CC BY
46
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ § 37
УДК 616.832-001.33 : 616-008.9-092.18 : 616-092.4
Б.Б. Жетписбаев, Т.Т. Керимбаев (д.м.н.), В.Г. Алейников, А.О. Кожахметова, С.Г. Умбеталиев, М.С. Усеева АО «Национальный центр нейрохирургии», г. Астана, Казахстан
КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РЕГЕНЕРАЦИИ СПИННОМОЗГОВОЙ
ТРАВМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС
Спинномозговая травма является одной из самых разрушительных травм и может приводить к тяжелым осложнениям. Лекарственная терапия, рекомендуемая для лечения травматических повреждений спинного мозга, используется, но малоэффективна. В последнее время в экспериментальных лабораторных исследованиях перспективной стратегией для лечения спинномозговой травмы считают подсадку периферических нервов с нейротрофическими факторами и трансплантацией стволовых клеток.
Цель исследования: выявить патоморфологические признаки регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс, которым оперативным путем была проведена подсадка периферического нерва пропитанного гидрогелем. Материалы и методы. Эксперименты проведены на 30 аутбредных крысах-самцах линии Вистар весом 180-200 грамм. Животные были выведены из эксперимента путем декапитации, на 14, 21, 30 и 60 сутки эксперимента. Область повреждения спинного мозга подвергалась патоморфологическому и иммуногистохимическому исследованию.
Заключение. На 60 сутки в нейронах в месте установки аутотрансплантанта из периферического нерва, имбибированного гидрогелем имели место явления регенерации аксонов, клинически проявляющиеся признаками частичного восстановления утраченных сенсомоторных функций спинного мозга. Ключевые слова: спинномозговая травма, патоморфология, иммуногистохимия, аксон, эксперимент.
Введение.
Спинномозговая травма является одной из самых разрушительных травм и может приводить к тяжелым осложнениям. Регенерация спинномозговой травмы процесс длительный и зачастую заканчивается потерей функций спинного мозга [1]. Исследования in vivo и in vitro, проводимые в последние годы определили основные проблемы, которые должны быть решены для улучшения аксональной регенерации центральной нервной системы у взрослых млекопитающих [2-6]. Существует достаточно доказательств того, что ингибиторы аксонального роста имеют большое значение в создании неблагоприятной среды для регенерации [1, 7-15]. Реактивное воспаление и реакция глиальной ткани на травму приводит к созданию неблагоприятной среды для аксональной регенерации [2, 9, 16, 17]. Нейроны и клетки глии, погибшие во время травмы не могут быть полностью восстановлены из собственного пула стволовых клеток, обуславливая дегенерацию спинного мозга с образованием ликворных кист, глиоза и глиофиброза что требует создание субстрата для роста аксонов через очаг повреждения [18, 19]. В настоящее время лекарственная терапия, рекомендуемая для лечения травматических повреждений спинного мозга, используется, но малоэффективна [3, 12, 13, 14].
В последнее время в экспериментальных лабораторных исследованиях перспективной стратегией для лечения спинномозговой травмы считают подсадку периферических нервов с нейротрофически-ми факторами и трансплантацией стволовых клеток [9, 10, 20].
В морфогенезе регенерации спинномозговой травмы имеет место пролиферация аксонов, глио-
цитов, шванновских клеток мигрирующих в область повреждения, разрастание грануляционной ткани, формирование глиомезодермального рубца [2]. Для восстановления функций спинного мозга необходима регенерация аксонов нервных клеток, которая выявляется иммуногистохимически маркерами ней-рональной дифференцировки: нейрон-специфическая энолаза (NSE), нейрональный ядерный антиген (NeuN), ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2) [2].
Цель исследования: выявить патоморфоло-гические признаки регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс, которым оперативным путем была проведена подсадка периферического нерва пропитанного гидрогелем на основе ги-алуроновой кислоты (НА), термостабилизированной хондроитиназы ABC (ChABC), аутологичных мезен-химальных стволовых клеток (МСК) и нейротрофи-ческих факторов.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 30 аутбредных крысах-самцах линии Вистар весом 180-200 грамм, возрастом не менее 5-6 месяцев, которые были приобретены из питомника лабораторных животных «Пущино» (Россия). Животные содержались в условиях вивария, включающего 12 часовой цикл день/ночь, при температуре 22-25°С. Все хирургические процедуры проводились с животными в соответствии с этическими требованиями при работе с животными.
Животные подразделялись на контрольную и основную группы, содержались в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму.
Контрольная группа состояла из животных, которым была произведена экспериментальная травма спинного мозга без подсадки периферического нерва с гидрогелем. В основную группу вошли жи-
Б.Б. Жетписбаев, email: zhetpisbaev@list.ru
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№2(51) 2018
вотные: которым была произведена экспериментальная травма спинного мозга с подсадкой периферического нерва с гидрогелем.
Данная работа проводилась на базе Национального центра биотехнологий г. Астана. Изготовление гидрогеля с хондроитиназой и мезенхимально-ство-ловыми клетками, и факторами роста аксонов производилось в специализированной лаборатории данного Центра.
Моделирование полного повреждения спинного мозга проводилось на уровне шейно-грудного отдела позвоночника. В стерильных условиях под внутривенной анестезией и микроскопическим контролем проводился разрез кожи и мягких тканей животного, скелетировались позвонки (рис. 1 и 2).
Рисунок 1 - Операционное поле
Производилась ламинэктомия двух-трех позвонков, мобилизировался спинной мозг. Далее, под визуальным контролем производилось моделирование травмы спинного мозга путем его максимальной компрессии анатомическим зажимом Микулича в трех направления (под углом 90, 45 и 0 градусов). Накладывались послойные швы на рану. Показателем эффективности процедуры являлось визуализация передних отделов твердой мозговой оболочки, отсутствие перемычек между дистальным и проксимальным участками спинного мозга, так как даже 15% сохранившихся латеральных отделов спинного мозга обеспечивает сохранность функции конечностей [18, 19, 20].
Рисунок 2 - Диссекция паравертебральных мышц, ламинектомия
После операции проводилась оценка неврологического статуса, электронейромиографическое исследование для установления полного повреждения спинного мозга. Для контрольной группы животных оперативное вмешательство на этом заканчивалось.
Для основной группы животных (после оценки неврологического статуса и инструментальной верификации травмы спинного мозга) проводился 2 этап операции. В стерильных условиях и использованием микроскопа производился разрез длиной около 3 см. по внутреннему краю плечевой кости, мобилизовались крупные нервы обеих верхних конечностей (локтевой и срединный). Под микроскопом проводилось пропитывание приготовленным гидрогелем на основе НА нервов - трансплантатов (в количестве четырех). Пропитывание нервов осуществлялось инсулиновым шприцом по всей длине трансплантата. Проводился разрез по старому рубцу и осуществлялся доступ к поврежденному ранее участку спинного мозга на уровне шейно-грудного отдела позвоночника. Вскрывалась твердая мозговая оболочка. Спинной мозг мобилизировал-
ся в краниальном и каудальном направлениях до неповрежденной ткани. Производилось рассечение мягкой мозговой оболочки в проекции корти-коспинального тракта с обеих сторон выше и ниже участка повреждения, микродиссекторами раздвигалась ткань спинного мозга на глубину до 2-3 мм, устанавливались пропитанные гидрогелем на основе НА нервы-трансплантанты (по 2 с обеих сторон в краниальном и каудальном направлениях). Они фиксировались викриловыми швами (10/0) к мягкой мозговой оболочке. Накладывались послойные швы на рану.
В начале эксперимента 23 крысы были выведены путем декапитации на 14, 21 и 30 сутки эксперимента: 10 животных из контрольной группы на 14 и 21 сутки и 13 животных из основной группы на 21 и 30 сутки. Данные патоморфологического исследования этих крыс показали начальные признаки регенерации спинномозговой травмы в виде неспецифических реакций - периваскулярные нежно-волокнистые разрастания молодой фиброзной ткани, разрастания грануляционной ткани в зоне
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
39
подсадки периферического нерва, периневральное нежно-волокнистое разрастание глиальной ткани с пролиферацией клеток иммунопозитивных на BrdU (маркер клеточной пролиферации).
7 крыс из основной группы, были выведены из эксперимента на 60 сутки. У животных при элек-тронейромиографическом исследовании регистрировалась произвольная мышечная активность в виде потенциалов двигательных единиц с удовлетворительным насыщением интерференционного патерна. Параметризация двигательной активности позволяла в целом количественно оценить степень восстановления неврологических функций спинного мозга после его повреждения.
На патоморфологическое исследование забирался фрагмент спинного мозга длинной 3-4 см (по 1,5-2 см в ростральном и каудальном направлении
от эпицентра повреждения), вместе с позвонками. Материал был фиксирован в течении 24 часов в 10% нейтральном формалине, с последующей традиционной проводкой. Применялась окраска гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводилось с применением антител - GFAP (RTU), NSE (RTU), NeuN (RTU), BrdU (RTU), MAP2 (RTU). Патоморфологическое исследование осуществлялось при помощи микроскопа Axioskop 40, Carl Zeiss, Germany, при общем увеличении Х 100, Х 200.
Результаты и обсуждения.
При гистологическом исследовании в месте соединения ткани спинного мозга и нерва определялся неравномерно выраженный отек, очаговая лимфо-гистиоцитарная инфильтрация с примесью единичных плазмоцитов и эозинофилов (рис. 3 и 4).
\х
Рисунок 3 - Место соединения спинного мозга и нерва. Х 100. Окраска гематоксилином и эозином
, -Л
* V
* • » » г
i^'.ïïfl. ' 'i/ S
V <:Л
- ' -ГУ ^ - - - » I t
i' „V - -, 'V
>' - - ..... -• - •
Рисунок 4 - Место соединения спинного мозга и нерва. Х 200. Окраска гематоксилином и эозином
При иммуногистохимическом исследовании с применением нейрон-специфической енолазы (NSE) в месте соединения спинного мозга и нерва
среди воспалительных клеток определялись скопления нейронов с отростками (рис. 5).
Рисунок 5 - Нейроны с отростками. Х 100. Иммуногистохимия: позитивная реакция с NSE
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№2(51) 2018
При иммуногистохимическом исследовании с генерации аксонов, образование новых отростков с применением NeuN и Map 2 в нейронах отмечались направлением их к нерву-трансплантанту (рис. 6 и 7). признаки полной и неполной функциональной ре-
Рисунок 6 - Нейрон с явлениями регенерации аксона. Х Рисунок 7 - Нейрон с явлениями регенерации аксо-
200. Иммуногистохимия: позитивная реакция реакция с на. Х 200. Иммуногистохимия: позитивная с Map 2 NeuN
Заключение.
Таким образом, патоморфологическое и имму-ногистохимическое исследование спинного мозга крыс позволяют сделать вывод что в нейронах в месте установки аутотрансплантанта из периферического нерва, имбибированного гидрогелем имеют место явления полной и неполной функциональной регенерации аксонов, образование новых отростков с направлением их к нерву-трансплантанту. Регене-
рация аксонов клинически проявлялась признаками частичного восстановления утраченных сенсомо-торных функций спинного мозга. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о перспективности данного метода в лечении осложненной позвоночно-спинальной травмы и могут послужить основой для разработки нового метода лечения у пациентов с последствиями позвоночно-спинно-мозговых травм.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Керимбаев Т.Т., Алейников В.Г., Танкачеев Р.Ш., Га-лиев И.Ж., Жиренбаев Ж.О. Современный метод хирургического лечения посттравматических деформаций грудного и поясничного отделов позвоночника // Нейрохирургия и неврология Казахстана. - 2010. - №2 (19). - С. 20-24, 47-48.
2. Liang P., Jin L.H., Liang T., Liu, E.Z., Zhao S.G. Human neural stem cells promote corticospinal axons regeneration and synapse reformation in injured spinal cord of rats // Chinese medical journal. -2006. - № 119. - Р. 1331-1338.
3. Nori S., et al. Grafted human-induced pluripotent stem-cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2011. - № 108. - Р. 16825-16830.
4. Blight A.R. Spinal cord injury models: neurophysiology // J Neurotrauma. - 1992. - № 9. - P. 147-149.
5. Moreno-Manzano V. et al. Activated spinal cord ependymal stem cells rescue neurological function // Stem Cells. - 2009. - № 27. - P. 733-743.
6. Kubinova S., Sykova E. Biomaterials combined with cell therapy for treatment of spinal cord injury // Regenerative medicine. - 2012. - № 7. - P. 207-224.
7. Erceg S. et al. Transplanted oligodendrocytes and motoneuron progenitors generated from human embryonic stem cells promote locomotor recovery after spinal cord transection // Stem Cells. - 2010. -№ 28. - P. 1541-1549.
8. Keirstead H.S. et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury // J Neurosci. - 2005. - № 25. - P. 46944705.
9. Tsuji O. et al. Cell therapy for spinal cord injury by neural stem/progenitor cells derived from iPS/ ES cells // Neurotherapeutics. - 2011. - № 8. - P. 668-676.
10. Basso D.M., Beattie M.S., Bresnahan J.C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats // J Neurotrauma. - 1995. - № 12 (1). - P. 1-21.
11. Schucht P., Raineteau O., Schwab M. E., Fouad K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord // Exp Neurol. - 2002. - № 176. - P. 143-153.
12. Guth L., Brewer C.R., Collins W.F., Goldberger M.E., Perl E.R. Criteriafor evaluating spinal cord
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
41
regeneration experiments // Surgical neurology. -1980. - № 14. - P. 392.
13. Jendelova P., et al. Magnetic resonance tracking of transplanted bone marrow and embryonic stem cells labeled by iron oxide nanoparticles in rat brain and spinal cord // J Neurosci Res. - 2004. - № 76. -P. 232-243.
14. Chen J., et al. Acellularspinalcordscaffoldseeded withbonemarrowstromalcells protects tissue and promotes functional recovery in spinal cord-injured rats // J Neurosci Res. - 2014. - № 92. - P. 307-317.
15. Hejcl A. et al. Acute and delayed implantation of positively charged 2hydroxyethyl methacrylate scaffolds in spinal cord injury in the rat // Journal of neurosurgery. Spine. - 2008. - №8. - P. 67-73.
16. Yang C. C. et al. Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly after complete transection of the rat spinal cord // PLoSOne. - 2008. - № 3 (10).
17. Sakai K, et.al. Human dental pulp-derived stem cells promote locomotor recovery after complete transection of the rat spinal cord by multiple neuro-regenerative mechanisms // The Journal of clinical investigation. - 2012. - № 122. - P. 80-90.
18. Iannotti C. et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury // Exp Neurol. -2003. - № 183. - P. 379-393.
19. Lai B.Q., Wang J.M., Ling E.A., Wu J.L., Zeng Y.S. Graft of a tissueengineered neural scaffold serves as a promising strategy to restore myelination after rat spinal cord transection // Stem Cells Dev. - 2014. -№ 23. - P. 910-921.
20. Жетписбаев Б.Б., Керимбаев Т.Т., Алейников В.Г., Кожахметова А.О. Патоморфология регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс. - 2017. - №4. - С.20-23.
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№2(51) 2018
Б.Б. Жетп1сбаев, Т.Т. Керимбаев (M.f.d.), В.Г. Алейников, А.О. Кожахметова, С.Г. Умбеталиев, М.С. Усеева «¥лттык, нейрохирургия орталыгы» АК, Астана к, Казакстан
ЭКСПЕРИМЕНТТЕ ЕГЕУК,¥ЙРЫК,ТАРДЫЦ Ж¥ЛЫН-МИ ЖАРАК.АТТАРЫНЫЦ РЕГЕНЕРАЦИЯСЫН КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЯЛЫК БАГАЛАУ
Kipicne. Жулын-ми жаракаты ауыр аскынуларFа алып келетЫ жойкын жаракаттар катарына жатады. Жулын-ми жаракатын дэрiлiк жолмен емдеу усы-нылFан, бiра^ та кeпшiлiк жаFдайда оныц эсерi тым аз болады. Со^ы кезде экспериментальды зертха-наларда, болашакта жулын-ми жаракаттарын емдеу Yшiн, стратегиялык басымдылык нейротрофи-калык факторы бар перифериялык нервтi оть^ызу жэне баFаналык жасушаларды трансплантациялауFа берЫп отыр.
Зерттеу мацсаты: оперативтi жолмен оты-рFызылFан, гидрогель сщген перифериялык нервтщ, экспериментегi егеукуйрыктардаFы жулын-ми жа-ракатынан кейiнгi регенерацияныц паотоморфоло-гиялык белгiлерiн аныктау.
Материалдар мен adicmep. Эксперимент сал-мактары 180-200 грамм Вистар лзбепндеп 30 аут-брендт еркек егеукуйрыктарFа жYргiзiлдi. Егеукуй-рыктар тэжiрибеден декапитация жолымен 14, 21, 30 жэне 60 тэулкте шы^арылды. Жулын-миыныц жаракатталFан аймаFы патоморфологиялык жэне иммуногистохимиялык жолдармен зерттелдi.
Цорытынды. 60 тэулкте перифериялык нерв-тен аутотрансплантат орнатылFан жерде, гидрогель сщген нейрондарда, аксондардыц регенерациясы пайда болды. Клиникалык турFыда жулын-миыныц жоFалFан сенсомоторлык функцияларыныц бiр бели гi калпына келумен сипатталды.
Нег'1зг'1 свздер: жулын-ми жаракаты, патомор-фология, иммуногистохимия, аксон, эксперимент.
B.B. Zhetpisbayev, T.T. Kerimbaev (D.Med.Sci.), V.G. Aleinikov, A.O. Kozhakhmetova, S.G. Umbetaliev, M.S. Useeva JSC «National Centre for Neurosurgery», Astana, Republic of Kazakhstan
CLINICAL-MORPHOLOGICAL EVALUATION OF REGENERATION OF SPINAL INJURY
IN EXPERIMENT IN RATS
Introduction. Spinal trauma is one of the most destructive injuries and can lead to serious complications. Drug therapy, recommended for the treatment of traumatic spinal cord injuries, is used, but ineffective. Recently, in experimental laboratory studies, peripheral nerve imaging with neurotrophic factors and stem cell transplantation is considered as a promising strategy for treating spinal cord injury.
The aim of the study was to reveal the pathomorphological signs of regeneration of spinal cord injury in an experiment in rats, which were treated by surgical application of the peripheral nerve impregnated with hydrogel.
Materials and methods. The experiments were performed on 30 outbred male Wistar rats weighing
180-200 grams. The animals were removed from the experiment by decapitation, on the 14th, 21st, 30th and 60th day of the experiment. The area of spinal cord injury was subjected to pathomorphological and immunohistochemical studies.
Conclusion. On the 60th day in the neurons in the place of installation of an autograft from the peripheral nerve, which was hydrogel-imbibed, the phenomena of axon regeneration was found, which was clinically manifested as signs of a partial restoration of the lost sensorimotor functions of the spinal cord.
Keywords: spinal trauma, pathomorphology, immunohistochemistry, axon, experiment.
