CC BY
536
НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ
Коллекционная деятельность в области использования патогенных микроорганизмов в обеспечении биологической безопасности Российской Федерации
Г. Г. Онищенко1, В.В. Кутырев2, А.В. Осин2
1 Российская академия наук, Москва
2 ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт
"Микроб"» Роспотребнадзора, Саратов
В обзоре отражено современное состояние коллекционной деятельности, связанной с использованием патогенных микроорганизмов. Приведены основные этапы развития микробиологических коллекций, современная нормативно-правовая база, регламентирующая коллекционную деятельность и регулирующая ее основные аспекты. Определен круг основных задач, стоящих перед государственными коллекциями, направленных на обеспечение биологической безопасности и санитарно-эпидемиологического благополучия населения РФ и пути их решения. Сформулированы направления совершенствования Государственных коллекций патогенных микроорганизмов.
Ключевые слова:
коллекции патогенных микроорганизмов, штаммы микроорганизмов, технологии хранения, таксономия, молекулярная биология, паспортизация штаммов, каталоги микроорганизмов
Collection activities in the sphere of pathogenic microorganisms usage for the provision of biological safety in the Russian Federation
G.G. Onishchenko1, V.V. Kutyrev2, 1 Russian Academy of Sciences, Moscow
A.V. Osin2 2 Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov
The review reveals the current state of collection activities associated with usage of pathogenic microorganisms. Described are the key stages of microbiological collections' development, applicable normative-regulatory framework, governing collection activities and specifying its basic aspects. Defined is the scope of functions entrusted to the State Collections to provide biological safety and sanitary-epidemiological welfare of the population in the Russian Federation, and approaches to their exercising. Set forth are the focus areas for the enhancement of the State Collections of pathogenic microorganisms.
Keywords:
collections of pathogenic microorganisms, strains of microorganisms, storage technologies, taxonomy, molecular biology, passportization (classification) of strains, microorganisms' directory
Штаммы патогенных микроорганизмов играют важную роль в целом ряде мероприятий, направленных на обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения. Изучение их свойств необходимо при мониторинге территорий в случае при-родно-очаговых инфекций и расследовании путей завоза и распространения возбудителя в не типичном для него регионе. Важнейшим направлением также является своевременная разработка диагностических и профилактических препаратов против возбудителей опасных инфекционных болезней. Созданию таких препаратов предшествует детальное изучение свойств патогенов, циркулирующих на интересующей исследователя территории в определенный промежуток времени, необходимое для понимания направлений по конструированию тест-систем, вакцин, различных диагностикумов и т.д. Кроме того, от наличия жизнеспособных образцов патогенных штаммов в большинстве своем зависят этапы создания таких препаратов, в основе которых могут использоваться различные компоненты, получаемые из клеток микроорганизмов. Коллекции патогенных штаммов необходимы при проведении испытаний сконструированных тест-систем как в качестве контроля, для оценки специфичности и чувствительности препарата, так и в виде гетерологичных аналогов. Сохранность штаммов патогенных микроорганизмов осуществляется комплексом мероприятий по обеспечению коллекционной деятельности. В Российской Федерации эта функция возложена на Государственные коллекции патогенных микроорганизмов.
В настоящем обзоре отражены этапы создания коллекций патогенных микроорганизмов, нормативно-правовая база, регулирующая их деятельность на отечественном и международном уровнях, а также основные задачи, стоящие перед коллекциями в современный период, подходы к их решению и перспективы развития.
История коллекционной деятельности
Формирование коллекций микроорганизмов является важнейшим этапом в развитии микробиологии. Первая «живая» коллекция культур была создана в Праге Франтишеком Кралом в 1890 г. на медицинском факультете Института гигиены. Она содержала несколько сотен культур и препаратов, фиксированных на предметных стеклах, впоследствии их большая часть была вывезена в США и включена в Американскую коллекцию типовых культур [1]. Наиболее старыми из ныне существующих коллекций микроорганизмов являются две микологические коллекции. Одна из них была основана в Бельгии в 1894 г. - Коллекция грибов при Левенском католическом университете [Mycotheque de L'Universite'e CathoLique de Louvain (MUCL), Louvain-La-Neuve, Belgium]. Несколькими годами позднее, в Нидерландах в 1906 г. было основано Центральное бюро микологических коллекций [Collection of the CentraaLbureau voor SchimmeLcuLtures (CBS), Utrecht, Netherlands]. В начале XX в. отдельными исследователями или научными организациями в странах Европы был создан целый ряд коллекций микроорганизмов, однако все они,
а также коллекция, созданная в Японии в 1884 г., на сегодняшний день утрачены [2]. В 1920 г. в Великобритании была основана Национальная коллекция типовых культур ^СТС), в состав которой вошли более 5000 бактериальных штаммов. Созданная в США пятью годами позже Американская коллекция типовых культур (АТСС) в настоящее время считается крупнейшим в мире биоресурсным центром по хранению и изучению микроорганизмов. Коллекция располагает 18 000 бактериальных штаммов, принадлежащих к 750 родам. В АТСС хранится более 3600 типовых штаммов, закладывающих основу для изучения систематики бактерий. Формирование микробных коллекций в России началось в 1930-е гг., а пик их организации приходится на 1950-1960-е гг., когда были образованы в общей сложности 36 коллекций [3]. Одними из первых коллекций патогенных микроорганизмов бактериальной природы с официально закрепленным статусом (приказ Минздрава СССР № 205/а от 30.04.1955) являются коллекции патогенных микроорганизмов 1-11 групп патогенности в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» и Ш-1У групп патогенности - при Государственном институте стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича. Согласно этому приказу официальный статус коллекций получили музеи живых культур Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея, Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, Иркутского противочумного института и ряда других учреждений. В настоящее время в Российской Федерации наиболее значимые коллекции микроорганизмов 1-11 групп патогенности находятся в подведомственных учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Российской академии наук, Министерства обороны Российской Федерации, Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.
Нормативно-правовая база, регламентирующая коллекционную деятельность
Сформированная к настоящему времени нормативно-правовая база, регламентирующая деятельность коллекций патогенных микроорганизмов, включает законодательные акты национального и международного значения.
На международном уровне коллекционная деятельность в отношении микроорганизмов регулируется Будапештским договором от 28.04.1977 о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры [Российская Федерация (правопреемник СССР) - участница договора с 22.04.1981], в котором заложены основные принципы депонирования штаммов микроорганизмов в авторизи-рованных коллекциях для целей патентной процедуры, а также Конвенцией о биологическом разнообразии от 05.06.1992 (ратифицирована Российской Федерацией 17.02.1995), направленной на сохранение биологического разнообразия, устойчивое использование его компонентов и совместное получение на справедливой и равной основе выгод, связанных с использованием генетических ресурсов, в том числе путем предоставления необходимого доступа к генетическим ре-
сурсам и надлежащей передачи соответствующих технологий с учетом всех прав на такие ресурсы и технологии, а также путем должного финансирования.
Существующая в Российской Федерации нормативно-правовая база направлена на реализацию общих положений, связанных с правом на осуществление коллекционной деятельности, обеспечение биологической безопасности работ с микроорганизмами 1-1У групп патогенности, обращение штаммов патогенных микроорганизмов, их хранение и передачу на территории РФ и за ее пределы, а также защиту интеллектуальной собственности в области использования коллекционных штаммов.
Реализация этих аспектов коллекционной деятельности обеспечивается следующими нормативными актами:
1. Федеральными законами «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.1999 № 52-ФЗ; «О лицензировании отдельных видов деятельности» от 04.05.2011 № 99-ФЗ; «Об экспортном контроле» от 19.07.1999 № 183-Ф3; «О введении в действие части четвертой Гражданского кодекса Российской Федерации» (раздел VII. Права на результаты интеллектуальной деятельности и средства индивидуализации) от 18.12.2006 № 231-Ф3.
2. Указом Президента РФ «Об утверждении списка микроорганизмов, токсинов, оборудования и технологий, подлежащих экспортному контролю» от 20.08.2007 № 1083.
3. Постановлениями Правительства РФ «О мерах по сохранению и рациональному использованию коллекций микроорганизмов, культивируемых клеток высших растений, перевиваемых соматических клеток позвоночных» от 24.06.1996 № 725-47; «О разграничении полномочий федеральных органов исполнительной власти в области обеспечения биологической и химической безопасности Российской Федерации» от 16.05.2005 № 303 (с изменениями и дополнениями); «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, когда указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III и IV степеней потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах» от 16.04. 2012 № 317; «О внесении изменений в постановление Правительства Российской Федерации от 29.08.2001 № 634 "Об утверждении Положения об осуществлении контроля за внешнеэкономической деятельностью в отношении возбудителей заболеваний (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токсинов, оборудования и технологий"» от 11.09.2007 № 580.
4. Приказами Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» от 17.03.2008 № 88, «Об организации деятельности государственных коллекций патогенных микроорганизмов, функционирующих на базе научно-исследовательских учреждений Роспотребнад-зора» от 01.08.2012 № 804.
5. Санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами !-П групп патогенности (опасности)» (СП 1.3.3118-13); «Безопасность работы с микроорганизмами Ш-^ групп патогенности и гельминтами»
(СП 1.3.2518-09); Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов групп патогенности» (СП 1.2.036-95).
Таким образом, в Российской Федерации существует обширная нормативно-правовая база, регламентирующая коллекционную деятельность, связанную с использованием патогенных микроорганизмов, тем не менее необходимо ее дальнейшее совершенствование, которое должно быть направлено на формирование единых подходов к ранжированию коллекций микроорганизмов, созданию единых алгоритмов их функционирования и направлений деятельности, принятию мер по государственной поддержке ведущих коллекционных центров микроорганизмов.
Основные задачи коллекционных центров
По своей структуре, функциям, объемам выполняемых задач все действующие на территории РФ коллекции патогенных микроорганизмов можно разделить на 3 типа: государственные, учрежденческие и рабочие.
Наибольшее значение имеют государственные коллекции, функции которых расширяются от простых хранилищ биоматериала до современных центров, обеспечивающих хранение, комплексное изучение с помощью современных методов и использование коллекционных штаммов. Создание таких коллекций регламентировано приказами министерств и ведомств. Их основные функции:
■ формирование, пополнение, поддержание и учет национального централизованного коллекционного фонда патогенных микроорганизмов;
■ обеспечение научных, практических учреждений и производств качественными образцами типовых, неотиповых и референтных штаммов микроорганизмов;
■ формирование панелей типовых и референтных штаммов микроорганизмов для научно-исследовательских работ, производственных работ микробиологического профиля и учебного процесса;
■ осуществление деятельности в качестве национального органа по депонированию микроорганизмов и защита интеллектуальной собственности;
■ хранение коллекционного фонда в лиофилизирован-ном состоянии, в условиях низкотемпературного замораживания и криоконсервации;
■ совершенствование методов хранения патогенных микроорганизмов;
■ ведение баз данных и каталога коллекционных штаммов;
■ консультативная и научно-методическая помощь научным и практическим учреждениям по вопросам систематики и номенклатуры, оказание услуг по поиску и подбору штаммов с заданными характеристиками.
Кроме того, государственные коллекции патогенных микроорганизмов решают задачи фундаментального характера, направленные:
■ на номенклатурную ревизию штаммов коллекции на основе традиционных и современных молекулярно-генетических методов исследования;
■ проведение таксономических исследований, направленных на выявление и комплексный анализ новых видов и новых патогенных штаммов, сформировавшихся внутри вида;
■ уточнение таксономического положения культур с атипичным фено- и генотипом;
■ микробиологическую, молекулярно-генетическую и эпидемиологическую паспортизацию природных и генетически измененных штаммов микроорганизмов.
В рамках деятельности научно-исследовательских организаций, занимающихся изучением патогенных микроорганизмов, нередко создаются учрежденческие коллекции. Они представляют собой обособленные подразделения учреждений, имеющих лицензию на работу с патогенными микроорганизмами. Создание учрежденческих коллекций регламентировано приказами руководителя организации.
Основные функции учрежденческих коллекций:
■ формирование, пополнение, поддержание и учет коллекционного фонда патогенных микроорганизмов тех нозологий, работа с которыми осуществляется в данной организации;
■ хранение коллекционного фонда в лиофилизирован-ном состоянии, в условиях низкотемпературного замораживания и криоконсервации;
■ совершенствование методов хранения патогенных микроорганизмов;
■ обеспечение подразделений учреждения качественными образцами штаммов микроорганизмов;
■ ведение баз данных и каталога коллекционных штаммов.
В случае применения ограниченного числа штаммов патогенных микроорганизмов в научно-практической деятельности организации создаются их рабочие коллекции. Под рабочими коллекциями следует понимать наборы штаммов, находящихся на ответственном хранении у работающих с ними сотрудников в подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на право осуществления деятельности с патогенными микроорганизмами. Формирование рабочих коллекций осуществляется с разрешения руководителей учреждения и подразделения.
Основные функции рабочих коллекций:
■ проведение научно-исследовательских, диагностических, производственных и иных видов деятельности, связанных с использованием штаммов патогенных микроорганизмов;
■ поддержание в жизнеспособном состоянии штаммов рабочей коллекции.
Формирование коллекционного фонда и методы хранения штаммов
Несмотря на возросший объем выполняемых задач, важнейшими целями коллекций патогенных микроорганизмов являются формирование и поддержание фонда культур в условиях, исключающих их утрату, морфологические изменения, изменение или утрату биохимических, серологических и токсических свойств, а также изменение чувствительности к антибиотикам [4, 5].
Основу коллекционного фонда при его формировании обычно составляет набор типовых, неотиповых и референтных штаммов микроорганизмов той видовой принадлежности, в области деятельности с которыми авторизована коллекция.
К типовым штаммам Бактериологический кодекс относит такой штамм, на котором автор, впервые описавший наименованный им организм, основал свое описание последнего, который он или последующий автор определенно обозначил как тип. При этом жизнеспособная культура типового штамма должна быть помещена не менее чем в две специализированные коллекции, располагающиеся в разных странах с возможностью свободного получения субкультуры.
Неотиповым считают штамм, принимающийся вместо типового, в случае утраты последнего. Авторы, предлагающие штамм в качестве неотипового, должны предоставить детальную информацию о его свойствах, наличии жизнеспособных образцов в авторизованных коллекциях и доказательства потери типового штамма, а также того, что предлагаемый неотип хорошо согласуется с описанием первоначального штамма.
К референтным культурам принято относить штаммы, не являющиеся ни типовыми, ни неотиповыми, но использующимися в качестве штаммов сравнения в таксономических, серологических, химических или иных видов анализа. Такой микроорганизм должен быть определен, по меньшей мере, до рода и вида, включен в каталог и описан в соответствии с его характеристиками.
Кроме того, исходя из задач, выполняемых каждым отдельно взятым коллекционным центром, структура его фонда может включать штаммы, дифференцирующиеся по целевому назначению и происхождению:
■ природные штаммы возбудителей особо опасных инфекций, выделенные от больных людей, носителей, животных и из объектов внешней среды, характеризующие эпидемические и эпизоотические проявления, межэпидемические периоды, позволяющие получить представление о циркуляции возбудителей на определенных территориях в установленный отрезок времени;
■ депонированные по процедурам авторского и патентного депонирования природные и генетически измененные штаммы микроорганизмов I-IV групп патогенности;
■ производственные штаммы микроорганизмов I-II групп патогенности, используемые в производстве диагностических и профилактических препаратов;
■ эталонные тест-штаммы микроорганизмов I-IV групп патогенности, используемые при проверке качества питательных сред в медицинской практике;
■ вакцинные штаммы возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза;
■ учебные штаммы - штаммы, использующиеся в учебном процессе, штаммы-имитаторы.
Хранение большого разнообразия штаммов, включаемых в коллекционный фонд, накладывает на коллекции обязательства поддержания этих культур в жизнеспособном
неизменном состоянии, содержания их в тех же условиях, в которых они были изначально выделены в виде чистой культуры.
Используемые в небольших коллекциях традиционные подходы поддержания бактериальных культур методом постоянного пересева способствуют накоплению генетических мутаций и, как следствие, изменению свойств бактериальной клетки. Кроме того, с увеличением коллекционного фонда, вышеуказанный способ поддержания культур становится крайне трудоемким. В этой связи с целью предотвращения изменений в геноме микроорганизмов разработан ряд методов стабилизации свойств и длительного хранения коллекционных микроорганизмов: лиофилизация, а также хранение при низких температурах (низкотемпературная консервация и криоконсервация) в диапазоне от -60 до -196 °С.
Лиофилизация - процесс высушивания клеток микроорганизмов под вакуумом при низких температурах, в пределах -20...-50 °С. При хранении лиофилизированных культур без доступа кислорода, влаги и света при температуре от 4 °С они способны сохранять свою жизнеспособность в течение 30 лет и более. Кроме того, консервация этим способом обеспечивает большую стабильность для целого ряда микроорганизмов, особенно в сравнении с иными способами высушивания или методом периодических пересевов. Также следует отметить, что с учетом особенностей процедуры лиофилизации в отличие от многих других методов консервации можно получить и хранить большое число емкостей с каждой культурой, что увеличивает сохранность коллекционного фонда и позволяет с минимальными затратами транспортировать штаммы микроорганизмов на значительные расстояния [6].
Еще одним вариантом долгосрочного хранения клеток микроорганизмов в жизнеспособном состоянии является их содержание при пониженных температурах в присутствии криозащитной среды в холодильных установках. Большинство бактерий способны сохраняться при температурах ниже -60 °С, поддерживая при этом высокую концентрацию живых клеток в течение длительного периода времени. Этот подход наиболее простой в исполнении по сравнению с остальными методами долгосрочной консервации микроорганизмов. Реализация процесса низкотемпературного замораживания характеризуется минимальными объемами подготовительных работ, быстрыми исполнениями этапов консервации и извлечения хранимого материала. Замороженные образцы мало подвержены каким-либо генетическим изменениям и стабильно сохраняют свои первоначальные свойства. Кроме того, некоторые культуры отличаются более высокими показателями жизнеспособности их клеток при данном способе консервации, чем при высушивании или лиофили-зации. Наибольшая уязвимость метода низкотемпературной консервации заключается в необходимости обеспечения безотказной работы холодильных установок, а также в сложности транспортировки замороженного материала [7].
Один из вариантов низкотемпературной консервации является криоконсервация - метод, отличающийся хранением материала в жидком азоте. Этот подход предназначен для длительного сохранения биологического материала. При соблюдении температурных режимов, не допускающих раз-
мораживания объектов, титр живых клеток практически не изменяется, что позволяет хранить культуры микроорганизмов практически бесконечно. Наиболее надежный способ поддержания постоянной температуры хранящихся образцов - это непосредственное погружение их в жидкий азот, что гарантирует режим хранения при -196 °С. Однако данная процедура сопряжена с риском контаминации контейнеров и хранилища патогенными биологическими агентами из-за возможного попадания жидкого азота внутрь криопробирок [8-12]. Вследствие этого хранить вирулентные микроорганизмы рекомендуется в парах жидкого азота, не допуская соприкосновение контейнеров с жидкой фазой газа. При этом следует отметить отсутствие универсальных подходов к криоконсервации различных видов микроорганизмов, требующих использования различных криопротекторов и скорости замораживания клеточных суспензий. Вместе с тем в настоящее время разработаны протоколы криоконсервации для целого ряда видов микроорганизмов [23]. Несмотря на значительные преимущества описанного подхода, данный метод длительного хранения материала имеет ограниченное применение, поскольку для поддержания коллекционных фондов крупных коллекций потребуется организация автоматизированных криогенных хранилищ и выделение отдельного помещения для их размещения, также следует отметить более дорогой и трудоемкий процесс обмена образцами между коллекциями. Тем не менее криоконсервация удобна при поддержании микроорганизмов, плохо переносящих стрессовые условия других методов, и в настоящее время для ее реализации доступен широкий выбор криооборудования.
Таксономические исследования
Важнейшими задачами коллекционной деятельности являются определение таксономической принадлежности штаммов и установление их аутентичности заявленным паспортным данным. Изначально исследования в этом направлении строились на основе культурально-морфологических, фенотипических и серологических методов. Дальнейшие шаги в этом направлении были сделаны с развитием методик, направленных на изучение генома коллекционных штаммов. Широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), с помощью которой проводится детекция основных генетических детерминант вирулентности, патогенности, а также различных видоспецифичных маркеров [14].
К настоящему времени разработано большое число мо-лекулярно-генетических методов, направленных на типи-рование штаммов микроорганизмов и определение их таксономической принадлежности. Поскольку универсального подхода, безошибочно определявшего систематическое положение исследуемых культур, до сих пор не создано, необходимо использовать алгоритм их идентификации, основанный на 2-3 подходах, дополняющих друг друга. Так, устоявшимися подходами для типирования возбудителей чумы, холеры, туляремии, сибирской язвы, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза являются мультилокусное секвенирование (MLST - от англ. MuLti Locus Sequence Typing), риботипирова-ние, мультилокуснный VNTR анализ (MLVA - от англ. Multiple Loci VNTR Analysis) [15-24]. Для микроорганизмов, изучае-
мых с помощью MLST и MLVA, созданы базы данных http:// www.mLst.net/ и http://minisateLLites.u-psud.fr/MLVAnet. Одним из методов создания геномных портретов возбудителя холеры является риботипирование. Этот подход, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, обладает хорошей воспроизводимостью, он зарекомендовал себя как способ дифференциации штаммов V. cholerae по их происхождению на различных эндемичных по холере территориях [25, 26]. Одним из примеров практического применения молекулярного типирования является расследование источника случаев почтового терроризма в США в 2001 г. Изучение молекулярно-генетических свойств (в частности метод MLVA) используемого для этих целей штамма и сравнение полученных характеристик с соответствующими характеристиками набора коллекционных штаммов возбудителя сибирской язвы позволили установить название штамма, источник и автора рассылки сибиреязвенных спор [27].
Применение различных систем молекулярного типирования и создание на их базе алгоритмов по установлению аутентичности и систематического положения коллекционных штаммов прочно вошли в систему функционирования зарубежных коллекций. В коллекции ATCC с этой целью применяется комплекс методов, включающих как классический микробиологический скрининг, так и использование автоматизированных бактериологических анализаторов, масс-спектрометрию, а также секвенирование и рибопринтинг. В Британской NCTC в основу идентификационного алгоритма положены изоферментный анализ, ДНК-фингерпринтинг и микросателлитное генотипирование, основанное на ПЦР. Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) для установления аутентичности бактериальных штаммов использует секвенирование 16S рДНК, рибопринтинг, VNTR-анализ и ДНК-ДНК-гибридизацию. В Российской Федерации современные подходы к установлению систематического положения штаммов и их аутентичности реализуются в ряде коллекций немедицинского профиля: в частности во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) и во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). В последнее время такие подходы начинают применяться и в коллекциях, поддерживающих штаммы патогенных микроорганизмов [28].
Вместе с тем разработка единых алгоритмов определения таксономического положения и установления аутентичности коллекционных штаммов в настоящее время остается одним из приоритетных направлений деятельности Государственных коллекций патогенных микроорганизмов. В этой связи в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности (2015-2017 гг.)» запланированы и реализуются НИОКР, направленные на решение этих проблем.
Каталогизация коллекционных штаммов
К не менее значимым аспектам коллекционной деятельности относится каталогизация поддерживаемых штаммов. Структурно такие каталоги коллекционных штаммов патогенных микроорганизмов могут подразделяться на простые перечни, отражающие краткие сведения о микроорганизме,
его происхождении, номера в различных коллекциях, условия культивирования и длительного хранения, а также банки данных аккумулирующие любые данные научных исследований, связанные с поддерживаемыми в коллекции культурами. Что касается каталогов первого типа, они создаются и пополняются по общепринятому принципу в обязательном порядке в любых крупных коллекциях. Из зарубежных коллекций следует отметить каталоги Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) и NCTC, расположенные в сети Интернет и находящиеся в открытом доступе [29, 30].
В Российской Федерации такие каталоги созданы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, причем часть из них представлена в формате XML (от англ. ExtensibLe Markup Language). Подобные работы также велись в рамках государственной программы «Биоразнообразие» (1999-2001), результатом выполнения которой стало создание объединенного электронного каталога Российских коллекций немедицинского профиля. В его состав были включены сведения о штаммах, поддерживаемых во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН), а также еще 17 российских коллекций, в том числе и в Государственной коллекции патогенных бактерий Рос-НИПЧИ «Микроб». Окончательный вариант электронной версии Объединенного каталога (ConsoLidated CataLogue of MicrobiaL CuLtures HeLd in Russian Non-medicaL CoLLections. CD version, reLease 1.0 (FaLL 2002) был размещен в Интернете на веб-сайте ВКМ в формате электронной книги MS eReader в 5 томах на английском языке [31].
Безусловно, подобная форма каталогов удобна для ознакомления со структурой коллекционного фонда и подбора штаммов по их номеру, однако она не позволяет систематизировать микроорганизмы по их характеристикам. На актуальность этой проблемы в первую очередь указывает минимальный объем информации, представленный в литературе. Известно, что подобные разработки велись в Институте микробиологии РАН. Созданная база данных UNIQEM (UNIQue and ExtremophiLic Microorganisms) позволяла накапливать и поддерживать списочную информацию о широком спектре микроорганизмов - каталожная база данных, а также осуществлять сбор, обработку и публикацию самой разнообразной информации по этим микроорганизмам и их характеристикам - база данных свойств. Созданный программный комплекс обладал возможностью хранения, обработки и опубликования информации о 1000 и более штаммов, характеризующихся не более чем по 1000 групп монофункциональных свойств, хранения связанной графической и текстовой информации, включающей состав сред, сек-венсы, текстовые описания штаммов [32].
Деятельность в этом направлении проводилась и в коллекциях патогенных микроорганизмов. В рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности (2009-2014 гг.)» в процессе реализации 6 НИОКР проведено совершенствование научно-методическое обеспечения паспортизации штаммов государственных и музейных коллекций патогенных бактерий и вирусов. В ходе выполнения этой работы
в трех крупнейших государственных коллекциях патогенных микроорганизмов, функционирующих на базе учреждений Роспотребнадзора ФБУН ГНЦ ПМБ, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», разработаны структуры унифицированных электронных каталогов микроорганизмов I-II групп патогенности и их геномных портретов, определены методы генотипирования коллекционных штаммов, проведено полногеномное секвенирование их геномов. В частности в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» создан электронный унифицированный каталог микроорганизмов I-II группы пато-генности, включающий сведения о 1026 штаммах бактерий I-II группы патогенности. Кроме того, подготовлен унифицированный электронный каталог геномных портретов микроорганизмов I-II группы патогенности, пополненный сведениями о молекулярно-генетической организации 120 штаммов возбудителей чумы и холеры. Проведено полногеномное секвенирование 5 штаммов Y. pestis и V. cholera, а также подготовлены проекты нормативно-методических документов по проведению генотипирования штаммов патогенных микроорганизмов, правил их каталогизации и долгосрочного хранения.
Деятельность в рамках национальных центров верификации диагностической деятельности
Приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» от 17.03.2008 № 88 регламентировано создание Национальных центров верификации диагностической деятельности и Национальных центров, осуществляющих функции государственных коллекций, на базе трех учреждений Роспотребнадзора: ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», ФБУН «ГНЦ ПМБ», ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с возложением на них ряда функций:
■ верификация результатов диагностики опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы, проведенных центрами индикации и диагностики опасных инфекционных болезней Роспо-требнадзора;
■ идентификация возбудителей опасных инфекционных болезней неустановленной этиологии с тяжелым клиническим течением (включая летальный исход), представленных центрами индикации и диагностики опасных инфекционных болезней Роспотребнадзора;
■ проведение молекулярно-эпидемиологических исследований и изучение вирусологических, бактериологических, молекулярно-биологических, серологических, иммунохимических свойств особо опасных патогенов;
■ хранение коллекционных штаммов и их депонирования.
Депонирование коллекционных штаммов
Уникальная функция государственных коллекций - обеспечение процедуры депонирования штаммов микроорга-
низмов, под которым обычно понимают процесс передачи штаммов в коллекцию для регистрации, хранения и выдачи их образцов. Цель этой процедуры - сохранение в признанных коллекциях (депозитариях) наиболее ценных штаммов, выделенных из природных источников или созданных путем генно-инженерных манипуляций, для обеспечения их доступности научному сообществу при соблюдении прав депозиторов. Выделяют 3 формы депонирования:
■ депонирование для открытого доступа или хранение (public deposit), отличающееся общедоступностью информации о поступившем штамме и возможностью его выдачи без соглашения депозитора;
■ сохранное депонирование или гарантированное хранение (safe deposit), направленное на сохранность штамма в коллекции с ограничением доступа к нему третьих лиц;
■ патентное депонирование (patent deposit), выполняемое с целью оформления патента на штамм микроорганизма, при этом различают международное и национальное патентное депонирование.
Депонирование для целей патентной процедуры считается осуществленным, если штамм, линия клеток или консорциум помещены в международный орган по депонированию, предусмотренный Будапештским договором о международном признании депонирования для целей патентной процедуры [33] или в уполномоченную на их депонирование российскую коллекцию, гарантирующую поддержание жизнеспособности объекта в течение по меньшей мере срока действия патента и удовлетворяющую другим установленным требованиям к коллекциям, осуществляющих депонирование для целей патентной процедуры [34]. Согласно последним данным, опубликованным Федеральным институтом промышленной собственности (ФИПС), в Российской Федерации к коллекциям, уполномоченным осуществлять депонирование патогенных для человека микроорганизмов, относятся Государственная коллекции патогенных микроорганизмов при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и ФБУН ГНЦ ПМБ [35].
Заключение
Таким образом, коллекционная деятельность, связанная с использованием штаммов патогенных микроорганизмов, -это направление научной деятельности по обеспечению биологической безопасности и санитарно-эпидемиологического благополучия населения РФ, которое успешно реализуется и гармонично развивается. Вместе с этим некоторые аспекты этой важной функции требуют дальнейшего совершенствования. В первую очередь это связано с разработкой и внедрением унифицированного подхода к принципам функционирования и реализации основных задач государственных коллекций патогенных микроорганизмов, закрепленным единым положением о коллекционной деятельности в области использования возбудителей I—II группы патогенности. Также необходимо обновить нормативно-методическую базу, регламентирующую правила депонирования штаммов патогенных микроорганизмов, выработав общий для всех коллекций документ. Не-
маловажной задачей, стоящей перед государственными коллекциями, является создание единой унифицированной панели референтных штаммов патогенных микроорганизмов, необходимой для обеспечения научно-исследовательской, диагностической, производственной и учебной деятельности. Кроме того, необходимо непрерывно ко-
ординировать процессы совершенствования методов молекулярного типирования возбудителей особо опасных инфекций, их консервации, хранения и информационного обеспечения, с учетом появления новых подходов, методик и технологий, поддерживая их на современном мировом уровне.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Онищенко Геннадий Григорьевич - академик РАН, член Президиума РАН, доктор медицинских наук, профессор, Москва Кутырев Владимир Викторович - доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, директор ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Роспотребнадзора, Саратов Е-таН: rusrapi@microbe.ru
Осин Александр Владимирович - кандидат биологических наук, заведующий отделом «Государственная коллекция патогенных организмов» ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"» Роспотребнадзора, Саратов
Е-таН: rusrapi@microbe.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Porter J.R. The role of culture collections in the era molecular biology. ATCC 50th Anniversary Symposium, American Society for Microbiology. Washington, DC, 1976. P. 62-72.
2. Tsunematsu Y. Japanese Federation of Culture Collections. Proc. Int. Conference on Culture Collections. 1970. P. 79-83.
3. Озерская С.М., Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е., Запрометова К.М. и др. Состояние коллекций микроорганизмов в России // Вестн. биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2006. Т. 2, № 3. С. 51-61.
4. Маркин В.А. Коллекции патогенных вирусов в решении общебиологических проблем // Журн. микробиол. 2007. № 6. С. 84-93.
5. SeeLiger H.P.R. The Medical Culture Collection // Impact of Science on Society. 1990. VoL. 158. P. 167-174.
6. Ashwood-Smith M.J. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. Tunbridge, WeLLs: Pitman Medical, 1980. 323 p.
7. Gibson L. F., Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by uLtra-freeze // Lett. AppL. MicrobioL. 1986. VoL. 3. P. 127-129.
8. Fountain D., Ralston M., Higgins N., GorLin J.B. et aL. Liquid nitrogen freezers: a potentiaL source of microbiaL contamination of hematopoietic stem ceLL components // Transfusion. 1997. VoL. 37. P. 585-591.
9. Grout B.W.W., Morris G.J. Contaminated Liquid nitrogen vapour as a risk factor in pathogen transfer // TheriogenoLogy. 2009. VoL. 71. P. 1079-1082.
10. Hawkins A.E., Zuckerman M.A., Briggs M., Gibon R.J. et aL. Hepatitis B nucLeotide sequence anaLysis: Linking an outbreak of acute Hepatitis B to contamination of a cryopreservation tank // J. ViroL. Methods. 1996. VoL. 60. P. 81-88.
11. Schafer T.W., Everett J., SiLver G.H., Came P.E. Biohazard: Virus contaminated Liquid nitrogen // Science. 1976. VoL. 191. P. 24-26.
12. Tedder R.S., Zuckerman M.A., GoLdstone A.H., Hawkins A.E. et aL. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank // Lancet. 1995. VoL. 346. P. 137-140.
13. HubaLek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms // CryobioLogy. 2003. VoL. 46. P. 205-229.
14. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М. : Медицина, 2009. 470 с.
15. Achtman M., MoreLLi G., Zhu P., Wirth T. et aL MicroevoLution and history of the plague baciLLus, Yersinia pestis // Proc. NatL Acad. Sci. USA. 2004. VoL. 101. P. 17837-17842.
16. FarLow J., Smith K.L., Wong J., Abrams M. et aL. FranciseLLa tuLarensis strain typing using muLtipLe-Locus, variabLe-number tandem repeat anaLysis // J. CLin. MicrobioL. 2001. VoL. 39. P. 3186-3192.
17. Ghosh R., Nair G.B., Tang L., Morris J.G. et aL. EpidemioLogicaL study of Vibrio choLerae using variabLe number of tandem repeats // FEMS MicrobioL. Lett. 2008. VoL. 288. P. 196-201.
18. HeLgason E., Tourasse N.J., MeisaL R., Caugant D.A. et aL. MuLtiLocus sequence typing scheme for bacteria of the BaciLLus cereus group // AppL. Environ. MicrobioL. 2004. VoL. 70. P. 191-201.
19. Keim P., Price L.B., KLevytska A.M., Smith K.L. et aL. MuLtipLe-Locus variabLe-number tandem repeat anaLysis reveaLs genetic reLationships within BaciLLus anthracis // J. BacterioL. 2000. VoL. 182. P. 2928-2936.
20. Kingston J.J., Tuteja U., KapiL M., MuraLi H.S. et aL. Genotyping of Indian Yersinia pestis strains by MLVA and repetitive DNA sequence based PCRs // Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. VoL. 96. P. 303-312.
21. Le FLeche P., Jacques I., Grayon M., AL Dahouk S. et aL. EvaLuation and seLection of tandem repeat Loci for a BruceLLa MLVA typing assay // BMC MicrobioL. 2006. VoL. 6. P. 1-14.
22. Mohapatra S.S., Ramachandran D., Mantri C.K., CoLweLL R.R. et aL. Determination of reLationships among non-toxigenic Vibrio choLerae 01 biotype EL Tor strains from housekeeping gene sequences and ribotype patterns // Res. MicrobioL. 2009. VoL. 160. P. 57-62.
23. SchoLz H.C., HubaLek Z., SedLacek I., Vergnaud G. et aL. BruceLLa microti sp. nov., isoLated from the common voLe Microtus arvaLis // Int. J. Syst. EvoL. MicrobioL. 2008. VoL. 58. P. 375-382.
24. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrom M. et aL. EvoLution of subspecies of FranciseLLa tuLarensis // J. BacterioL. 2005. VoL. 187. P. 3903-3908.
25. Popovic T., Bopp C., OLsvik 0., Wachsmuth K. EpidemioLogic appLication of a standardized ribotype scheme for Vibrio choLerae 01 // J. CLin. MicrobioL. 1993. VoL. 31. P. 2474-2482.
26. Vibrio choLerae: Genomics and MoLecuLar BioLogy / eds S.M. Faruque, G.B. Nair NorfoLk, UK : Caster Academic Press, 2008. 220 p.
27. Traeger M.S., Wiersma S.T., Rosenstein N.E., Malecki J.M. et al. First case of bioterrorism-related inhalational anthrax in the United States, Palm Beach County, Florida, 2001 // Emerg. Infect. Dis. 2002. Vol. 8. P. 1029-1034.
28. Червякова Н.С., Портенко С.А., Осин А.В. Номенклатурная ревизия штаммов рода Bacillus, хранящихся в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» // Материалы юбил. Междунар. науч-практ. конф. Уральской противочумной станции 1914-2014 гг. Уральск, 2014. С. 197-199.
29. Каталог бактериальных штаммов Национальной коллекции типовых культур (NCTC). URL: http://www.phe-cu1turecoLLections.org.uk/ products/bacteria/search.jsp (дата обращения: 10.11.2015)
30. Каталог микроорганизмов Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ). URL: https://www.dsmz. de/catalogues/catalogue-microorganisms.html (дата обращения: 10.11.2015)
REFERENCES
1. Porter J.R. The role of culture collections in the era molecular biology. In: ATCC 50th Anniversary Symposium, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1976: 62-72.
2. Tsunematsu Y. Japanese Federation of Culture Collections. In: Proc Int Conference on Culture Collections. 1970: 79-83.
3. Ozerskaya S.M., Kochkina G.A., Ivanushkina N.E., Zaprometova K.M. et al. State of Collection of Microorganisms in Russia. Vestnik biotekhnologii i fiziko-khimicheskoy biologii imeni Yu.A. Ovchinnikova [Bulletin of biotechnology and physical and chemical biology named after Yu.A. Ovchinnikov]. 2006; Vol. 2 (3): 51-61. (in Russian)
4. Markin V.A. Collections of pathogenic viruses in solution of biological problems. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2007; 6: 84-93. (in Russian)
1. Seeliger H. P.R. The Medical Culture Collection. Impact of science on society. 1990; 158: 167-74.
2. Ashwood-Smith M.J. Low temperature preservation in medicine and biology. Tunbridge Wells: Pitman Medical; 1980. 323 p.
3. Gibson L.F. u Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by ultra-freeze. Letters Applied Microbiol. 1986; 3: 127-9.
4. Fountain D., Ralston M., Higgins N., Gorlin J.B. et al. Liquid nitrogen freezers: a potential source of microbial contamination of hematopoietic stem cell components. Transfusion.1997; 37: 585-91.
5. Grout B.W.W., Morris G.J. Contaminated liquid nitrogen vapour as a risk factor in pathogen transfer Theriogenology. 2009; 71: 1079-82.
6. Hawkins A.E., Zuckerman M.A., Briggs M., Gilson R.J. et al. Hepatitis B nucleotide sequence analysis: Linking an outbreak of acute Hepatitis B to contamination of a cryopreservation tank. J Virol Methods. 1996; 60: 81-8.
7. Schafer T.W., Everett J., Silver G.H., Came P.E. Biohazard: Virus contaminated liquid nitrogen. Science. 1976; 191: 24-6.
8. Tedder R.S., Zuckerman M.A., Goldstone A.H., Hawkins A.E. et al. Hepatitis B transmission from contaminated cryopreservation tank. Lancet.1995; 346: 137-40.
9. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 2003; 46: 205-29.
10. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Laboratory diagnosis of dangerous infectious diseases. Moscow: Meditsina; 2009: 470 p. (in Russian)
31. Объединенный каталог Российских коллекций немедицинского профиля. URL: http://www.sevin.ru/collections/microcoll/consolidated. html (дата обращения: 10.11.2015).
32. Ахлынин Д.С., Гальченко В.Ф. Микробиологическая база данных UNIQEM: проблемы и перспективы // Микробиология. 2000. № 69. С. 574-580.
33. Будапештский договор о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Будапешт, 1977.
34. О правилах составления, подачи и рассмотрения заявки на выдачу патента на изобретение : приказ Российского агентства по патентам и товарным знакам № 82 от 06.06.2003 // Рос. газ. 08.10.2003. № 202. С. 8.
35. Уткина Е.А., Гаврилова Е.Б. Депонирование микроорганизмов для целей национальной патентной процедуры // Патенты и лицензии. 2011. № 2. С. 34-39.
11. Achtman M., Morelli G., Zhu P., Wirth T. et al. Microevolution and history of the plague bacillus, Yersinia pestis. PNAS. 2004; 101: 17837-42.
12. Farlow J., Smith K.L., Wong J., Abrams M. et al. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable-number tandem repeat analysis. J Clin Microbiol. 2001; 39: 3186-92.
13. Ghosh R., Nair G.B., Tang L., Morris J. G. et al. Epidemiological study of Vibrio cholerae using variable number of tandem repeats. FEMS Microbiol. Letters. 2008; 288: 196-01.
14. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto A. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70: 191-01.
15. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L. et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2000; 182: 2928-36.
16. Kingston J.J., Tuteja U., Kapil M., Murali H.S., Batra H.V. Genotyping of Indian Yersinia pestis strains by MLVA and repetitive DNA sequence based PCRs. Antonie van Leeuwenhoek. 2009; 96: 303-12.
17. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M., Al Dahouk S. et al. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay. BMC Microbiol. 2006; 6: 1-14.
18. Mohapatra S.S., Ramachandran D., Mantri C.K., Colwell R.R., Singh D.V. Determination of relationships among non-toxigenic Vibrio cholerae 01 biotype El Tor strains from housekeeping gene sequences and ribotype patterns. Res Microbiol. 2009; 160: 57-62.
19. Scholz H.C., Hubalek Z., Sedlacek I., Vergnaud G. et al. Brucella microti sp. nov., isolated from the common vole Microtus arvalis. Int J Syst Evol Microbiol. 2008; 58: 375-82.
20. Svensson K., Larsson P., Johansson D., Bystrom M. et al. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J Bacteriol. 2005; 187: 3903-8.
21. Popovic T., Bopp C., Olsvik 0., Wachsmuth K. Epidemiologic application of a standardized ribotype scheme for Vibrio cholerae O1. J C Microbiol. 1993; 31: 2474-82.
22. Vibrio cholerae: Genomics and Molecular Biology. Edited by: Faruque S.M., Nair G.B. Norfolk, UK: Caster Academic Press; 2008: 220 p.
23. Traeger M.S., Wiersma S.T., Rosenstein N.E., Malecki J.M. et al. First case of bioterrorism-related inhalational anthrax in the United States, Palm Beach County, Florida, 2001. Emerg Infect Dis. 2002; 8: 1029-34.
24. Chervyakova N.S., Portenko S.A., Osin A.V. Nomenclature audit strains of the genus Bacillus, stored in FKUZ RosNIPChI "Microbe". In:
MateriaLy yubiLeynoy Mezhdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferentsii UraL'skoy protivochumnoy stantsii 1914-2014 gg. [MateriaL of anniversary InternationaL scientific-practicaL conference of the UraL PLague ControL Station 1914-2014]. UraL'sk; 2014: 197 9. (in Russian)
29. CataLogue of strains of bacteria from the NationaL CoLLection of Type CuLtures (NCTC) http://www.phe-cuLturecoLLections.org.uk/ products/bacteria/search.jsp (appLication date: 10.11.2015) (in Russian)
30. CataLogue of microorganism from Deutsche SammLung von Mikroorganismen und ZeLLkuLturen (DSMZ). https://www.dsmz.de/cataLogues/ cataLogue-microorganisms.htmL (appLication date: 10.11.2015) (in Russian)
31. Combined cataLog of Russian non-medicaL coLLections. http:// www.sevin.ru/coLLections/microcoLL/consoLidated.htmL (appLication date: 10.11.2015) (in Russian)
32. Akhlynin D.S., Gal'chenko V.F. Microbiological database UNIQEM: Problems and Prospects. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2000; 69: 574-80. (in Russian)
33. Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. Budapesht; 1977. (in Russian)
34. On the rules of compilation, submission and consideration of application for invention patent: Order of the Russian Agency for Patents and Trademarks number 82 from 06.06.2003. Rossiyskaya gazeta [About the Newspaper]. 08.10.2003; 202: 8. (in Russian)
35. Utkina E.A., Gavrilova E.B. Deposit of microorganisms for purposes of national patent proceeding. Patenty i litsenzii. Intellektual'nye prava [Patents & Licenses. Intellectual Rights»]. 2011; 2: 34-9. (in Russian)
