CC BY
39
Шилова Е. Р., Балашова В. А., Кострома И. И., Литвинская Е. В., Потихонова Н. А., Ругаль В. И., Ряднова Г. М., Семенова Н. Ю., Хоршева И. В.
ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России», Санкт-Петербург
КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЕМОПОЭЗА У БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ В ДИНАМИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Shilova E., Balashova V., Kostroma I., Litvinskaya E. V., Potikhonova N., Rugal V., Ryadnova G., Semenova N., Khorsheva I.
State Organization "Russian Scientific Research Institute of Hematology and Transfusiology FMBA of Russia", St. Petersburg
COLONYFORMING CAPACITY OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS IN PATIENTS WITH APLASTIC ANEMIA IN THE DYNAMICS OF THE DISEASE
Ключевые слова: апластическая анемия, колониеобразующая способность, гемопоэ-тические стволовые клетки, иммуносупрес-сивная терапия
Резюме. Одним из патогенетических механизмов развития апластической анемии (АА) считается патология гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), характеризующаяся снижением их пролиферативного потенциала. Нами проанализированы результаты культу-ральных исследований ГСК костного мозга 41 больного АА: 29 с тяжёлой формой АА (ТАА) и 12 с нетяжёлой (НАА). Для оценки колоние-образующей способности (КОС) клеток-предшественников гемопоэза больных АА, как показателя пролиферативного потенциала ГСК, применялся метод культивирования клеток костного мозга в полной среде МеШоСик Н4435 на основе метилцеллюлозы. Исследования проводились на различных стадиях заболевания, в том числе у 12 больных при первичном обследовании с последующими исследованиями на стадии ремиссии и в случае рецидива. На стадии частичной ремиссии (ЧР) обследовано 22 пациента, полной (ПР) — 12 больных.
Key words: aplastic anemia, colonyforming capaclity, hematopoietic stem cells, immunosuppressive therapy
Summary. Data about colonyforming capaclity (CFC) of hematopoietic stem cells in patients with aplastic anemia (AA) depending on stage of disease and results of immunosuppressive therapy have been shown. Total surveyed 41 patients with AA. Research showed lowering of CFC of hematopoietic stem cells or absence of colonies in the initial stage. After successful immunosuppressive therapy CFC usually improved. The results showed that recovery of CFC may be evidence of effective therapy. At the same time significantly reduced CFC in remission may indicate an increased risk of relapse.
Результаты исследования показали значительные колебания показателей КОС на всех стадиях. Для первичных больных характерным было значительное снижение КОС до полного отсутствия колоний в культуре, что отмечено у 10 пациентов (83 %). Однако у 2 пациентов имелись показатели, соответствующие пределам нормальных колебаний. При положительных результатах иммуносу-прессивной терапии (ИСТ) показатели КОС
увеличивались и приближались к нормальным значениям в ремиссии. При развитии рецидива закономерно наблюдалось повторное снижение показателей, хотя и менее выраженное, чем исходно. Относительная сохранность КОС в начальном периоде заболевания не всегда свидетельствовала о лучшем прогнозе в отношении ИСТ, что может быть связано с особенностями патогенеза заболевания, отличными от общей группы. Получен-
ные нами данные позволяют говорить о том, что восстановление исходно сниженной КОС при становлении ремиссии может быть свидетельством адекватности проводимой ИСТ.
Введение. Апластическая анемия — тяжёлое заболевание кроветворной системы, которое характеризуется панцитопенией в периферической крови и гипоклеточным костным мозгом. Основные положения современной концепции патогенеза АА, сформулированные ещё в 70-х годах прошлого века и дополненные данными последующих научных исследований, позволяют говорить о патогенезе АА, как о патологическом процессе, обусловленном нарушением иммунной регуляции кроветворения, что послужило основой для успешного использования средств иммуносупрессивной терапии (ИСТ) у данной категории больных [1, 2, 3, 4]. В то же время не исключается и важная роль нарушения состояния стромального микроокружения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), а также патология самих ГСК со снижением их пролиферативного потенциала. Изучение особенностей состояния костномозговых клеток больных АА показало целый ряд нарушений. В частности, отмечено укорочение теломеразных участков, снижение экспрессии GATA-2 протеина, что может приводить к нарушению процессов пролиферации и преждевременной гибели костномозговых клеток [1, 2, 4, 5]. Имеются свидетельства сниженной чувствительности гемопоэтических клеток к регуляторным воздействиям [1, 2, 4, 6]. В результате таких нарушений и под воздействием неблагоприятных патогенетических факторов у большинства больных АА способность ГСК к образованию колоний в культуре, отражающая их функциональную активность, значительно снижена [1, 2, 6, 7, 8]. Показатели колониеобразующей способности (КОС) гемопоэтических клеток-предшественников могут служить определённым критерием, отражающим пролиферативный потенциал кроветворных клеток при АА.
Большинство исследователей отмечает гетерогенность группы пациентов с данной патологией и вероятность того, что у больных с неудовлетворительными результатами стандартной ИСТ механизмы развития заболевания отличаются от обычных, и ведущим фактором является иммунное повреждение кроветворения. Соответственно, для выбора адекватной терапии и прогнозирования
эффективности использования различных методов лечения важным является более глубокое понимание особенностей патогенеза АА, базирующееся на дальнейшем изучении особенностей нарушения кроветворения, динамики показателей в ходе терапии.
Цель работы. Оценить функциональную активность ГСК больных АА на различных стадиях заболевания путём культуральных исследований с определением КОС клеток-предшественников в динамике течения заболевания и под влиянием ИСТ.
Материалы и методы. Была исследована КОС костномозговых клеток 41 больного АА: с тяжёлой формой АА (ТАА) 29 больных, с нетяжёлой (НАА) —12 больных. Степень тяжести заболевания определялась в соответствии с международной классификацией, с использованием так называемых модифицированных критериев СашШ:а [2, 4, 8].
Пациенты обследовались на различных стадиях заболевания, в том числе 12 больных на стадии установления диагноза с повторными исследованиями в динамике при проведении стандартной ИСТ, на стадии ремиссии и в случае рецидива. Обследование остальных 29 больных проведено уже в ходе начатой терапии или на стадии ремиссии с повторными исследованиями с интервалами от 3 до 9 месяцев. Всего на стадии ЧР обследовано 22 пациента, в состоянии ПР — 12 больных. При определении полной и частичной ремиссии (ПР и ЧР) использовались критерии Европейской группы экспертов [2, 9, 10].
Для оценки КОС клеток-предшественников гемопоэза больных АА, как показателя пролиферативного потенциала ГСК, применялся общепринятый метод культивирования клеток костного мозга в полной среде МеШоСик Н4435 на основе метилцеллюлозы [8].
Результаты исследования показали значительные колебания показателей на всех стадиях. Исследования в группе первичных больных показали значительное снижение показателей КОС у 10 пациентов (83%): от полного осутствия или единичных колоний до 6 агрегатов на 1,5 х 105 клеток у 8 пациентов, у 2 больных ТАА показатели составили 39 и 49 колоний на 1,5 х 105 клеток при средних показателях в группе здоровых лиц 174 на 1,5 х 105 клеток (колебания в пределах 95-275) [8]. Обращали на себя внимание 2 пациентки с исходными показателями 220
и 273 на 1,5 х 105. Основные показатели гемограмм, миелограмм, трепанобиоптатов у данных пациентов существенно не отличались от показателей в основной группе и соответствовали критериям НАА. В результате проведенной ИСТ у обеих больных получены ремиссии, в том числе ПР у одной. Особенностью течения заболевания у данных пациенток были нестойкие результаты лечения, что потребовало проведения повторных курсов ИСТ. Одна больная обследована повторно в стадиях ремиссии и рецидива. Отмечено сохранение КОС в пределах нормальных колебаний (95-147 на 1,5 х 105 клеток) во всех проведенных исследованиях.
Имелись определённые различия в показателях первичных больных ТАА и НАА. Для больных ТАА, безусловно, характерно более значимое снижение показателей КОС. Так, медиана КОС для больных ТАА составила 3 на 1,5 х 105 клеток, а для больных НАА— 113 на 1,5 х 105 клеток. Однако малочисленность групп не даёт возможности достоверно оценить различия и сделать окончательные выводы.
Достоверными были различия между показателями КОС при первичном обследовании и на стадии ремиссии. При становлении ремиссии отмечено значительное улучшение показателей и приближение их к нормальным цифрам у абсолютного большинства обследованных.
Колебания показателей КОС, как в группе больных с ТАА, так и НАА в стадии ремиссии были крайне разнородными и составили от 9 до 404 на 1,5 х 105 клеток: от 1 до 265 агрегатов у больных с ЧР. Медиана показателей при ЧР составила 109,5 на 1,5 х 105 клеток, а при ПР — 114 на 1,5 х 105 клеток. Данные различия статистически достоверными не были.
При развитии рецидива закономерно наблюдалось повторное снижение показателей, хотя и меее выраженное, чем исходное снижение. Медиана КОС в группе больных с рецидивом составила 21 на 1,5 х 105 клеток.
Данные по КОС обследованных больных АА в зависимости от стадии заболевания представлены на рисунке 1.
Рисунок 1. Колониеобразующая способность клеток-предшественников гемопоэза у больных апластической анемией в зависимости от стадии заболевания.
Оценить прогностическую значимость показателей КОС ГСК больных АА в отношении результатов ИСТ по данным первичного обследования не имелось возможности. Сложности оценки связаны с определённой селекцией группы первично обследованных больных из-за невозможности проведения исследования у части пациентов в силу низ-
кой клеточности костномозгового пунктата, а также с учётом недостаточно большого числа исследований при становлении ремиссии и в связи с широким диапазоном колебаний полученных данных. Тем не менее, анализ показателей КОС больных, которым исследования проведены в динамике заболевания (14 больных), позволил выявить определён-
ные закономерности изменений и их связь с результативностью ИСТ.
Так, для больных с хорошими результатами терапии в виде стойких частичных ремиссий с переходом в полные, было характерно поэтапное нарастание показателей КОС с сохранением тенденции по достижении ЧР. В то же время у больных с неудовлетворительными результатами ИСТ с неполными и нестойкими ремиссиями была типична тенденция к снижению КОС. Эта тенденция проявлялась у пациентов с исходно близкими к норме по-
казателями на начальных этапах терапии и у части пациентов с ремиссиями при проведении обследований в динамике. Причём у ряда больных с полученной клинико-гема-тологической ремиссией снижение КОС было предвестником ухудшения гематологических показателей и наступления рецидивов.
Сравнительные данные по изменению показателей КОС клеток-предшественников гемопоэза в группе больных с хорошим и недостаточным эффектом ИСТ представлены на рисунках 2 и 3.
Динамика в ходе терапии:
на 1,5 х 105 клеток
Динамика в стадии ремиссии:
Ш-на
М-ва
М-ко
О-в
П-во
Б-на
Г-ль
Исходно Становление
ремиссии 1 2
Рисунок 2. Динамика показателей КОС у больных со стойкими ремиссиями.
300
Динамика а ходе терапии:
на 1,5 х 105 клеток
Динамика в стадии ремиссии:
500
450
400
350
К-ва 300
250
Л-ев
200
О-ч
150
100
50
0
-6-на -Б-на Д-в -м-ев -О-ч
Исходно В динамике
Рисунок 3. Динамика показателей КОС у больных с недостаточным эффектом ИСТ.
Выводы. Разнородность показателей, немногочисленность групп и сложность сравнения данных в зависимости от других патогенетических факторов не дают возможности сделать окончательные выводы в отношении изменений пролифе-ративного потенциала ГСК при АА. Тем не менее, отмечены определённые тенденции, отражающие изменение способности ГСК к колониеобразованию в данной группе больных. Патология ГСК проявляется характерным для данной категории больных снижением КОС клеток предшественников гемопоэза. Результаты представленных исследований показали резкое снижение КОС в начале заболевания у абсолютного большинства больных АА. В динамике заболевания под воздействием ИСТ показатели КОС клеток эритроидного и гранулоцитарного ростка увеличивались и приближались к нормальным показателям в ремиссии. В то же время, полученные результаты подтверждают биологическую неоднородность больных АА. Причём от-
носительная сохранность КОС в начальном периоде заболевания не всегда свидетельствует о лучшем прогнозе в отношении ИСТ. По-видимому, пациентам с такими вариантами АА необходимо более глубокое обследование, включая молекулярно-гене-тические исследования, поскольку данные особенности течения заболевания могут быть связаны с патогенетическими механизмами АА, отличными от обычной группы больных.
Исходя их анализа полученных нами данных, имеется возможность использования методики определения КОС, как дополнительного прогностического фактора при проведении этапных обследований в ходе ИСТ. Так, восстановление исходно сниженной КОС при становлении ремиссии может быть свидетельством адекватности проводимой ИСТ. Сохранение же значительно сниженных показателей может служить дополнительным показанием к проведению более интенсивной иммуносупрессии или же к рассмотрению вопроса о трансплантации ГСК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдулкадыров К.М, Бессмельцев С. С. Апластическая анемия. — СПб.: Изд-во «Наука»; «Издательство KN», 1995. — 232 с.
2. Кулагин А. Д., Лисуков И. А., Козлов В. А. Апластическая анемия: иммунопатогенез, клиника, диагностика, лечение — Новосибирск: Наука, 2008. — 236 с.
3. Guinan E. C. Diagnosis and management of aplastic anemia: ASH Education Book. — 2011. — P. 76-81.
4. Young N. S. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia: ASH Education Book. — 2013. — №1. — Р. 76-81.
5. Association of telomere length of peripheral blood leukocytes with hematopoietic relapse, malignant transformation, and survival in severe aplastic anemia/P. Scheinberg, J. N. Cooper, E. M. Sloand et al.//JAMA. — 2010. — Vol. 304. — P. 1358-1364.
6. Балашова В. А., Бессмельцев С. С., Шилова Е. Р., Абдулкадыров К. М. //Колониеобра-зующая способность клеток-предшественниц грануломоноцитопоэза в условиях аплазии костного мозга. Морфология. — 1994. — № 7-12. — С. 14-22.
7. Yong N. S., MaciejewskiJ. The Pathophysiology of Acquired Aplastic Anemia// N. Engl. J. Med. — 1997. — Vol. 336. — Р. 1365-1372.
8. Nissen-Druey C., Tichelli A., Meyer-Monard S. Human hematopoietic colonies in health and disease// Acta Haematol. — 2005. — Vol. 113, № 1. — P. 5-96.
9. Marsh J. C., Ball S. E., Cavenagh J. et al. Guidelines for the diagnosis and management of aplastic anaemia //Br. J. Haematology. — 2009. — Vol. 147. — Р. 43-70.
10. Комплексная программа диагностики апластической анемии с определением прогностически значимых патогенетических особенностей заболевания: Метод. рек. — СПб., Агентство «ВиТ-принт», 2015. — 32 с.
