CC BY
50
УДК [597.442:597-113.2]:556.551.32
А. Н. Невалённый, Д. А. Бедняков, В. Ю. Новинский
КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПРОЦЕССОВ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ У СЕВРЮГИ
A. N. Nevalenny, D. A. Bednyakov, V. Yu. Novinsky
COMPREHENSIVE STUDY OF PECULIARITIES OF MEMBRANE DIGESTION PROCESSES IN STELLATE
Впервые исследовано влияние температуры, концентрации водородных ионов и модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности пищеварительных ферментов севрюги. Установлено, что оптимальные значения уровня активности мальтазы, казеинлитиче-ских протеиназ и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника севрюги соответствуют диапазону значений температуры 50-60 °С, в то время как для а-амилазы - 20-30 °С. Для концентрации водородных ионов зона оптимальных значений исследуемых ферментов найдена в диапазоне рН 7,0-10,0. Продемонстрировано, что модификаторы углеводной и белковой природы могут достоверно изменять уровень активности мальтазы, казеинлитических протеи-наз и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника севрюги.
Ключевые слова: севрюга, пищеварительные ферменты, температура, концентрация водородных ионов, модификаторы.
The influence of temperature, concentration of hydrogen ions and modifiers of carbohydrate and protein nature on the activity level of digestive enzymes of stellate is firstly investigated in the paper. It is found out that the optimal values of the activity level of maltase, caseinlithic proteases, and alkaline phosphatase of the intestine mucous coat of stellate correspond to the range of temperatures 50-60 °C, while for а-amylase - 20-30 °C. The zone of optimal values of the investigated enzymes is found in the pH range 7.0-10.0 for the hydrogen ion concentration. It is shown that carbohydrate and protein modifiers can significantly alter the activity level of maltase, caseinlithic proteases, and alkaline phosphatase of the intestine mucous coat of sturgeon.
Key words: stellate, digestive enzymes, temperature, concentration of hydrogen ions, modifiers.
Введение
Наблюдаемое в настоящее время катастрофическое сокращение численности осетровых в естественной среде стимулирует увеличение объемов выращивания этих видов в искусственных условиях. Одним из таких видов, выращиваемых в условиях Нижнего Поволжья, является севрюга. Искусственное выращивание осетровых предполагает наличие определенной научной базы, отражающей ключевые особенности биологии и физиологии видов, однако исследований, демонстрирующих особенности процессов пищеварения у осетровых, в том числе и у севрюги, в настоящее время недостаточно, о чем свидетельствуют сообщения последних лет [1-5].
По нашему мнению, важнейшими характеристиками при комплексном исследовании особенностей функционирования пищеварительной системы у рыб являются адаптационные механизмы по отношению к действию абиотических факторов среды и внедрению модификаторов различной природы. Среди абиотических факторов среды особое внимание следует уделить температуре, т. к. ее влияние на пойкилотермные организмы является гораздо более выраженным, чем на гомойотермные [1, 6-9], а также концентрации водородных ионов, т. к. пищеварительный тракт рыб находится в непосредственном контакте с внешней средой, и, таким образом, существует значительное влияние этого показателя на пищеварительную функцию у рыб [1, 6, 9, 10]. Действие модификаторов углеводной и белковой природы также может существенно изменять скорость протекания пищеварительных процессов, т. к. регуляция на ферментативном уровне происходит именно за счет этих компонентов [11].
Учитывая вышесказанное, целью работы являлось исследование влияния температуры, концентрации водородных ионов и модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги (Acipenser stellatus).
Материал и методы исследований
Материал был собран и обработан в 2009-2010 гг. Были использованы годовики севрюги, выращенные в искусственных условиях. Пойманных рыб в течение 1-2 часов доставляли в лабораторию, где у них на холоду изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку кишечника. Готовили суммарные пробы, в состав которых входила слизистая от 3-5 экземпляров. Слизистую тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогената. Гомогенаты готовили при помощи гомогенизатора (лабораторный гомогенизатор Daihan Scientific), добавляя охлажденный до 2-4 °С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 mM NaCl, 1,9 mM KCl, 1,1 mM CaCl2, 1,2 mM NaHCO3) в соотношении 1 : 49.
При исследовании влияния температуры содержимое пробирок инкубировали в диапазоне значений температуры 0-70 °С для мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфа-тазы и 0-60 °С для а-амилазы. Определение рН проводили в диапазоне 3-12 при температуре инкубации 25 °С. В качестве модификаторов использовались 10 mM растворы глюкозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы, глицина, глицил-глицина, Z-аспарагина, Z-лейцина, Z-глутамина, Z-P-фенил-а-аланина, а также эквимолярный раствор глюкозы и фруктозы. Модификаторы добавлялись в ферментативно активный препарат непосредственно перед инкубацией при температуре 25 °С.
Уровень активности а-амилазы (КФ 3.1.1.1) определялся по убыли крахмала модифицированным методом Смита и Роя, уровень активности мальтазы (КФ 3.2.1.20) - модифицированным глюкозооксидазным методом, щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) - по степени гидролиза n-нитрофенилфосфата. Казеинлитическую активность протеиназ (КФ 3.4.21) в нейтральной среде (рН = 7,4) определяли модифицированным методом Лоури [12].
В качестве субстратов были использованы: 0,1 % раствор крахмала для а-амилазы, 0,6 mM раствор n-нитрофенилфосфата для щелочной фосфатазы, 2 % раствор мальтозы для мальтазы, приготовленные на растворе Рингера, и 1 % раствор казеина для казеинлитических протеиназ, приготовленный на фосфатном буферном растворе (0,05 N Na2HPO4 + H2O в соотношении 1 : 3 соответственно). Активность фермента выражали в мг или мкмоль продуктов гидролиза, образующихся за 1 минуту инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани.
Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методикам [13]. Данные обрабатывали с использованием приложения EXCEL программы MS Office для WINDOWS XP.
Результаты исследований и их обсуждение
При исследовании влияния температуры инкубации на уровень активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника севрюги (рис. 1, а) было установлено, что оптимальные значения уровня активности приходятся на диапазон значений температуры 20-30 °С и уровень активности составляет 10,14 ± 0,25 мг/(г • мин) при температуре 20 °С и 10,38 ± 0,41 при температуре 30 °С. При температуре 0 °С уровень активности соответствовал 86 % от оптимального значения и был равен 8,91 ± 0,58 мг/(г • мин), при постмаксимальных значениях температуры (60 °С) уровень активности составлял 45 % от оптимума и был равен 4,62 ± 0,41 мг/(г • мин). Таким образом, оптимальные значения уровня активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника севрюги были найдены в зоне физиологических значений температуры (20-30 °С). Была выявлена также устойчивость исследованного фермента к широкому диапазону значений температуры, т. к. и при низких (0 °С) и при постмаксимальных значениях температуры (60 °С) сохранялась высокая активность фермента (не менее 45 % от оптимума).
Оптимальное значение уровня активности кишечной мальтазы севрюги (рис. 1, б) было найдено при температуре 60 °С и составило 19,19 ± 0,04 мкмоль/(г • мин). При температуре 0 °С уровень активности фермента соответствовал 20 % и составлял 3,88 ± 0,23 мкмоль/(г • мин); при температуре 70 °С - 15 % и 2,90 ± 0,15 мкмоль/(г • мин) от оптимума. Таким образом, было выявлено высокое значение температурного оптимума мальтазы севрюги. Кроме того, как в и случае с а-амилазой, была отмечена устойчивость исследуемого фермента к широкому диапазону значений температуры.
3
к
л
4 и н к о о к н О
сЗ
н
к
и
5!
л
и
л
н
о
о
к
т
К
Й
сз
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 25 30 40 50 60
рн
рн
б
£
К
л
ч
и
н
К
о
О
к
н
О
сЗ
н
к
и
5!
л
и
л
н
о
о
к
т
К
Й
сз
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
рн
в
рн
г
Рис. 1. Влияние температуры на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги, % от контроля, принятого за 100 %: а - а-амилазы, мг/(г • мин); б - мальтазы, мкмоль/(г • мин); в - казеинлитических протеиназ, мкмоль/(г • мин); г - щелочной фосфатазы, мкмоль/(г • мин)
а
Для казеинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника севрюги оптимальные значения (рис. 1, в) были установлены при температуре 50 °С и уровень активности при этом составил 3,30 ± 0,12 мкмоль/(г • мин). При температуре 0 °С уровень активности составил 23 % от оптимума и был равен 0,77 ± 0,05 мкмоль/(г • мин); при температуре 70 °С - 22 % и 0,72 ± 0,05 мкмоль/(г • мин) соответственно. Таким образом, и для казеинлитических протеиназ, как и для кишечной мальтазы севрюги, оптимум активности был обнаружен при высоких значениях температуры.
В случае с щелочной фосфатазой оптимальные значения (рис. 1, г) были найдены при температуре 60 °С и уровень активности составил 1,29 ± 0,04 мкмоль/(г • мин). При температуре 0 °С уровень активности соответствовал 19 % от оптимального значения и был равен 0,24 ± 0,03 мкмоль/(г • мин), при постмаксимальных значениях температуры (70 °С) уровень активности составлял 81 % от оптимума и был равен 1,05 ± 0,04 мкмоль/(г • мин).
Таким образом, для собственно кишечных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги (мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфатазы) оптимальные значения уровня активности были установлены при более высоких значениях температуры (50-60 °С), чем для а-амилазы (20-30 °С), что, вероятно, связано с панкреатическим происхождением этого фермента. Была выявлена также устойчивость всех исследованных ферментов севрюги к действию низких и постмаксимальных температур инкубации, что свидетельствует об адаптированности исследованных ферментов к значительным колебаниям температуры.
При исследовании влияния концентрации водородных ионов на уровень активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника севрюги оптимум (рис. 2, а) был обнаружен в диапазоне рН 7,0-8,0 и уровень активности составил 8,83 ± 0,16 и 8,95 ± 0,11 мг/(г • мин) соответственно. При рН 3,0 уровень активности составил 36 % от оптимального и был равен 3,24 ± 0,28 мг/(г • мин); при рН 12,0 уровень активности составил 49 % от оптимального значения и был равен 4,38 ± 0,19 мг/(г • мин).
3 4 5 6 7 8 9 101112
рн
120 л
20 -
0
3456789 10 1112 рН
а
б
6 7 8 9 10 11 12
рН
120 л
20 -
0
3456789 10 1112 рН
в
г
Рис. 2. Влияние концентрации водородных ионов на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги, % от контроля, принятого за 100 %: а - а-амилазы, мг/(г • мин); б - мальтазы, мкмоль/(г • мин);
в - казеинлитических протеиназ, мкмоль/(г • мин); г - щелочной фосфатазы, мкмоль/(г • мин)
Оптимальное значение уровня активности кишечной мальтазы севрюги (рис. 2, б) было найдено при значении рН 7,0, уровень активности составил 12,04 ± 0,08 мкмоль/(г • мин). При рН 3,0 уровень активности составил 31 % от оптимального и был равен 3,76 ± 0,08 мкмоль/(г • мин); при рН 12,0 уровень активности составил 43 % от оптимального значения и был равен 5,20 ± 0,23 мкмоль/(г • мин).
Для казеинлитических протеиназ оптимум ферментативной активности (рис. 2, в) был найден при рН от 10,0 и уровень активности составил 2,69 ± 0,04 мкмоль/(г • мин). При значениях рН 6,0 и 12,0 уровень активности составил 38 и 34 % от оптимального уровня соответственно и был равен 1,03 ± 0,04 и 0,92 ± 0,06 мкмоль/(г • мин).
В случае с щелочной фосфатазой оптимальные значения ферментативной активности (рис. 2, г) были найдены при значении рН 9,0 и уровень активности составил 0,30 ± 0,01 мкмоль/(г • мин). При рН 3,0 уровень активности составил 70 % от оптимального и был равен 0,21 ± 0,01 мг/(г • мин); при рН 12,0 уровень активности составил 30 % от оптимального значения и был равен 0,09 ± 0,01 мг/(г • мин).
Таким образом, для всех исследованных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги была отмечена устойчивость к широкому диапазону значений концентрации водородных ионов, т. к. и в крайних значениях рН сохраняется высокая степень ферментативной активности. Оптимальные значения уровня активности ферментов были найдены при щелочных значениях рН (от 7,0 до 10,0).
Данные, полученные при исследовании влияния модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности мальтазы, казеинлитических протеиназ и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника севрюги представлены в таблице.
Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги
Уровень активности фермента, мкмоль/(г • мин) Модификатор/ фермент Мальтаза Казеинлитические протеиназы Щелочная фосфатаза
Контроль 10,61 ± 0,07 2,58 ± 0,04 0,38 ± 0,01
Г люкоза 2,21 ± 0,07 2,58 ± 0,04 0,38 ± 0,01
Фруктоза 11,72 ± 0,17 2,80 ± 0,04 0,37 ± 0,01
Г люкоза + фруктоза 7,12 ± 0,17 2,76 ± 0,02 0,37 ± 0,01
Сахароза 11,00 ± 0,10 2,56 ± 0,04 0,38 ± 0,01
Мальтоза - 2,52 ± 0,04 0,37 ± 0,01
Г лицин 10,47 ± 0,07 2,35 ± 0,06 0,38 ± 0,01
Г лицил-глицин 10,64 ± 0,07 2,74 ± 0,06 0,38 ± 0,01
^Аспарагин 10,44 ± 0,07 2,71 ± 0,06 0,37 ± 0,01
£-Лейцин 10,51 ± 0,07 2,05 ± 0,04 0,38 ± 0,01
^Глутамин 10,51 ± 0,07 2,12 ± 0,02 0,40 ± 0,01
^р-Фенил-а-аланин 11,07 ± 0,07 2,07 ± 0,04 0,39 ± 0,01
При исследовании влияния модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника севрюги было установлено существенное ингибирование уровня активности фермента в присутствии продуктов гидролиза мальтозы. Так, 10 тМ раствор глюкозы снижал уровень активности фермента на 79 % от контроля, а 10 тМ раствор глюкозы и фруктозы - на 33 %, 10 тМ раствор фруктозы, напротив, активировал фермент на 10 %. Аминокислоты увеличивали скорость гидролиза мальтазы или не вызывали достоверных изменений.
При исследовании влияния модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности казеинлитических протеиназ у севрюги было продемонстрировано, что присутствие углеводов в гидролитической реакции достоверно не изменяет уровень активности ферментов; присутствие аминокислот достоверно изменяло уровень активности ферментов, причем наблюдался разнонаправленный эффект.
При исследовании влияния модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности щелочной фосфатазы севрюги было выявлено, что углеводы и аминокислоты не вызывают достоверных изменений в уровне активности этого фермента.
Заключение
Таким образом, комплексное исследование особенностей адаптации пищеварительной системы севрюги к некоторым абиотическим факторам среды и модификаторам различной природы дополняет данные о физиолого-биохимическом статусе данного вида. Продемонстрирован ряд закономерностей, характеризующих влияние температуры, концентрации водородных ионов и модификаторов углеводной и белковой природы на уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника севрюги. Полученные закономерности могут быть использованы для оптимизации выращивания этого вида в искусственных условиях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Невалённый А. Н., Туктаров А. В., Бедняков Д. А. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2003. - 152 с.
2. Бедняков Д. А. Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Астрахань, 2004. - 24 с.
3. Кузьмина В. В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб / Ин-т биол. внутр. вод им. И. Д. Папанина. - М.: Наука, 2005. - 300 с.
4. Волкова И. В. Особенности функционирования пищеварительной системы рыб различных трофо-логических групп: автореф. дис. .канд. биол. наук. - Астрахань, 2010. - 24 с.
5. Невалённый А. Н., Бедняков Д. А., Новинский В. Ю. Исследование некоторых характеристик ферментов, обеспечивающих процесс мембранного пищеварения у веслоноса Polyodon Spathula // Вопр. ихтиологии. - 2010. - Т. 50, № 3. - С. 400-404.
6. Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. - СПб.: Гидроме-теоиздат, 1993. - 283 с.
7. Голованова И. Л., Кузьмина В. В., Голованов В. К. Воздействие высоких температур на пищеварительные гидролазы серебряного карася Carassius auratus // Вопр. ихтиологии. - 2002. - Т. 42, № 1. -С. 112-128.
8. Коростелев С. Г., Невалённый А. Н. Влияние температуры на пищеварительно-транспортную функцию кишечника карповых рыб // Вопр. ихтиологии. - 2005. - Т. 45, № 2. - С. 225-235.
9. Кузьмина В. В., Ушакова Н. В. Влияние температуры, рН и тяжелых металлов (медь, цинк) на активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта типичных и факультативных ихтиофагов // Вопр. ихтиологии. - 2007. - Т. 47, № 4. - С. 566-573.
10. Кузьмина В. В., Невалённый А. Н. Влияние концентрации водородных ионов на активность карбо-гидраз пищеварительного тракта рыб // Вопр. ихтиологии. - 1983. - Т. 23, № 3. - С. 481-490.
11. Влияние модификаторов на пищеварительные гидролазы у рыб разных систематических групп /
А. Н. Невалённый, Д. А. Бедняков, В. Ю. Новинский, С. Г. Коростелёв // Вопр. ихтиологии. - 2011. -
Т. 51, № 3. - С. 1-6.
12. Невалённый А. Н., Бедняков Д. А., Дзержинская И. С. Энзимология: учеб. пособие. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2005. - С. 74-79.
13. Глинский В. В., Ионин В. Г. Статистический анализ: Руководство по обучению. - М.: ИНФРА-М; Новосибирск: Сибирское соглашение, 2002. - 241 с.
Статья поступила в редакцию 14.09.2011
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Невалённый Александр Николаевич - Астраханский государственный технический университет; д-р биол. наук, профессор; профессор кафедры «Гидробиология и общая экология»; nevalennyy@rambler.ru.
Nevalenny Alexander Nickolaevich - Astrakhan State Technical University; Doctor of Biological Science, Professor; Professor of the Department "Hydrobiology and General Ecology"; nevalennyy@rambler.ru.
Бедняков Дмитрий Андреевич - Астраханский государственный технический университет; канд. биол. наук, доцент; доцент кафедры «Социально-культурный сервис и туризм»; bednyakovd@rambler.ru.
Bednyakov Dmitry Andreevich - Astrakhan State Technical University; Candidate of Biological Science, Assistant Professor; Assistant Professor of the Department "Social-Cultural Service and Tourism"; bednyakovd@rambler.ru.
Новинский Вениамин Юрьевич - Астраханский государственный технический университет; младший научный сотрудник лаборатории «Физиология питания рыб»; novinskii@bk.ru.
Novinsky Veniamin Yurievich - Astrakhan State Technical University; Junior Research Worker of the Laboratory "Physiology of Fish Feeding"; novinskii@bk.ru.
