CC BY
141
Химия растительного сырья. 2013. №3. С. 155-159.
DOI: 10.14258/jcprm.1303155
УДК 615.322:582.883.4
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРПЕНОИДНЫХ ФЕНОЛАЛЬДЕГИДОВ В ЛИСТЬЯХ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО
© Р.Ш. Хазиев , М.В. Васильева, A.C. Макарова, Л.Т. Мусина
Казанский государственный медицинский университет, ул. Бутлерова, 49, Казань, 420012 (Россия), e-mail: xaziev@inbox.ru
Разработан способ определения терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка определения не превышает ±2,41%. Показана связь между уровнем терпеноидных фенолальдегидов, определяемых разработанным методом, и антибактериальной активностью содержащих их извлечений.
Ключевые слова: эвкалипт прутовидный, Eucalyptus viminalis Labill., терпеноидные фенолальдегиды, стандартизация, антибактериальная активность.
Листья эвкалипта прутовидного, служащие источником ряда препаратов антимикробного и противовоспалительного действия - настойки, эфирного масла, «Хлорофиллипта», «Галенофиллипта», стандартизуются в настоящее время Государственной фармакопеей по содержанию эфирного масла [1, с. 257-258]. Вышедшие в последние годы нормативные документы различных производителей (ОАО «Красногорск-лексредства», ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга», ООО ПКФ «Фитофарм»), кроме этого показателя стандартизуют листья эвкалипта прутовидного и по содержанию терпеноидных фенолальдегидов [2-4]. При небольших различиях метод определения терпеноидных фенолальдегидов в этих нормативных документах принципиально один и тот же - фенолальдегиды экстрагируются 70 или 95% спиртом и полученный раствор фотометрируется при 278 нм. Однако, на наш взгляд, этот метод дает завышенные результаты, поскольку спиртовое извлечение не подвергается никакой очистке и будет содержать помимо фенолальдегидов, другие фенолы, находящиеся в листьях эвкалипта (флавоноиды, танины, фенолкарбоно-вые кислоты) и поглощающих свет при используемой длине волны.
Целью нашей работы - разработка метода количественного определения фенолальдегидов лишенного этого недостатка.
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовали листья эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill.) из семейства миртовых - Myrtaceae, заготовленные в сентябре 2011 г. в Абхазии.
Введение
Хазиев Рамилъ Шамилевич - кандидат биологических
наук, доцент кафедры фармакологии,
тел.: (843) 521-27-88, e-mail: xaziev@inbox.ru
Васильева Марина Вячеславовна - студентка,
тел.: (843) 521-27-88
Макарова Алёна Сергеевна - студентка,
тел.: (843) 521-27-88, e-mail: anela_90@mail.ru
Мусина Линара Табрисовна -профессор кафедры
микробиологии, доктор медицинских наук,
тел.: (843) 236-13-51, e-mail: musina@kgmu.kcn.ru
Запись УФ-спектров и определение оптических плотностей полученных растворов проводили на спектрофотометре LAMBDA 25 (Perkin Elmer, США) в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Для тонкослойной хроматографии использовали пластины «Сорбфил» («ПТСХ-АФ-В», производитель ЗАО «Сорбполимер»). Извлечения хромато-графировали в системе этилацетат - уксусная кисло-
* Автор, с которым следует вести переписку.
156
Р.Ш. Хазиев, М.В. Васильева, А.С. Макарова, Л.Т. Мусина
та - вода (5 : 1 : 1), детектирование зон абсорбции флавоноидов проводили в видимом и УФ-свете до и после обработки 3% спиртовым раствором алюминия хлорида, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот - до и после обработки хлоридом (III) железа.
Оценку антибактериальной активности проводили методом двукратных серийных разведений на мя-со-пептонном бульоне (МПБ) при рН 7,0 с тест-микробом Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р [5]. Однако метод серийных разведений в МПБ зачастую не позволяет визуально определить наличие или отсутствие роста из-за помутнения среды.
Чтобы устранить этот недостаток фармакопейной методики, нами был разработан метод, где антибактериальную активность определяли, делая пересев из каждой пробирки на чашки с мясо-пептонным агаром (МПА), которые затем инкубировали в термостате в течение 18-24 ч. Отмечали рост микроорганизмов. Разведение препарата, на котором отсутствовал рост тест-штамма, характеризовало антибактериальную активность препарата.
Результаты и обсуждение
Проведенное нами определение содержание терпеноидных фенолальдегидов в образцах листьев эвкалипта прутовидного методами, изложенными в нормативных документах различных производителей [2-4], дало результаты на уровне от 11 до 15% при норме 3% [3, 4] и 5% [2], что косвенно свидетельствовало о правомерности наших сомнений в точности данных методик. К тому же УФ-спектр полученного спиртового экстракта имел в измеряемом диапазоне скорее точку перегиба, нежели четко выраженный максимум, что также говорило о поглощении сопутствующих веществ (рис. 1).
Терпеноидные фенольдегиды (эуглобали, макрокарпали и сидероксилонали) являются липофиль-ными соединениями и, по мнению ряда авторов, лучше всего экстрагируются не этиловым спиртом, а пет-ролейным эфиром с небольшими добавками (до 20%) ацетона [6]. Поскольку сопутствующие вещества фенольной природы, искажающие результаты определения фенолальдегидов, о которых речь шла выше, имеют гидрофильную природу, мы использовали избирательную экстракцию фенолальдегидов гидрофобным растворителем - гексаном. ТСХ-анализ показал отсутствие вышеупомянутых примесей в гексановом извлечении. УФ-спектр гексанового экстракта имел отчетливый максимум при 278±3 нм, характерный для фенолальдегидов эвкалипта, который и был выбран в качестве аналитической длины волны (рис. 2).
Известно, что фенольные гидроксилы, находящие по соседству с карбонильной группой, могут образовывать комплексы с хлоридом алюминия, которые вызывают батохромный сдвиг максимумов поглощения в УФ-спектре. В частности, эта реакция широко используется в анализе флавоноидов [7]. Мы предположили, что фенолальдегиды эвкалипта могут образовывать аналогичные комплексы с хлоридом алю -миния с соответствующим батохромным сдвигом.
Для проведения реакции гексановое извлечение упаривали под вакуумом, остаток растворяли в 95% этиловом спирте и добавляли 3% спиртовый раствор алюминия хлорида. Наблюдаемый батохромный сдвиг максимума поглощения (около 15-20 нм) явился дополнительным доказательством того, что поглощение гексанового экстракта в УФ-свете обусловлено терпеноидными фенолальдегидами эвкалипта.
Рис. 1. УФ-спектр этанольного Длина волны, нм экстракта E. viminalis
3
2,5
2
1,5
1
0, 5
Рис. 2. УФ-спектр гексанового экстракта Е. угтгпаИ^'
УФ-спектры гексанового и спиртового растворов (без хлорида алюминия) оказались одинаковыми как по характеру кривой, так и по показателю поглощения в точке максимума. Это позволило нам использовать удельный показатель поглощения эвкалимина в спирте для нашей методики.
На дальнейших этапах разработки методики были определены условия исчерпывающей экстракции тер -пеноидных фенолальдегидов по соотношению сырья и экстрагента и продолжительности нагревания (табл. 1).
Полученные результаты показали, что условиями исчерпывающей экстракции фенолальдегидов из листьев эвкалипта прутовидного является часовая экстракция кипящим гексаном при соотношении сырья и растворителя 1 : 200.
Все вышеизложенное позволило нам предложить следующую методику количественного определения.
Методика количественного определения суммы терпеноидных фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера 1 мм. Около 1 г сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 500 мл, прибавляют 200 мл гексана. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане при умеренном кипении гексана в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводя объем раствора до метки гексаном.
1 мл полученного извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки гексаном. Измерение оптической плотности раствора проводят при длине волны 278 нм, используя в качестве раствора сравнения гексан. Содержание суммы терпеноидных фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле
х _ Б•200•50-100 " 720 • т-1 • (100 - Ж),
где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; 720 - удельный показатель поглощения ГСО эвкалимина; т - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании, %.
Для определения метрологических характеристик разработанной методики провели 10 параллельных определений (табл. 2).
Таблица 1. Зависимость выхода фенолальдегидов листьев эвкалипта прутовидного в гексан от параметров
экстракции
Соотношение сырье (г) - экстрагент (мл) Время экстракции, мин Содержание суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин, %
1 100 30 3,99±0,03
1 100 60 4,98±0,05
1 100 90 5,25±0,12
1 200 30 4,07±0,09
1 200 60 5,58±0,13
1 200 90 5,57±0,03
Длина волны,нм
0
158
Р.Ш. Хазиев, M.B. Васильева, A.C. Макарова, Л.Т. Мусина
Таблица 2. Метрологические характеристики метода определения фенолальдегидов в листьях эвкалипта
прутовидного
f X S2 S P t (0,95; 9) Ax s, %
9 5,58 0,0354 0,1881 0,95 2,26 0,13 ±2,41
Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости методики, ошибка единичного определения не превышает ± 2,41%.
Для установления корреляции между содержанием фенолальдегидов, определенных разработанным нами способом, и уровнем антимикробной активности были проведены микробиологические испытания методом двукратных серийных разведений на МПБ (рН 7,0) и последующим пересевом методом репликаций на чашки Петри с МПА с тест-микробом Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р. Для этого гексан из полученных извлечений отгонялся досуха под вакуумом, остаток растворялся в 50 мл 95% этанола. Полученный раствор подвергался микробиологическим испытаниям (табл. 3).
Испытанный раствор показал высокий уровень антимикробной активности, что подтверждает избирательную экстракцию действующих веществ эвкалипта прутовидного - терпеноидных фенолальдегидов гексаном.
Таблица 3. Антимикробная активность извлечения из листьев эвкалипта прутовидного (на культуре Staphylococcus aureus ATTC 6538-P)
Извлечение Концентрация терпеноидных фенолальдегидов в извлечении, % Максимальное разбавление извлечения, инактиви-рующее размножение стафилококков Минимальная подавляющая концентрация терпеноидных фенолальдегидов, мкг/мл
Спиртовой экстракт (1 : 50), полученный после удаления гексана 0,11±0,02 1 : 256 4,4
Выводы
1. Разработанный метод количественного определения суммы фенолальдегидов в листьях эвкалипта прутовидного отличается хорошей воспроизводимостью, ошибка не превышает ±2,41%.
2. Высокая антибактериальная активность гексанового экстракта из листьев эвкалипта прутовидного подтверждает избирательную экстрагируемость фенолальдегидов выбранным растворителем.
Список литературы
1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 1989. 400 с.
2. ФСП 42-8000-06. Эвкалипта прутовидного листья / ОАО «Красногорсклексредства». Введ. 16.10.06. М., 2006. 14 с.
3. ФСП 42-0039337502 Эвкалипта прутовидного листья. / ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга». Введ. 30.06.03 СПб., 2003. 14 с.
4. ФСП 42-2007-08. Эвкалипта прутовидного листья / ООО ПКФ «Фитофарм». Введ. 12.05.08. М., 2008. 10 с.
5. ФС 42-1348-91. Раствор хлорофиллипга спиртовый 1% / Фармакопейный государственный комитет. Введ. 10.10.91. М., 1991. 4 с.
6. Eschler B.M., Pass D.M., Willis R., Foley W.J. Distribution of foliar formylated phloroglucinol derivatives amongst Eucalyptus species // Biochemical Systematics and Ecology. 2000. Vol. 28. Pp. 813-824.
7. Тюкавкина H.A., Зурабян С.Э., Белобородов В.Л., Лузин А.П. Органическая химия : учебник для вузов. Кн. 2: Специальный курс / под ред. Н.А.Тюкавкиной. М., 2008. 592 с.
8. Савина A.A., Захаров В.Ф., Цыбулько Н.С. Строение нового фенолальдегида из листьев Eucalyptus viminalis // Химия природных соединений. 1991. №6. С. 789-795.
Поступило в редакцию 23 июля 2012 г. После переработки 15 января 2013 г.
Khaziev R.Sh.*, Vasilyeva M.V., Makarova A.S., Musina L.T. QUANTITATIVE DETERMINATION OF FORMYLATED PHLOROGLUCINOL COMPOUNDS IN THE LEAVES OF EUCALYPTUS VIMINALIS Kazan State Medical University, ul. Butlerova, 49, Kazan, 420012 (Russia), e-mail: xaziev@inbox.ru The way of determination of spectrophotometry method of formylated phloroglucinol compounds in the leaves of Eucalyptus viminalis was developed. The relative error of determination doesn't exceed 2,4%. The relation between the level of formylated phloroglucinol compounds determined by the developed method and antibacterial activity of extracts containing them is shown.
Keywords: Eucalyptus viminalis, formylated phloroglucinol compounds, standardization, antibacterial activity. References
1. Gosudarstvennaia farmakopeia SSSR: Vyp. 2. Obshchie metody analiza. Lekarstvennoe rastitel'noe syr'e. 11-e izd. [State Pharmacopoeia of the USSR, Vol. 2. Common methods of analysis. Herbal drugs. 11th ed.]. Moscow, 1989, 400 p. (in Russ.).
2. FSP 42-8000-06. Evkalipta prutovidnogo list'ia. OAO «Krasnogorskleksredstva». [Pharmacopoeia article Enterprise 42-8000-06. Eucalyptus leaves. Public limited company «Krasnogorskleksredstva»]. Moscow, 2006, 14 p. (in Russ.).
3. FSP 42-0039337502 Evkalipta prutovidnogo list'ia. OAO «Farmatsevticheskaia fabrika Sankt-Peterburga». [Pharmacopoeia article Enterprise 42-0039337502. Eucalyptus leaves. Public limited company «Farmatsevticheskaia fabrika Sankt-Peterburga»]. St. Petersburg, 2003. 14 p. (in Russ.).
4. FSP 42-2007-08. Evkalipta prutovidnogo list'ia. OOO PKF «Fitofarm». [Pharmacopoeia article Enterprise 42-200708. Eucalyptus leaves. Ltd «Fitofarm»]. Moscow, 2008, 10 p. (in Russ.).
5. FS 42-1348-91. Rastvor khlorofillipta spirtovyi 1%. Farmakopeinyi gosudarstvennyi komitet. [Pharmacopoeia article 42-1348-91. Hlorofillipta alcohol solution of 1%. State Pharmacopoeia Committee.]. Moscow, 1991, 4 p. (in Russ.).
6. Eschler B.M., Pass D.M., Willis R., Foley W.J. Biochemical Systematics and Ecology, 2000, vol. 28, pp. 813-824.
7. Tiukavkina N.A., Zurabian S.E., Beloborodov V.L., Luzin A.P. Organicheskaia khimiia: uchebn. dlia vuzov. [Organic chemistry: a textbook for high schools.]. Moscow, 2008, part. 2, 592 p. (in Russ.).
8. Savina A.A., Zakharov V.F., Tsybul'ko N.S. Khimiiaprirodnykh soedinenii, 1991, no. 6, pp. 789-795. (in Russ.).
Received July 23, 2013 Revised January 15, 2013
* Corresponding author.
