CC BY
63
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ АУТОЛОГИЧНОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНОМ TAG-7
И.Н. Михайлова1, Л.В.Демидов1,А.Ю. Барышников1,0.С. Бурова1,
Г.Ю. Харкевич1, Т.Н. Палкина1, A.M. Козлов1, Л.Ф. Морозова1,
А.А. Вайнсон1,3.Г. Кадагидзе1, Т.Н. Заботина1, А.А. Буркова1,
М.Б. Дорошенко1, С.А. Хатырев1, Д.А. Носов1, С.А. Тюляндин1,
A.M. Гарин1,
л 1 л л
С.Л. Киселев2, С.С. Ларин2, Г.П. Георгиев2
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН1, г. Москва Институт биологии гена РАН2, г. Москва
Вакцинотерапия злокачественных новообразований с помощью геномодифицированных опухолевых клеток представляет собой новое перспективное направление. Разработан метод лечения с помощью аутологичных опухолевых клеток, трансфецированных геном tag-7. Доклинические исследования продемонстрировали специфичность in vitro и in vivo и низкую токсичность данного метода. Клинические испытания по первой фазе, проведенные у 9 пациентов с диссеминированной меланомой и раком почки, побочных эффектов не выявили. Установлено активирующее влияние данной вакцины на иммунную систему.
CLINICAL TRIALS OF AUTOLOGOUS VACCINE ON THE BASE OF TUMOR CELLS MODIFIED BY TAG-7 GENE
I.N. Mikhailova1, L.V. Demidov1, A.Yu. Baryshnikov1, O.S. Burova',
G.Yu. Kharkevich1, T.N. Palkina1, A.M. Kozlov1, L.F. Morozova1, A.A. Vainson1, Z.G. Kadagidze1, T.N. Zabotina1,
A.A.Burkova1, M.B. Doroshenko1, S.A. Khatyrev1, D.A. Nosov1, S.A. Tyulyandin1, A.M. Garin1, S.L. Kiselev2, S.S. Larin2,
G.P. Georgiev2 N.N. Blokhin Cancer Research Center1, RAMS, Moscow Institute of Gene Biology2, RAMS, Moscow
Vaccinotherapy with gene-modified tumor cells was shown to be a promising treatment method for malignant tumors. The treatment method using autologous tumor cells transferred by tag-7 gene was developed. Pre-clinical investigations demonstrated specificity in vitro and in vivo and low toxicity of this method. Phase I clinical trials performed on 9 patients with disseminated melanoma and kidney cancer detected no side effects. The activated influence of this vaccine on immune system was found.
Одним из вариантов биоиммунотерапии зло- клеток, трансфецированных различными гена-
качественных новообразований является вакци- ми. Применение данного вида лечения наибо-
нотерапия с помощью облученных опухолевых лее целес°°бразн° для тех: мшатестаенных: за-
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1 (13) 4
болеваний, которые являются иммуногенными, например меланома, рак почки, и в силу этого способны регрессировать под влиянием специфического воздействия иммунной системы. В свою очередь, генетическая модификация опухолевых клеток позволяет повысить их иммуно-генность [3], что непосредственно способствует: 1) повышению эффективности презентации антигена для взаимодействия с Т-клетками; 2) усилению костимуляции (мембранно-связывающие лиганды В7) и 3) обеспечению местного синтеза цитокинов (IL-2 и др.). Трансфекция опухолевых клеток генами цитокинов IFN-0C или -у восстанавливает экспрессию главного комплекса гастосовместимости первого класса (МНС I класса) на этих клетках [5, 6, 7], что не дает опухоли «уклоняться» от иммунологического надзора хозяина. С учетом успешного проведения исследований in vitro и in vivo с использованием геномодифицированных опухолевых клеток данный метод находит широкое применение в клинике. Стимуляция противоопухолевого иммунитета наблюдается при терапии аутологичными мелаыомными клетками, трансфециро-ванными геном интерлейкина-12 [9], грануло-цитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора [8], интерлейкина-2 или интерлейкина-4 [4] .
Ранее нами охарактеризован ген tag-7, усиливающий хемотаксис и способствующий созреванию дендритных клеток [1, 2]. Проведенные на животных доклинические исследования показали возникновение противоопухолевого ответа при использовании модифицированных геном tag-7 опухолевых клеток в качестве вакцинирующего агента. Предполагается, что специфическое действие вакцины на основе опухолевых клеток, генетически модифицированных геном tag-7, основано на том, что опухолевые клетки начинают секретировать белок tag7, который является хемоатрактантом для клеток иммунной системы. Клетки, привлеченные к месту введения вакцины, процессируют опухолевые антигены, а их активация до зрелых анти-генпрезентирующих дендритных клеток контролируется белком tag7. Зрелые, нагруженные
опуxолевыми антигенами дендритные клетки по стандартной сxеме мигрируют в лимфатические узлы, где активируют Т-клетки. В свою очередь, Т-клетки, «обученные» на модифицированные опуxолевыx клеткаx, могут распознавать специфические слабые опуxолевые антигены и атаковать немодифицированные опуxолевые клетки в отдаленные от введения вакцины местж.
Для изучения переносимости вакцины, приготовленной из аутологичные опуxолевыx клеток, трансфецированные геном tag-?, оценки влияния на иммунологические параметры организма, а также отработки доз и режимов введения была проведена первая фаза клинического исследования. Оценка побочный эффектов проводилась по критериям ВОЗ.
В исследование было включено ? больные меланомой кожи и 2 больные раком почки, проxодившиx лечение в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блоxина в 1999-2001 гг. Среди больные было три женщины и шесть мужчин в возрасте от 40 до 68 лет. Все больные имели диссеминированный опуxо-левый процесс. Больным с меланомой кожи проведено комплексное лечение, включавшее в себя xирургический, xимиотерапевтический и имму-нотерапевтический компоненты. Больным раком почки проведена паллиативная нефрэкто-мия, иммунотерапия и лучевая терапия. К началу вакцинотерапии методом введения аутологичные опуxолевыx клеток, модифицированные геном tag-?, у всеx больные отмечено выраженное прогрессирование заболевания на фоне стандартные методов лечения. Для создания вакцины использован материал, полученный xирур-гическим путем при удалении метастазов меланомы кожи или во время нефрэктомии. Инъекции трансфецированные облученные опуxоле-вые клеток проводили от і до 8 раз с интервалом в две недели. Клетки вводили внутрикожно и подкожно в четыре точки (паxовую область и область плеча). Минимальная доза составляла 500 тыс. клеток; максимальная — 20 млн клеток.
До лечения, в процессе и после его окончания больным проводили полное обследование, включающее общий и биоxимический анализы крови, исследование свертывающей системы
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №і (іЗ)
крови, рентгенографию органов грудной клетки, а также ультразвуковое исследование, компьютерную томографию (по показаниям) и оценку иммунологического статуса. Иммунологический статус контролировали с использованием моноклональных антител серии ICO, полученных в РОНЦ. Субпопуляцию лимфоцитов крови анализировали на проточном цитофлю-ориметре FACSCalibur (Becton Dickinson). На лимфоцитах периферической крови исследовали уровень экспрессии следующих маркеров: CD3, CD4, CD8, CD16, CD95, CDllb и CD38.
Получение клеточных линий
Опухолевую ткань разделяли механически на фрагменты величиной 2—3 мм3 в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. Клетки культивировали в среде RPMI - 1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). Через 15 пассажей были получены стабильно растущие клеточные линии.
Транзиторная трансфекция клеточных линий
ДЛЯ проведения трансфекции использовали препараты катионных липидов серии Unifectin-21, Unifectin-56, Unifectin-M. Выбор типа и количества липидов осуществляли в предварительных экспериментах по определению максимальной эффективности трансфекции для каждой индивидуальной клеточной линии. Накануне трансфекции клетки засевали в плотности 60— 80 % монослоя. В день трансфекции смешивали ДНК и липиды в необходимых для конкретной клеточной линии пропорциях и инкубировали 30 мин. Полученную трансфекционную
смесь добавляли в культуральную среду клеток, подлежащих трансфекции, и инкубировали 24 ч. Затем трансфецированные клетки снимали с культуральной поверхности с использованием Версена и проводили анализ экспрессии введенных генов методом иммуноблотинга.
Облучение вакцины проводили в суспензии, содержащей 100 тыс. клеток в 0,2 мл среды, в стерильных ампулах, имеющих объем 2,0 мл. Облучение проводили на цезиевой гамма-установке «СтебельЗА» при мощности 5 Гр/мин, при которых клетки получали дозу в 100 Гр.
Результаты и обсуждение
Семи пациентам с диагнозом диссеминированная меланома кожи и двум пациентам с диагнозом диссеминированный рак почки проведена вакцинотерапия аутологичными, трансфеци-рованными геном tag-7, опухолевыми клетками, в виде одной — восьми в/к инъекций с интервалом в две недели.
У двух пациентов отмечено повышение температуры тела до 38°С спустя 24 ч после инъекции, сопровождавшееся ознобом. К концу первых суток температура самостоятельно нормализовалась. У нескольких пациентов в области введения вакцины отмечено покраснение, обусловленное реакцией гиперчувствительности замедленного типа. Повторные введения аутологичных клеток с постепенным увеличением дозы до 20 млн клеток не сопровождались побочными реакциями. Не отмечено влияния на основные показатели периферической крови. Исследование иммунологического статуса после трёх введений позволило выявить положительную динамику активационных маркеров, NK-клеток (рис. 1). У одного пациента с диссеминированной меланомой кожи отмечена стабилизация процесса. Ниже приводим описание клинического случая.
Клинический случай
Пациент П., 35 лет, по поводу диссеминированной меланомы кожи спины (метастазы в под-
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1 (13) 1
мышечные, подключичные, подвздошные л/у слева; метастазы в легкие) получил многочисленные курсы химиотерапии в сочетании с иммунотерапией, без эффекта. Учитывая неэффективность стандартного лечения, пациент был включен в клинический протокол по исследованию безопасности вакцинотерапии аутологич-ными опухолевыми клетками, трансфецирован-ными геном tag-7. С этой целью произведено удаление метастатического лимфатического узла, из материала которого получена клеточная линия, характеризующаяся экспрессией диф-ференцировочного меланомного антигена (HMW— 60,4% антигенположительных клеток); экспрессией молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-A,B,C - 60,9% антигенположительных клеток), а также наличием экспрессии молекулы II класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR —38,5% антигенположительных клеток). Клеточная линия была трансфецирована геном tag-7 и облучена. Уровень эксперессии tag-7 составил более 30%. Через месяц после последнего курса химиотерапии больному начата вакцинотерапия. Минимальная доза на введение составила 500 тыс., максимальная — 1 млн 200 тыс. клеток. Всего 6 инъекций. На протяжении трёх месяцев отмечена стабилизация процесса (отсутствие отрицательной динамики при ультразвуковом исследовании периферических лимфатических узлов
и рентгенологическом исследовании легких). При исследовании иммунологического статуса выявлена активация NK-клеток, определяемых по экспрессии антигена CD16 и CDllb (рис. 2),
Заключение
Проведена I фаза клинического исследования вакцинотерапии с помощью инъекций аутологичных трансфецированных геном tag-7 и инактивированных клеток пациентам с диссеминированными формами рака (меланома кожи и рак почки). Установлена безвредность данного метода (отсутствие токсических проявлений при изучении клинических параметров). Выявлена положительная динамика активационных маркеров, NK-клеток.
Литература
1. Киселев С.Л., Ларин С.С, ГнучевКВ., Георгиев ГП. Ген tag7 и генотерапия рака // Генетика. 2000. Т. 36, № 11. С. 1431-1435.
2. Kiselev S.L., Kustikova O.S., Korobko E. V. et al. Molecular cloning and Characterization of the Mouse tag-7 gene encoding a novel cytokine // J. Biol. Chemistry. 1998. Vol. 273, № 29. P. 18633-18639.
3. Lindemann J., Klein P.A. Viral oncolysis: increased immunogenicity of host cell antigen associated with influenza virus//J. Exp. Med. 1967. Vol. 126. P. 93-108.
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2005. №1 (13)
4. Maio M., Fonsatti E., Lamaj E. et al. Vaccination of stage IV patients with allogeneic IL-4- or IL-2-gene-transduced melanoma cells generates functional antibodies against vaccinating and autologous melanoma cells // Cancer Immunol. Immunother. 2002. Vol. 51, № 1. P. 9-14.
5. Restifo N.P., Esquivel E, Kawakami Y. et al. Identification of human cancers deficient in antigen processing II]. Exp. Med. 1993. Vol. 177. P. 263-272.
6. Rivoltini L., Barracchini K.C., Viggiano V. et al. Quantitative correlation between HLA class I allele expression and recognition of melanjma cells by antigen-specific cytotoxic T lymphocytes//Cancer Res. 1995. Vol. 55. P. 3149-3157.
7. Ruiter D.J., Mattijssen V, Brocker E.B., Ferrone S. MHC antigens in human melanomas // Semin. Cancer Biol. 1991. Vol. 2, №1. P. 35-45.
B.SoifferR, HodiF.S,, Haluska F. et al. Vaccination with irradiated, autologous melanoma cells engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by adenoviral-mediated gene transfer augments antitumor immunity in patients with metastatic melanoma // J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 21, № 17. p. 3343-3350.
9. Sun Y., Jurgovsky K., Moller P. etal. Vaccination with IL-12 gene-modified autologous melanoma cells: preclinical results and a first clinical phase I study // Gene Ther. 1998. Vol. 5, №4. P. 481A90.
Поступила 16.12.04
