CC BY
47
Е Н
р 0
КЛИНИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЯДЕРНОГО ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА ^-к В ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Е.С. Герштейн, А.М. Платова, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский
ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
CLINICAL PERSPECTIVES FOR STUDYING THE NUCLEAR TRANSCRIPTION FACTOR NF-kB IN BREAST CANCER
E.S. Gershtein, A.M. Platova, V.P. Letyagin, N.E. Kushlinsky
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
The paper describes a role of the nuclear transcription factor NF-kB in oncogenesis and presents studies of this factor in breast cancer (BC). It also shows it promising to use the values of the transcription factor NF-kB activity to identify a hormone-resistant subgroup among the patients with receptor-positive BC, in its early stages in particular.
Key words: nuclear transcription factor NF-kB, gene expression, breast cancer, perspective
Общие представления о роли NF-кB в онкогенезе
Ядерный транскрипционный фактор NF-kappa В (NF-kB) был первоначально идентифицирован как белок, связывающийся со специфической декамер-ной последовательностью ДНК (GGG ACT TTC C) в интроне гена легких цепей иммуноглобулинов-к в зрелых В-лимфоцитах и плазматических клетках. Позднее было продемонстрировано, что ДНК-свя-зывающая активность NF-kB стимулируется в ответ на целый ряд экзогенных стимулов, и эта стимуляция не зависит от синтеза белка de novo.
NF-kB играет важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, поскольку он регулирует экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [1]. Он представляет собой гетеродимерный комплекс белков семейства Rel, которые в большинстве покоящихся клеток неактивны и находятся в цитоплазме в комплексе со специфическими ингибиторами — IkB. Идентифицировано 5 белков семейства NF-kB, содержащих общий ДНК-связывающий домен: NF-kB1 (p50/p105), NF-kB2 (p52/p100), RelA (p65), RelB и c-Rel. Основной формой существования этих белков в большинстве типов клеток является гетеродимер p50/RelA(p65). Известно также о существовании 7 ингибиторов NF-kB: IkB-а, IkB-Р, IkB-y, IkB-е, Bcl-3, p100 и p105 [2].
При поступлении в клетку регуляторного стимула сигнальный каскад NF-kB активируется, происходят фосфорилирование ингибиторного белка специфическими IKB-киназами, а затем его полная деградация, и свободный активный NF-kB поступает в ядро. Схема внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к активации NF-kB и влияющих на выживание и пролиферацию опухолевых клеток, представлена на рисунке. В качестве активирующих агентов выступают, как прави-
ло, различные факторы роста (например, эпидермальный — ЭФР или а-трансформирующий — ТФР-а) и цитокины, бактериальные токсины и вирусные агенты, а также такие внешние проне-кротические факторы, как y- и ультрафиолетовое облучение, кислородные радикалы и т.п. [3].
Одним из ключевых вышележащих эффектор-ных механизмов, активирующих NF-kB, является PDK/Akt-сигнальный путь. Его основные компоненты: фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), фос-форилирующая инозитольное кольцо в положении D-3, а также серин/треониновая протеинкиназа-В (Akt). Активность NF-kB может модулироваться также с участием другой важнейшей сигнальной системы — онкогена Ras и нижележащего каскада ми-тоген-активируемых протеинкиназ (МАП-киназ). Регуляция NF-kB сигнального пути нарушена во многих опухолях человека, в том числе и при раке молочной железы (РМЖ). В большинстве опухолевых клеток NF-kB постоянно активирован и находится в ядре. Эта активация не только защищает клетки от апоптоза, но также увеличивает их пролиферативную активность, инвазивный, метастатический и ангиогенный потенциал [3, 4].
Экспериментальные исследования NF-кB при РМЖ
Установлено, что NF-kB играет важную роль не только в этиологии, патогенезе и прогрессии РМЖ, но и в формировании и функционировании нормальной молочной железы. Так, в опытах на трансгенных мышах четко показано, что этот фактор необходим для правильного развития железистой ткани: при блокировании активации NF-kB наблюдались серьезные нарушения лактации [5, 6].
NF-кВ-сигнальный путь играет решающую роль в индукции и поддержании эпителиально-мезенхимального перехода (epithelial-mesenchymal transition — EMT) — процесса изменения эпителиально-
Новые технологии
Новые технологии
H
.
го фенотипа клеток на мезенхимальный. В норме этот переход происходит при эмбриональном развитии и заживлении ран, наблюдается он и при таких патологических неопухолевых процессах, как фиброз, а также при опухолевой прогрессии. В то же время ЕМТ является важной составной частью злокачественной трансформации клеток, так как способствует приобретению нормальными клетками метастатического и инвазивного потенциала. M.A. Huber и соавт. [7] продемонстрировали в 2 модельных системах in vitro и in vivo, что подавление активности NF-кВ не только тормозит ЕМТ, индуцированный в клетках молочной железы онкобелком На-Ras в кооперации с ТФР-р, но и вызывает обратный переход мезенхимального фенотипа в эпителиальный, т.е. блокирует опухолевую трансформацию [1].
Особенно велико значение транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях молочной железы, отрицательных по рецепторам эстрогенов (РЭ), но имеющих рецепторы ЭФР (РЭФР) или Her-2/neu [8, 9]. В последние годы показано, что гиперактивация NF-кВ является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам [4, 10, 11], химиопрепаратам [12, 13] и лучевой терапии [14]. Возможные подходы к преодолению NF-кВ-опосредованной рези-
| Статины FTis Страуспорин
Трастузумаб; . if 17AAG; Cf-1033/'‘ EKB559; Лапатиниб
Л
tRTk (ErBp-.
Вортманнин; LY294002
NF-KB-неактивный \p50 комплекс
"(ros)
/ Дихлокарбонаты ^ и другие
антиоксиданты
Партенолид
IKK-активирующий комплекс Убиквитин - протеасома
Цитоплазма
Ядро
Антиэстрогены
NF- KB-активируема ' ER-индуцируемая транскрипция
транскрипция
Схема внутриклеточных сигнальных путей, способствующих активации ИГ-кБ влияющих на выживание и пролиферацию опухолевых клеток и приводящих к развитию гормонорезистентности. Указаны также некоторые агенты, специфически ингибирующие эти сигнальные процессы и способные противодействовать вмешательству ИГ-кБ в РЭ-зависимые эффекты таких препаратов, как антиэстрогены или ингибиторы ароматазы [4]
стентности к противоопухолевой терапии суммированы в нескольких обзорах [2, 4, 15, 16]. В настоящее время известно несколько десятков экзогенных и эндогенных агентов, способных подавить активность NF-kB. Основным недостатком большинства из них является низкая специфичность. Некоторые из блокаторов NF-кВ-сигнального пути обозначены на схеме, предложенной Y Zhou и соавт. [4] (см. рисунок). К числу наиболее перспективных и специфичных препаратов относят ингибитор протеа-сом бортезомиб, который уже используется в лечении множественной миеломы [17], и ингибитор ЬсВ-активирующей киназы партенолид [18, 19], обладающие значительной специфичностью по отношению к NF-кВ и подавляющие его активацию, за счет предотвращения деградации IkB (бортезомиб) или подавления его активации (партенолид).
Другим клинически значимым эффектом NF-кВ может оказаться его способность стимулировать образование остеолитических метастазов РМЖ в костях. В опытах in vivo продемонстрировано [20], что конститутивная активация NF-кВ играет решающую роль в реализации остеолитической активности клеток РМЖ путем индуцирования синтеза гра-нулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). Показана также корреляционная взаимосвязь между степенью активации NF-кВ и уровнем экспрессии ГМ-КСФ в метастатических поражениях костей у больных РМЖ. Установлено также, что BRMS1 (breast cancer metastasis suppressor 1) — белок, входящий в состав транскрипционного корепрессорного комплекса и подавляющий метастазирова-ние РМЖ за счет снижения синтеза остеопонтина, — осуществляет этот эффект за счет блокирования активации NF-kB [21].
Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-кВ-сигналь-ный путь, позволит повысить чувствительность клеток к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение, в том числе и для предотвращения ме-тастазирования в кости [20, 21]. Клинико-лабораторные исследования Большинство доказательств определяющего значения NF-kB-сигнального каскада при РМЖ получено в экспериментальных
Бортезомиб
KB-деградация
Апоптоз и подавление роста
\ LAQ824; *
У' SAHA /
4G
Е Н
системах, а данные об экспрессии этого фактора в опухолях человека, собранные с помощью клинического материала, единичны, выполнены с использованием различных методических подходов и требуют дальнейшего подтверждения.
В первом исследовании такого рода для оценки степени активации различных субъединиц NF-kB были использованы полуколичественные методы электрофоретического торможения в геле (EMSA), иммуноблоттинга ядерных экстрактов и иммуноги-стохимического (ИГХ) окрашивания срезов [22]. В этой работе было впервые показано, что в опухолях больных РМЖ значительно активированы по сравнению с окружающей неизменной тканью р50-и р52-субъединицы NF-kB, а также один из гомологов IkB — Bcl-3, активирующий именно эти субъединицы транскрипционного фактора.
D.K. Biswas и соавт. [1] также оценивали степень активации NF-kB с помощью метода EMSA и впервые разделили опухоли (31 образец) на подгруппы в зависимости от РЭ и Her-2/neu-статуса. Активированный NF-kB выявлялся преимущественно в РЭ-опухолях: в 6 из 7 РЭ-Her-2+-образцов, в 3 из 9 РЭШг-2- и всего лишь в 2 из 15 РЭ+-опухо-лей. Такое соотношение соответствует экспериментальным данным об активации NF-кВ-сигнального пути в гормононезависимых клеточных линиях с высокой экспрессией Her-2/neu или РЭФР [8].
В дальнейшем внимание исследователей было привлечено в основном к рецепторположительно-му РМЖ. Так, в работе Y Zhou и соавт. [23] был впервые использован количественный иммунофер-ментный метод для оценки ДНК-связывающей активности 2 субъединиц NF-kB — р50 и р65 — в опухолях 81 больной ранним РЭ+ РМЖ. Пациентки были разделены на 2 подгруппы: 1-я — 22 больные с высоким (> 100 фмоль/мг белка) и 2-я — 59 больных с относительно низким (21—87 фмоль/мг белка) содержанием РЭ в опухоли. ДНК-связывающая активность обеих субъединиц была достоверно выше в опухолях больных 2-й группы по сравнению с таковой в 1-й группе, при этом в обеих подгруппах связывающая активность р50 была в несколько раз выше, чем активность р65. Последнее наблюдение согласуется с описанными выше данными [22].
У 59 пациенток 2-й группы, получавших адъ-ювантно тамоксифен по одной и той же схеме, была исследована взаимосвязь уровня активности NF-kB и безрецидивной/безметастатической выживаемости [23]. Оказалось, что в опухолях 13 из этих больных, у которых за время наблюдения (80 мес) произошло прогрессирование заболевания, активность обеих ДНК-связывающих субъединиц NF-kB была достоверно выше, чем в опухолях пациенток, наблюдавшихся без признаков возврата болезни на фоне приема тамоксифена. ДНК-связывающая активность NF-kB р50 и р65 положительно коррели-
ровала с несколькими биологическими маркерами РМЖ (в том числе с Her-2/neu), но только 2 из этих маркеров — содержание активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) и ДНК-связывающая активность транскрипционного фактора АР-1 (activating protein 1) — оказывали такое же влияние на прогноз, как активность NF-kB. Авторами были предложены условные границы активности субъединиц NF-кВ, позволяющие стратифицировать РЭ+-боль-ных РМЖ с относительно низким содержанием рецепторов в опухоли на чувствительных и нечувствительных к тамоксифену. При этом более значимые различия были получены в результате стратификации на основании активности р50 субъединицы.
В 2007 г. та же группа исследователей использовала метод микрочипов для определения уровня экспрессии комплекса генов, регулируемых NF-kB и другим транскрипционным фактором АР-1 [11]. Было обследовано 4 группы больных РМЖ без метастазов в лимфатических узлах (ЛУ) с РЭ+-опухо-лями (всего — 262 пациентки), лечившихся в разных медицинских центрах и получавших адъ-ювантно тамоксифен в различных режимах. Выявлено 3 NF-кВ/АР-1-активируемых гена — циклин D1, uPA и VEGF, с помощью которых можно разделить больных РЭ+-РМЖ без метастазов в ЛУ на подгруппы с более ранним и более поздним прогрессированием, отмеченным на фоне тамоксифе-на, независимо от режима приема препарата. Наиболее значимыми различия были в группе молодых больных. Таким образом, оценка экспрессии этих генов, наряду с оценкой уровня активации самих транскрипционных факторов, может оказаться полезной для выявления группы больных, резистентных к тамоксифену, несмотря на наличие положительного рецепторного статуса опухоли.
C. Liu и соавт. [24] исследовали прогностическое значение активированного NF-kB у 130 РЭ+-больных РМЖ с метастазами в ЛУ с помощью ИГХ-метода оценки экспрессии данного белка. Обнаружено достоверное уменьшение безрецидивной и общей выживаемости у больных с повышенной экспрессией активированного NF-kB в опухоли, подтвержденное данными многофакторного анализа. Одновременно была исследована экспрессия других сигнальных белков: фосфорилированной киназы Akt (pAkt) — одного из вышележащих активаторов NF-kB, фосфорилированного транскрипционного фактора STAT3, РЭФР, Her-2/neu, фосфатазы PTEN, белка Ki67. Продемонстрирована положительная корреляционная взаимосвязь между уровнями экспрессии NF-kB и pAkt. Оба эти показателя, в свою очередь, коррелировали с гиперэкспрессией Her-2/neu и степенью злокачественности РМЖ. На основании этих результатов авторы предположили, что активация pAkt/NF-кВ-сигнального пути ухудшает прогноз РЭ+- РМЖ c метастазами в ЛУ.
Новые технологии
Новые технологии
Н
р
О
S.J. van Laere и соавт. [9] изучали активацию NF-кВ в отечно-инфильтративном и обычном РМЖ с использованием современных технологий определения «генных подписей» опухолей методом количественной полимеразной цепной реакции. Определяли несколько «подписей»: набор генов, характеризующих активность РЭ, набор генов, характеризующих активность МАП-киназного сигнального пути, группу из 8 генов, активируемых NF-кВ, а также смешанную «подпись», объединяющую РЭ- и NF-кВ-регулируемые гены. Оказалось, что экспрессия большинства РЭ-модулируемых генов значительно увеличена в опухолях с транскрипционно неактивированным NF-kB. Более того, наблюдалась отрицательная корреляция между уровнями экспрессии РЭ- и NF-кВ-активируемых генов, что подтверждает обратное соотношение между активностью РЭи NF-кВ-сигнальных путей. Отечно-инфильтратив-ные раки характеризовались низкой экспрессией
РЭ-зависимых генов и высокой — NF-кB-акгивиру-емых генов. В опухолях с таким фенотипом (как ин-фильтративных, гак и неинфильтративных) выявлена также гиперэкспрессия РЭФР и/или Нег-2. Авторы полагают, что именно повышенная экспрессия этих рецепторных белков приводит к активации NF-кВ и подавлению активности РЭ.
Таким образом, несмотря на различия методических подходов и разнообразие маркеров, исследовавшихся в комплексе с NF-кB, все авторы приходят к единому мнению о перспективности использования показателей активности транскрипционного фактора NF-кB для выявления гормонорезистентной подгруппы среди больных ре-цепторположительным РМЖ, в первую очередь на ранних стадиях заболевания. Дальнейшего клинического изучения требует вопрос о роли этих показателей в оценке и преодолении химио- и радиорезистентности РМЖ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Biswas D.K., Shi Q., Baily S. et al. NF-kappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell proliferation and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(27):10137—42.
2. Kim H.J., Hawke N., Baldwin A.S. NF-kappa B and IKK as therapeutic targets in cancer. Cell Death Differ 2006;13(5):738—47.
3. Bhat-Nakshatri P., Sweeney C.J., Nakshatri H. Identification of signal transduction pathways involved in constitutive NF-kappa B activation in breast cancer cells. Oncogene 2002;21(13):2066—78.
4. Zhou Y., Eppenberger-Castori S., Eppenberger U., Benz C.C. The NF-kappa B pathway and endocrine-resistant breast cancer. Endocr Relat Cancer 2005;12(Suppl 1):37—46.
5. Cao Y., Karin M. NF-kappa B in mammary gland development and breast cancer. J Mam Gland Biol Neoplasia 2003;8(2):215—23.
6. Connelly L., Robinson-Benion C., Chont M. et al. A transgenic model reveals important roles for the NF-kappa B alternative pathway (p100/p52) in mammary development and links to tumorigenesis. J Biol Chem 2007;282(13):10028—35.
7. Huber M.A., Azoitei N., Baumann B. et al. NF-kappa B is essential for epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a model of breast cancer progression. J Clin Invest 2004;114(4):569—81.
8. Biswas D.K., Iglehart J.D. Linkage between EGFR family receptors and nuclear factor kappa B (NF-kappa B) signaling in breast cancer. J Cell Physiol 2006;209(3):645—52.
9. Van Laere S.J., van der Auwera I., van den Eynden G.G. et al. NF-kappa B activation in inflammatory breast cancer is
associated with oestrogen receptor down-regulation, secondary to EGFR and/or ErbB2 overexpression and MAPK hyperactivation. Br J Cancer 2007;97(5):659—69.
10. Лобанова Ю.С., Щербаков А.М., Шатская В.А., Красильников М.А. Эстроген-зависимый апоптоз в клетках рака молочной железы: роль сигнального пути, регулируемого NF-kB. Биохимия 2007;72(3):392—401.
11. Zhou Y., Yau C., Gray J.W. et al. Enhanced NF-kappa В and AP-1 transcriptional activity associated with antiestrogen resistant breast cancer. BMC Cancer 2007;7:59.
12. Hernandez-Vargas H., Rodriguez-Pinilla S.M., Julian-Tendero M. et al. Gene expression profiling of breast cancer cells in response to gemc-itabine: NF-kappa В pathway activation as a potential mechanism of resistance. Breast Cancer Res Treat 2007;102(2):157—72.
13. Weldon C.B., Burow M.E., Rolfe K.W et al. NF-kappa В-mediated chemoresis-tance in breast cancer cells. Surgery 2001;130(2):143—50.
14. Russo S.M., Tepper J.E.,
Baldwin A.S. Jr. et al. Enhancement of radiosensitivity by proteasome inhibition: implications for a role of NF-kappa В.
Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001;50(1):183—93.
15. Chen F. Endogenous inhibitors of nuclear factor-kappa В, an opportunity for cancer control. Cancer Res 2004;64(22):8135—8.
16. Mayo M.W., Baldwin A.S. The transcription factor NF-kappa В: control of oncogenesis and cancer therapy resistance. Biochim Biophys Acta 2000;1470(2):55—62.
17. Cardoso F., Ross J.S., Picart M.J. et al. Targeting the ubiquitin-proteasome pathway in breast cancer. Clin Breast Cancer 2004;5(2):148—57.
18. Jenkins C., Hewamana S., Gilkes A. et al. Nuclear factor-kappa B as a potential therapeutic target for the novel cytotoxic agent LC-1 in acute myeloid leukaemia.
Br J Haematol 2008;143(5):661—71.
19. Pajak B., Gajkowska B.,
Orzechowski A. Molecular basis of parthenolide-dependent proapoptotic activity in cancer cells. Folia Histochem Cytobiol 2008;46(2):129—35.
20. Park B.K., Zhang H., Zeng Q. et al. NF-kappa B in breast cancer cells promotes osteolytic bone metastasis by inducing osteoclastogenesis via GM-CSF Nat Med 2007;13(1):62—9.
21. Samant R.S., Clark D.W.,
Fillmore R.A. et al. Breast cancer metastasis suppressor 1 (BRMS1) inhibits osteo-pontin transcription by abrogating NF-kappa B activation. Mol Cancer 2007;6:6.
22. Cogswell P.C., Guttridge D.C., Funkhouser W.K., Baldwin A.S. Jr. Selective activation of NF-kappa B subunits in human breast cancer: potential roles for NF-kappa B2/p52 and for Bcl-3. Oncogene 2000;19(9):1123—31.
23. Zhou Y., Eppenberger-Castori S., Marx C. et al. Activation of nuclear fac-tor-kappa B (NF-kappa B) identifies a high-risk subset of hormone-dependent breast cancers. Int J Biochem Cell Biol 2005;37(5):1130—44.
24. Liu C., Zhou S., Ke C.S. et al. Activation and prognostic significance of AKT, NF-kappa B and STAT3 in breast cancer with lymph node metastasis and estrogen receptor expression. Ai Zheng 2007;26(9):929—36.
