторном).
Кислотность эякулята варьировала от кислой до щелочной (рН от 5,5 до 8,0). У 36 (81,8 %) пациентов ее показатель был меньше нормы (рН <7,2), при этом в группе мужчин со смешанной формой МВ не отмечено значений рН выше 6,5. Среднее значение рН являлось значимо большим (р = 0,00005) в группе пациентов с легочной формой МВ. У 11 из 16 пациентов с азоо- или олигозооспермией тяжелой степени выявлены олигоспермия и сниженный рН эякулята, из остальных 5 пациентов этой группы у 2 отмечена олиго-спермия при нормальном рН, у 1 — нормальный объем при сниженном рН и у 2 — нормальные объем и рН.
Следует отметить, что помимо олиго- и азооспермии и низкого рН семенной жидкости у большинства пациентов с МВ отмечены наличие эякулята белого цвета и отсутствие прозрачности/полупрозрачности, характерной для азоо- и олигозооспермии тяжелой степени. В норме эякулят непрозрачен и имеет бело-
серый цвет или сероватый оттенок [1]. Вязкость эякулята пациентов с МВ выраженно варьировала: от нормальных (5—20 мм) до повышенных значений (до 60 мм). Ее средний показатель значимо не различался между группами пациентов (р = 0,287).
Концентрация лейкоцитов в эякуляте ни у одного мужчины из выборки обследованных пациентов с МВ не превышала нормативных значений (1 млн/мл) [1].
В результате проведенного ККА НПК у мужчин с МВ, в том числе у всех пациентов с азооспермией (по данным стандартного спермиологического анализа), в осадке эякулята обнаружены сперматозоиды (2—207), а у 42 мужчин и НПК (8—423), представленные сперматидами и сперматоцитами разных стадий развития (табл. 2). У 2 пациентов с азоо-/криптозооспермией найдены сперматозоиды без НПК. Все сперматозоиды в анализах пациентов с азоо-/криптозооспермией, олигозооспермией тяжелой степени имели аномалии строения головки и жгутика (рис. 2).
В ряде образцов эякулята, в том числе от некоторых пациентов с азооспермией (по данным стандартного спермиологического анализа), сперматозоиды обнаружены в агрегатах микробных биопленок (рис. 3). Конгломераты, содержащие сперматозоиды, выявлены у 6 из 34 (17,6 %) мужчин с азоо-/криптозооспермией, из них у 3 пациентов отмечено наличие легочной формы МВ и у 3 — смешанной формы.
Стандартное спермиологическое исследование и ККА НПК проведены 4 пациентам с МВ, имеющим сохраненную проходимость семявыносящих путей,
Таблица 3. Результаты стандартного спермиологического исследования и количественного кариологического анализа соотношения разных стадий сперматогенеза незрелых половых клеток (НПК) у пациентов с муковисцидозом без азоо-/криптозооспермии, n = 4 Table 3. Results of standard sperm examination and quantitative karyological analysis of the ratio between different stages of immature germ cell (IGC) in patients with cystic fibrosis without azoo-/cryptozoospermia, n = 4
Рис. 3. Сперматозоиды с атипичной формой головки (большинство без жгутиков) в агрегатах микробных биопленок в препарате из суспензии эякулята пациента с МВ и азоо-/криптозооспермией; окрашивание по Романовскому—Гимзе; х 400
Fig. 3. Spermatozoa with atypical head shape (most of them without tails) in aggregates of microbial biofilms in the ejaculate sediment of a patient with cysticfibrosis and azoo-/cryptozoospermia; Romanovsky—Gimze staining; х 400
в том числе с олигозооспермией (n = 2), астенозооспер-мией (n =1) и нормозооспермией (n = 1) (табл. 3). У 3 из этих 4 пациентов отмечен нормальный объем эякулята, у 1 — сниженный. Показатель рН семенной жидкости у всех 4 пациентов находился в пределах нормы. Вязкость эякулята была нормальной у 3 и повышенной — у 1 больного. У 2 мужчин (образцы 28605 и 51591) выявлена нетяжелая форма олигозооспермии, еще у 2 (образцы 34062 и 49465) концентрация сперматозоидов в пределах нормы. У 1 пациента количество морфологически нормальных сперматозоидов находилось в пределах нормы, у 3 диагностирована тератозо-оспермия. Морфологически аномальные сперматозо-
Рис. 2. Сперматозоид с атипичной формой головки и жгутика (указан стрелкой) в препарате осадка эякулята пациента с муковисцидозом; окрашивание по Романовскому—Гимзе; х 400
Fig. 2. Spermatozoon with atypical shapes of the head and tail (indicated by an arrow) in the ejaculate sediment of a patient with cystic fibrosis and azoo-/ cryptozoospermia; Romanovsky—Gimze staining; х 400
Данные спермиологического исследования Номер образца
28605 34062 49465 51591
Возраст пациента, лет Patient age, years 19 17 25 18
Объем, мл Volume, ml 1,8 3,5 1,0 2,5
рН 7,4 7,5 7,8 7,8
Вязкость, мм Viscosity, mm 10 15 15 60
Концентрация сперматозоидов, млн/мл Sperm concentration, million/ ml 7,2 158,0 243,0 10,5
Живые сперматозоиды, % Alive spermatozoa, % 94 92 98 84
Морфологически нормальные, % Morphologically normal, % 0 12 0 0
Сперматозоиды с поступательным движением,% Progressive motile spermatozoa, % 13 39 2 31
Лейкоциты, млн/мл Leukocytes, million/ml 0,5 1,0 0,5 0,8
Индекс НПК, % IGC index, % 24,0 7,4 10,0 7,0
Сперматоциты I порядка (прелептотена, зиготена), % Primary spermatocytes (preleptotene, zygotene), % 7,2 2,3 3,0 6,0
Сперматоциты II порядка, % Secondary spermatocytes, % 63,8 87,0 84,0 81,0
Нерасхождение ядер сперматид, % Spermatid nuclear nondisjunction, % 29 16 16 14
Неидентифицируемые НПК, % Non-identifiable IGC, % 28,4 4,5 13,0 10,6
иды имели различные формы атипии, наиболее частые среди них представлены нарушениями строения акро-сомы. У всех 4 пациентов индекс НПК превышал нормативные значения (2—4 %), отмечено повышенное количество сперматоцитов на допахитенных стадиях.
Биохимическое исследование семенной жидкости выполнено у 12 мужчин с МВ, в том числе у 7 пациентов
Е га Е
со смешанной формой МВ и у 5 — с легочной формой (табл. 4). У остальных пациентов биохимическое исследование не проведено вследствие недоступности биологического материала или малого объема эякулята.
Среднее значение содержания фруктозы в семенной жидкости в группе пациентов со смешанной формой МВ составило 0,122 ± 0,067 мг, а в группе пациентов с легочной формой МВ — 2,524 ± 3,629 мг. Только в 1 из 12 образцов ее концентрация была нормальной, в 2 других — ближе к нижней границе нормы, в остальных 9 — значительно ниже (менее 0,3 мг) нормы. У 3 из 5 обследованных мужчин с легочной формой МВ выявлено более высокое содержание фруктозы по сравнению с пациентами со смешанной формой МВ.
Среднее значение нейтральной а-гликозидазы в семенной жидкости у обследованных пациентов с МВ
4 ТОМ 18 / VOL. 18 2 0 17
равнялось 36,52 ± 41,24 мМЕ (табл. 4). Количество данного фермента в исследованных образцах эякулята у 6 пациентов находилось в пределах нормы (в том числе у обоих мужчин с нормальными объемом и рН эякулята), а у 6 пациентов оно было ниже нормативных значений (менее 20 мМЕ). У мужчин с МВ, у которых обнаружено нормальное количество а-гликозидазы в семенной жидкости, объем эякулята был не менее 1 мл. Зависимости данного биохимического маркера от формы МВ не выявлено.
Количество лимонной кислоты в семенной жидкости (биохимический маркер секреторной функции предстательной железы и эндокринной функции яичек) исследовано у 7 мужчин с МВ. Ее содержание в эякуляте варьировало от 1,56 до 47,4 мг, при этом у 4 пациентов было сниженным, а у 3 — нормальным.
Таблица 4. Сперматологические и биохимические показатели эякулята у пациентов с муковисцидозом (МВ), n = 12 Table 4. Spermatological and biochemical characteristics of the ejaculate ofpatients with cystic fibrosis (CF), n = 12
Код
паци- Возраст, ента лет
Patient Age, years code
Форма МВ
Спермиологический диагноз
Spermiological diagnosis
Биохимический показатель во всем объеме семенной жидкости
Biochemical characteristic in the seminal fluid volume
Фруктоза (>2,4 мг*) Нейтральная Лимонная
a-гликозидаза, (>20 мМЕ*) кислота, мг
(>10 мг*)
*Референсное значение. *Reference value.
Примечание. Н. и. — не исследовано. Note. N. s. stands for not studied.
48468 27 0,9 6,0 0,099 18,81 H. и. N. s.
51947 22 0,7 6,0 0,112 17,57 7,0
52744 29 Смешан- 1,0 5,9 0,12 26,1 11,5
52942 26 ная Pancreatic- Азооспермия Azoospermia 1,0 6,0 0,12 26,5 H. и. N. s.
53039 23 insufficient 0,6 6,0 0,102 13,44 1,56
53478 24 0,2 6,0 0,04 4,32 H. и. N. s.
54413 28 1,0 6,1 0,26 30,5 2,6
к л 50838 23 Азооспермия Azoospermia 6,0 8,0 1,98 126,6 47,4
Е Олигозооспермия
га s 51625 26 тяжелой степени Severe 5,0 7,2 8,85 119,5 30,5
с Легочная Pancreatic-sufficient oligozoospermia
к 53204 29 Азооспермия Azoospermia 1,4 6,0 1,498 30,38 H. и. N. s.
га Олигозооспермия H. и. N. s.
•а 53363 27 тяжелой степени Severe 0,5 6,2 0,075 10,75
га oligozoospermia
53807 28 Азооспермия Azoospermia 0,6 6,0 0,216 13,74 5,94
У 2 пациентов (коды 50838 и 51625) из 12 мужчин с МВ, которым проведено биохимическое исследование, диагностирована соответственно азоо- и олигозооспер-мия тяжелой степени (табл. 4). По результатам комплексного спермиологического исследования данные пациенты не имели двусторонней обструкции семявы-носящих путей, поскольку показатели объема, pH и биохимических показателей свидетельствовали о возможном сохранении проходимости семявыносящих путей.
Обсуждение
Полученные данные свидетельствуют о наличии выраженных спермиологических нарушений примерно у 90 % мужчин с МВ, что объясняет высокую (97—98 %) частоту бесплодия у данных пациентов. Азоо-/крип-тозоо-, олигоспермия и выраженное снижение уровня рН и содержания фруктозы в семенной жидкости у мужчин с МВ, как и у пациентов с синдромом CBAVD (rangent! bilateral absence of the vas deferens — врожденная двусторонняя аплазия семявыносящих протоков), обусловлены двусторонней обструкцией семявынося-щих протоков и аплазией семенных пузырьков, секрет которых составляет большую часть объема семенной жидкости [12]. При неполной обструкции семявыно-сящих путей на уровне семявыносящего протока и/или эпидидимиса в семенной жидкости обнаруживают малое число сперматозоидов и НПК [13—16].
Результаты обследования мужчин с МВ и синдромом CBAVD позволили выделить сперматологические признаки, характерные для обструкции семявынося-щих путей: олигоспермию (объем эякулята менее 1,5 мл), эякулят белого цвета и/или pH менее 7,0, а также низкое (<2,4 мг) содержание фруктозы в семенной жидкости. Для пациентов с МВ характерно нарушение экскреции желез внешней секреции из-за густого вязкого секрета, его застоя, инфицирования и хронического воспаления. У обследованных нами пациентов с МВ врожденные пороки развития и воспалительные заболевания половых органов в анамнезе не отмечены, выявлена нормальная концентрация лейкоцитов и у большинства нормальная вязкость эякулята, что свидетельствовало о невоспалительном характере поражения семявыносящих путей и половых желез. Согласно результатам биохимического исследования семенной жидкости мужчин с МВ экскреторная функция эпидидимиса может быть сохранна у половины из них, в том числе у 1/3 пациентов с обструктивной формой азооспермии, а секреторная функция предстательной железы — у большинства.
Нарушение проходимости семявыносящих протоков, функции хлорного канала в половых клетках и клетках Сертоли с возрастом пациента с МВ прогрессивно нарастают [17]. В норме сперматогенез протекает при активном участии клеток Сертоли: в них экс-прессируется белок CFTR [5, 18]. Белок способствует
секреторной и нутритивной функциям клеток Сертоли в отношении половых клеток, регулирует движение жидкости в извитых семенных канальцах яичка. Секреция жидкости в семявыносящих канальцах важна для нормального прохождения процессов спермиоге-неза, так как она обеспечивает созревание и транспорт сперматозоидов в эпидидимис. Возможным механизмом нарушения сперматогенеза при мутациях гена МВ могут быть как дефекты регуляторной функции клеток Сертоли, так и снижение экспрессии белка CFTR в НПК. Повышенное количество сперматоцитов на допахитенных стадиях и резко повышенный или неопределяемый индекс НПК свидетельствуют о патологических изменениях в мейозе у мужчин, страдающих МВ. Изменения в клетках Сертоли вызывают прогрессирующее поражение. Таким образом, тяжесть непроходимости в семенных канальцах зависит от типа CFTR-мутаций/генотипа и возраста пациентов [17]. А также у мужчин с МВ сперматоло-гические изменения могут иметь сочетанный характер поражения в результате как нарушений проходимости семявыносящих путей и секреции придаточных половых желез (в основном), так и поражения собственно сперматогенеза.
С развитием репродуктивных технологий у мужчин с азоо- и олигозооспермией тяжелой формы появилась возможность иметь собственных детей. У пациентов с МВ повышен риск рождения детей, больных МВ, поэтому при планировании деторождения необходимо провести обследование супруги на носительство мутаций гена CFTR с последующим медико-генетическим консультированием по поводу вероятности передачи МВ потомству. А в случае наличия мутаций (высокий риск наследования МВ) рекомендовать соответствующую дородовую (преимплантационную или пренаталь-ную) ДНК-диагностику.
Заключение
Бесплодие, отмечаемое у большинства мужчин с МВ, обусловлено нарушением проходимости семя-выносящих протоков, приводящим, как следствие, к обструктивной азооспермии. Частичная сохранность проходимости семявыносящих путей, а также выявленные случаи прогрессирования с возрастом аплазии vas deferens и семенных пузырьков у пациентов с МВ свидетельствуют не о первичном отсутствии (агенезии), а о нарушении развития данных производных вольфо-вых протоков. Характерными сперматологическими признаками при этом являются азоо-/криптозооспер-мия в сочетании с олигоспермией и низкими показателями pH и содержания фруктозы эякулята. У молодых мужчин с легочной формой МВ чаще встречаются сохраненная проходимость семявыносящих протоков и возможная фертильность. Учитывая высокую вероятность прогрессирования поражения репродуктивной
Е га Е
системы и нарушения фертильности, молодым мужчинам с МВ необходимо рекомендовать криоконсер-вацию сперматозоидов для дальнейшего использования
в программах ЭКО/ICSI (экстракорпоральное опло-дотворение/интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interests. Authors declare no conflict of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
E
W
E
1. Муковисцидоз. Под ред. Н.И. Капранова, Н.Ю. Каширской. М.: Медпрак-тика-М., 2014. ISBN: 978-5-98803-314-1. [Cystic fibrosis. Eds.: N.I. Kapranov, N.Yu. Kashirskaya. Moscow: Medpraktika-M., 2014. (In Russ.) ISBN: 978-5-98803314-1].
2. Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem B. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science 1989;245 (4922):1066-73. DOI: 10.1126/ science.2475911. PMID: 2475911.
3. Chen M., Du J., Jiang W. et al. Functional expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in rat oviduct epithelium. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 2008;40(10):864-72.
DOI: 10.1111/j.1745-7270.2008.00469.x. PMID: 18850051.
4. Черных В.Б. Ген муковисцидоза и нарушение фертильности у мужчин. Андро-логия и генитальная хирургия 2010;4: 23-31. [Chernykh V.B. Cystic fibrosis gene and fertility disorders in men. Andrologiya i Genitalnaya Khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2010;4:23-31. (In Russ.)].
5. Boockfor F.R., Morris R.A., DeSimone D.C. et al. Sertoli cell expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol 1998;
274(4 Pt 1): 922-30. PMID: 9575788.
6. Teixeira S., Sa R., Grangeia A. et al. Immunohystochemical analysis of CFTR in normal and disrupted spermatogenesis. Syst Biol Reprod Med 2013;59:53-9. DOI: 10.3109/19396368.2012.718851. PMID: 22989055.
7. Руководство ВОЗ по исследованию
и обработке эякулята человека. 5-е изд., 2010 г. Пер. с англ. Н.П. Макарова. Науч. ред. Л.Ф. Курило. М.: Капитал Принт, 2012. [WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th ed., 2010. Trans. from English N.P. Makarova. Scientific. ed. by L.F. Kurilo. Moscow: Kapital Print, 2012.].
8. Курило Л.Ф., Дубинская В.П., Остроумова Т.В. и др. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам эякулята. Проблемы репродукции 1995;3:33-8. [Kurilo L.F., Dubinskiy V.P., Ostroumova T.V. et al. Evaluation of spermatogenesis in the immature germ cells in ejaculate. Problemy Reproduktsii = Problems of Reproduction 1995;1(3):33-8. (In Russ.)].
9. Курило Л.Ф., Чеботарев А.Н., Шилейко Л.В. др. Сравнительный анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их дифферен-цировки в биоптате яичка и эякуляте
у пациентов с азоо- и олигозоосперми-ей. Проблемы репродукции 1997;1:80-4. [Kurilo L.F.,Chebotarev A.N., Shileyko L.V. et al. Comparative analysis of the ratio of immature germ cells at different stages of their differentiation in the biopsy of the testis and ejaculate in patients with azoo- and oligozoo-spermia. Problemy reproduktsii = Problems of Reproduction 1997;3(1):80-4. (In Russ.)].
10. Андреева М.В., Хаят С.Ш., Шилейко Л.В. и др. Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята как часть протокола обследования мужчин с бесплодием в браке. Андрология и гени-тальная хирургия 2017;18(1):62-9. DOI: 10.17650/2070-9781-2017-18-1-62-69. [Andreeva M.V., Khayat S.S., Schileiko L.V. et al. Quantitative karyological analysis
of immature germ cells from ejaculate as part of examination of patients with infertility in marriage. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2017;18(1):62-9. (In Russ.)].
11. Cooper T.G., Weidner W., Nieschlag E. The influence of inflammation of the human male genital tract on secretion
of the seminal markers alpha-glucosidase, glycerophosphocholine, carnitine, fructose and citric acid. Int J Androl 1990;13(5):
329-36. DOI: 10.1111/j.1365-2605.1990. tb01040.x. PMID: 2283178.
12. von Eckardstein S., Cooper T.G., Rutscha K. et al. Seminal plasma characteristics as indicators of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene mutations in men with obstructive azoospermia. Fertil Steril 2000;73(6):1226-31.
DOI: 10.1016/S0015-0282(00)00516-1. PMID: 10856487.
13. Silber S.J., Rodriguez-Rigau L.J. Quantitative analysis of testicle biopsy: determination of partial obstruction and prediction
of sperm count after surgery for obstruction. Fertil Steril 1981;36(4):480-5. DOI: 10.1016/S0015-0282(16)45798-5. PMID: 7286271.
14. Jarow J.P., Budin R.E., Dym M. et al. Quantitative pathologic changes in the human testis after vasectomy. A controlled study. N Engl J Med 1985;313(20):1252-6. DOI: 10.1056/NEJM198511143132003. PMID: 4058505.
15. Mak V., Zielenski J., Tsui L.C. et al. Proportion of cystic fibrosis gene mutations not detected by routine testing in men with obstructive azoospermia. JAMA 1999; 281(23):2217-24. DOI: 10.1001/jama. 281.23.2217. PMID: 10376575.
16. Mak V., Zielenski J., Tsui L.C. et al. Cystic fibrosis gene mutations and infertile men with primary testicular failure. Hum Re-prod 2000;15(2):436-9. DOI: 10.1093/ humrep/15.2.436. PMID: 10655318.
17. Diao R., Fok K.L., Zhao L. et al. Decreased expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator impairs sperm quality in aged men. Reproduction 2013;146(6):637-45. DOI: 10.1530/REP-13-0146.
PMID: 24077955.
18. Rato L., Socorro S., Cavaco J.E. et al. Tubular fluid secretion in the seminiferous epithelium: ion transporters and aquaporins in Sertoli cells. J Membr Biol 2010;236(2):215-24.
DOI: 10.1007/s00232-010-9294-x. PMID: 20697886.
Статья поступила: 21.09.2017. Принята в печать: 20.11.2017. Article received: 21.09.2017. Accepted for publication: 20.11.2017.
