CC BY
134
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 >ДК 615.273.53.012
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОЧИСТКИ ПРЕПАРАТОВ ПРОТРОМБИНОВОГО КОМПЛЕКСА
Исеркапов А.ВЛ2, Берковский А.Л.2, Сергеева Е.В.2, Дереза Т.Л.2, Кутюрова О.Г.2, Голубев Е.М.2, Швец В.И.1
Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова, 119571, Москва, Россия; 2ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, Москва, Россия
Резюме. Представлено описание способа вирусной инактивации активированного и полного (неактивированного) протромбиновых комплексов сольвент/детергентным методом, а также стадии их дополнительной очистки методом анионообменной колоночной хроматографии. Входе работы были подобраны условия, позволяющие проводить процесс вирусной инактивации с высокими выходами целевых активностей. Разработанный способ хроматографической очистки позволяет эффективно избавляться от сольвент/детергента, части минорных белков, а также тромбина, образующегося в процессе активации протромбинового комплекса. Данная работа может быть положена в основу обеспечения вирусной безопасности препаратов концентратов активированного и полного протромбиновых комплексов.
Ключевые слова: протромбиновый комплекс, антикоагулянты непрямого действия, шинтирую-щая активность, гемофилия А, вирусная безопасность, хроматография.
ON PURIFICATION OF PROTHROMBIN COMPLEX CONCENTRATES
iserkapov12, BerkovskyA.L.2, Sergeeva E.V.2, Dereza T.L.2, Kutyurova O.G.2, GolubevE.M.2, Shvets V.I.'
'M.V.Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies, Moscow, Russia; hematological Research
Center, Moscow, Russia
Summary. Virus inactivation in activated and total (non-activated) prothrombin complex concentrates by the solvent/detergent method and the stages of their additional purification by anion exchange column chromatography were studied. Conditions were selected forvirus inactivation with high output of the target activities. Chro-matoghraphic purification effectively removed the solvent/detergent, part of minor proteins, and thrombin generated during activation of the prothrombin complex. The results may serve the base for improving the virus safety of concentrated activated and total prothrombin complexes.
Key words: prothrombin complex concentrates, indirect anticoagulants, factor VIII bypass activity, hemophilia A, virus safety, chromatography
В современной медицине важное значение имеют белковые препараты, получаемые путем фракционирования плазмы донорской крови человека [1, 2]. Это - обширная группа препаратов, которая включает в себя факторы свертывания крови и их ингибиторы, иммуноглобулины, альбумин, фибриноген и др. Несмотря на то, что к настоящему времени методами генной инженерии получены рекомбинант-ные аналоги многих из них, их очистка из плазмы не утратила своего значения. Выбор препарата и схемы лечения зависит от индивидуальных показателей пациента, стоимости и доступности того или иного препарата.
Плазменные факторы свертывания крови - это прокоагулянты, активация и взаимодействие которых приводят к образованию фибринового сгустка
Для корреспонденции:
Исеркапов Артем Вакшевич (Iserkapov A.V.), младший научный сотрудник лаборатории фракционирования белков крови и стандартизации методов контроля препаратов плазмы ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, аспирант Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д.4а. Телефон: +7 (495) 935-17-09 E-mail: artemis-kornilov@rambler.ru
Corresponding author:
Iserkapov Artem, junior researcher (artemis-kornilov@rambler.ru).
и остановке кровотечения [2, 3]. В гематологии для лечения нарушений свертывания крови наиболее широко используются концентраты факторов VIII (FVIII) и IX (FIX) для лечения гемофилии А и В соответственно, а также концентраты протромбинового комплекса (КПК).
Основные представители комплексных концентратов факторов свертывания - КПК. Это группа препаратов, содержащих в своем составе витамин К-зависимые факторы свертывания (FII, FVII, FIX, FX), а также регуляторные белки С и S [1,2,4]. По составу КПК подразделяются на 4- и 3-компонентные. Последние не содержат в своем составе фактор свертывания VII. Кроме того, если в схему производства КПК включается специальная стадия активации, то впоследствии он обладает активностью, шунтирующей FVIII, и называется концентратами активированного протромбинового комплекса (аКПК).
КПК с различным количеством FVII широко использовались для лечения гемофилии В, но их постепенно заменили концентраты высокоочищенного FIX [2]. В настоящее время основным показанием для применения концентрата протромбинового комплекса является реверсия эффекта непрямых антикоагулянтов, антагонистов витамина К, в чем они демонстрируют высокую эффективность [4, 5]. Широко используются КПК и за пределами основного
показания. В первую очередь речь идет о тяжелых коагулопатических кровотечениях, сопровождающихся дефицитом протромбинового комплекса, особенно в случае ограничений для использования свежезамороженной плазмы (СЗП) или криосупер-натанта (КСН) (высокий риск объемной перегрузки, синдром острого повреждения легких, обусловленного трансфузиями, отказ пациента от трансфузий).
Выделяют следующие клинические ситуации, при которых наблюдается дефицит витамин К-зависимых факторов [6]: медикаментозные неиммунные влияния антикоагулянтов непрямого действия (варфарин, варфарекс, синкумар, фенилин, синтром, маркумар и др.), геморрагическая болезнь новорожденных, все виды шока, тяжелые травмы, терминальные состояния (в том числе при обильной кровопотере), обту-рационная желтуха (поражения паренхимы печени), тяжелые энтеропатии (особенно у детей в возрасте до 3 лет) и медикаментозные кишечные дисбактериозы, обусловленные длительным применением антибиотиков широкого спектра действия и других антибактериальных препаратов, заболевания печени (инфекционные, токсические, паразитарные, аутоиммунные, цирроз и рак печени), нефротический синдром (потеря витамин К-зависимых белков с мочой), системный амилоидоз - дефицит БХ (сорбция БХ амилоидом), иммунные и аутоиммунные заболевания (образование антител к отдельным факторам свертывания).
Эффективным оказалось использование КПК для реверсии антикоагулянтного эффекта прямого ингибитора активированного БХ (БХа) - ривароксабана [7]. Описаны случаи успешного применения КПК при лечении гепариноподобного синдрома.
Также КПК используется при врожденном дефиците протромбина [2]. Такая патология является редким аутосомно-рецессивным заболеванием, описанным в виде смешанного дефицита БП, БУИ, Б1Х, БХ и протеинов С и 8. Концентраты очищенного протромбина не производятся, коррекция дефицита достигается применением протромбинового комплекса.
Не менее важное значение имеют аКПК. Основным показанием для их применения является инги-биторная форма гемофилии А. Ингибиторные антитела к БУШ образуются у больных гемофилией А в результате заместительной терапии [1, 8-10]. Появление ингибиторов отягощает прогноз заболевания, приводит к снижению эффективности лечения, про-фузным, сочетанным кровотечениям, раннему развитию тяжелой артропатии и инвалидности, уменьшению продолжительности жизни и является основной причиной смерти таких больных. При этом увеличение частоты введений препаратов крови больному и их количества может стать причиной не только резистентности таких больных к этим препаратам, но и усиления кровоточивости после их введения.
Ингибиторы РУШ можно выявить при токсикозах беременных, заболеваниях с ярко выраженным
аутоиммунным компонентом, иногда такие гемофилии возникают в результате возрастных изменений в организме [9, 10]. Содержание ингибиторов может быть настолько велико, что приводит к возникновению приобретенной гемофилии с появлением кровоточивости. Более того, на фоне сопутствующих осложнений приобретенная гемофилия может быть настолько тяжелой, что восстановить гемостаз не удается даже применением всего арсенала современных терапевтических средств.
Сегодня в мире существует достаточное большое количество препаратов КПК, выделенных из плазмы, - Prothromplex-600, ("Baxter", Австрия), Beriplex ("Aventis Behring", Германия), Octaplex ("Octapharma", Австрия), Kaskail ("LFB France", Франция) и др. [4, 11]. Рекомбинантных аналогов таких препаратов не существует, поскольку для их изготовления понадобилось бы организовать производство сразу четырех белков (FII, FVII, FIX и FX), что коммерчески нецелесообразно.
Иначе обстоит дело с препаратами, обладающими шунтирующей активностью. На сегодняшний день на рынке присутствует только два КПК, обладающих шунтирующей активностью: FEIBA ("Baxter", Австрия) и Autoplex Т ("NABI", США) [1, 8-10, 12]. Первый и наиболее широко используемый препарат этого ряда, FEIBA получил название по ожидаемому механизму действия - Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity (активность в «обход» FVIII). Оба препарата содержат FII, FIX, FX преимущественно в неактивированной форме, а также активированный FVII.
Кроме концентратов аКПК, шунтирующей активностью обладают препараты активированного рекомбинантного FVII (rFVIIa). Долгое время единственным в мире выпускаемым rFVIIa был препарат NovoSeven ("Novo Nordisk", Дания) [12]. С 2010 г. в России появился и стал успешно применяться для лечения больных с ингибиторной формой гемофилии первый отечественный препарат rFVIIa - Коагил-VII («ГЕНЕРИУМ», Россия).
Препараты аКПК и rFVIIa имеют разные механизмы запуска системы гемостаза, при этом, каким именно образом это происходит, остается предметом дискуссий [1, 8-10].
Концентраты КПК, аКПК и rFVIIa высокоэффективны и вирусбезопасны, но, к сожалению, весьма дорогостоящи, также следует учитывать, что российских аналогов 4-компонентного КПК и аКПК просто не существует [1-12]. Поэтому важной задачей является разработка технологий производства отечественных аналогов таких препаратов.
Одной из наиболее ответственных стадий при производстве инфузионных фармацевтических препаратов, тем более препаратов, получаемых из донорской плазмы, является стадия вирусной инактивации.
Во второй половине 1980-х годов был разработан и внедрен сольвент/детергентный (S/D-метод) метод
вирусной инактивации, который впоследствии взяли на вооружение многие компании [13-15]. Этот метод является неспецифическим и позволяет инактивиро-вать все вирусы с липидной оболочкой, в частности вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы гепатитов С и В, а также возможные неизвестные вирусы с липидной оболочкой. ВИЧ и вирусы гепатитов В и С являются наиболее патогенными, поскольку имеют относительно сложное строение и легче преодолевают иммунный барьер. Однако S/D-обработка столь действенна, что вирусная нагрузка 1 ООО ООО ООО частиц на 1 мл устраняется менее чем за 2 мин. Тем не менее S/D-обработку для многих препаратов выполняют в течение 4-24 ч, что обеспечивает высокий уровень вирусной безопасности. Применяемые детергенты Tween-80 или Triton-X-100 в сочетании с гидрофобным растворителем три-п-бутилфосфатом (ТпВР) разрушают липопротеиновые оболочки вирусов. Оставшиеся фрагменты нуклеиновых кислот не обладают патогенным свойством и удаляются на последующих этапах очистки препарата.
Многолетний опыт применения сольвент/детер-гентного метода вирусной инактивации доказал его высокую эффективность отсутствием у больных, получающих препараты, ВИЧ-инфекции и гепатитов В и С [13-15]. В настоящее время S/D-метод является наиболее надежным способом обеспечения вирусной безопасности препаратов.
Тепловой способ вирусной инактивации применяется на лиофилизированных препаратах для воздействия на оболочечные вирусы (ВИЧ, гепатиты В и С) и на вирусы, не имеющие оболочек (гепатит А, парвовирус В19) [13, 14]. Эффективность данной вирусной инактивации зависит от комбинации нескольких факторов воздействия на вирус: температурного режима, экспозиции установленной температуры, физического состояния препарата, содержания соли, природы и концентрации стабилизатора. Последний необходим для сохранения качества и гемостатиче-ской активности препарата. Тепловой режим варьирует от 60 до 100°С, экспозиция - от 30 мин до 72 ч. В настоящее время многие фирмы применяют так называемый «тепловой шок»: температурный режим 100°С в течение 30 мин. Например, компания "Baxter" обеспечивает вирусную безопасность препаратов FEIBA и Prothromplex-T так называемым 8-Т1М4-методом, который заключается в обработке лиофилизата паром при температуре 60°С и давлении 190 мбар в течение 10 ч и затем паром при температуре 80°С и давлении 375 мбар в течение 1 ч [1].
Нарушения в технологической цепочке тепловой вирусной инактивации повышают опасность разрушения белков и снижают эффективность препарата [13]. Кроме того, имеются опасения, что денатурированные белки обладают повышенной иммуногенно-стью и увеличивают риск образования ингибитора, что может быть зарегистрировано при появлении ингибитора у нескольких больных, получающих дан-
ную партию препарата, или при проведении теста на фармако кинетику.
Помимо S/D-метода и тепловой обработки, третьим неспецифическим методом инактивации вирусов является нанофильтрация, нацеленная на без-оболочечные вирусы [16]. Это весьма действенный метод, хотя он и уступает по эффективности S/D-обработке. С другой стороны, патогенность безобо-лочечных вирусов не так высока, и они преимущественно передаются пероральным и воздушно-ка-пельным путями.
Нередко производители препаратов плазмы комбинируют вышеупомянутые способы обеспечения вирусной безопасности.
Целью настоящей работы являлось изучение способа вирусной инактивации КПК и аКПК, а также последующей стадии хроматографической очистки КПК и аКПК для удаления сольвент/детергента, части минорных белков, а также тромбина, который образуется в процессе активации протромбинового комплекса.
Материалы и методы
В качестве исходного сырья использовали СЗП человека, полученную в отделении заготовки крови и ее компонентов Гематологического научного центра Минздрава России (Москва). СЗП заготавливали согласно «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафе-реза», утвержденной Минздравом России 23.09.2002. Аттестацию проводили в соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови», утвержденной Минздравом России 29.05.1995 и дополнениями к ней от 02.08.1999. Сорбцию КПК проводили из КСН, полученного в процессе первичного криофракционирова-ния СЗП по методу J. Newman [2].
Первый этап очистки 4-компонентного концентрата протромбинового комплекса из КСН осуществляли методом анионообменной хроматографии в объеме (batch-метод) с использованием QAE-Sephadex А50 ("GE Healthcare", США).
Колоночную анионообменную хроматографию проводили с помощью системы АКТА Explorer 100 с программным обеспечением Unicorn (версия 5.1), хроматографиче-ских колонок ХК16/20 ("GE Healthcare", США).
Специфическую активность FII, FVII, FIX, FX (в ME) измеряли одностадийным коагулологическим методом на анализаторе MC 4 PLUS ("Merlin Medical", Германия) [17, 18]. Для проведения коагулологических измерений использовали плазму-калибратор, аттестованную по активности FII, FVII, FIX и FX, плазмы субстратные дефицитные по FII, FVII, FIX и FX, тромбопластин (очищенный экстракт мозга кроликов), реагент для определения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ-реагент), содержащий эрилид (фосфолипи-ды мембран эритроцитов) и 0,5% суспензию каолина в физиологическом растворе. Для разведения исследуемых образцов использовали имидазоловый буфер. Проверку правильности построения калибровочных прямых осуществляли с помощью контрольной плазмы (плазма крови человека с нормальным уровнем параметров
системы гемостаза). Все реагенты производства НПО «РЕНАМ» (Россия).
Измерение шунтирующей активности препарата FEIBA также проводили методом коагулометрии. По международным требованиям за одну единицу шунтирующей FVIII активности аКПК принимается такое количество препарата, которое в тесте АЧТВ уменьшает время свертывания плазмы с высоким уровнем содержания ингибиторов FVIII в 2 раза [1]. В соответствии с этим определением в кювете коагулометра смешивали по 50 мкл плазмы, содержащей ингибиторы FVIII, соответствующего разведения препарата, обладающего шунтирующей активностью, АЧТВ-рсагснта и после прогрева при 37°С добавляли 35 мМ раствор хлорида кальция. Измеряли время от момента добавления раствора хлорида кальция до момента образования сгустка. Шунтирующую активность препарата аКПК определяли по калибровочному графику, построенному с использованием ряда последовательных разведений стандарта с известной активностью.
Активность тромбина в процессе активации протром-бинового комплекса и в препаратах, обладающих шунтирующей активностью, определяли, смешивая в кювете коагулометра по 100 мкл раствора фибриногена с концентрацией 2 мг/мл и соответствующего разведения препарата [17, 18]. Измеряли время от момента добавления препарата до момента образования сгустка. Активность тромбина определяли по калибровочному графику, построенному с использованием последовательных разведений стандарта тромбина с известной активностью.
Концентрацию общего белка определяли методом Бред форда [ 17,18] на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro («GE HealthCare», США). В качестве калибратора использовали раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60 г/л (ООО «Агат-Мед», Россия).
Молекулярно-массовое распределение в полученных КПК и аКПК изучали методом SDS-электрофореза на по-лиакриламидном геле в градиенте 4-15%. Использовали систему для электрофореза Fast System («GE HealthCare», США).
Экспериментальная часть
Получение концентрата протромбинового комплекса методом хроматографии в объеме с помощью QAE-Sephadex А50
СЗП (75 л) размораживали при температуре 35°С при непрерывном перемешивании, после того как температура смеси достигала 0-4°С, криопреципитат отделяли проточным центрифугированием при 4000 об/мин при температуре 0°С. рН полученного КСН до 7,6 доводили 1М гидроксидом натрия, затем к КСН медленно при перемешивании добавляли сухой QAE-Sephadex А50 из расчета 1,5 г/л КСН, суспензию перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Сорбент отделяли на колонне и промывали 9 л буфера А (80 мМ NaCl, 20 мМ CitNa3, рН7,6), протромбиновый комплекс элюировали 9 л буфе-раВ (500 MMNaCl, 20 мМ CitNa3, рН 7,6), элюат концентрировали и диализовали против буфера С (100 мМ NaCl, 20 мМ Tris, рН 7,6) до конечного объема 1500 мл. Полученный концентрат протромбинового комплекса разливали по 150 мл в полимерные контейнеры и затем замораживали при температуре -40°С.
Активация протромбинового комплекса действием сверхнизких концентраций ионов кальция
320 мл КПК, полученного с помощью QAE-Sephadex А50, размораживали при температуре 35°С, затем к КПК при перемешивании добавляли 25 мМ СаС12 таким образом, чтобы конечная концентрация свободных ионов кальция составила 0,85 мМ. Раствор инкубировали при непрерывном перемешивании при pH 7,6 и температуре 15°С в течение 24 ч. После этого свободные ионы кальция связывали добавлением при перемешивании 3-кратного избытка 1,1 М CitNa3, осадок цитрата кальция, а также образовавшиеся в процессе активации сгустки отделяли центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Концентрат активированного протромбинового комплекса разделяли на образцы по 20 мл, которые замораживали при температуре -40°С.
Изучение условий вирусной инактивации КПКиаКПК
Для изучения процесса вирусной инактивации образцы КПК и аКПК размораживали при температуре 35°С, к ним при перемешивании добавляли сухой лизин до конечной концентрации 10 мМ в сочетании с сухим глицином до конечной концентрации 0,1, 0,2 или 0,3 М, к этим образцам после растворения аминокислот, а также к образцу, не содержащему стабилизаторы, добавляли 11% Tween 80 до конечной концентрации 1% и ТпВР до конечной концентрации 0,3%, вирусную инактивацию проводили при непрерывном перемешивании при комнатной температуре, аликвоты отбирали через 6 и 16 ч.
Изучение стадии очистки аКПК методом колоночной хроматографии
100 мл КПК, полученного с помощью QAE-Sephadex А50, активировали, после чего аКПК подвергали вирусной инактивации в течение 6 ч (все стадии были описаны ранее), полученный таким образом вирусбезопасный активированный протромбиновый комплекс разделяли на аликвоты по 20 мл, которые замораживали при температуре -40°С.
Колонку заполняли 20 мл геля (Toyopearl GigaCap Q-650M или Capto Q), сорбент уравновешивали буфером D (ОД М NaCl, 0,02 М CitNa3, 0,02 М Tris), после чего на него со скоростью 60 см/ч наносили 15 мл аКПК. Для удаления не связанных белков сорбент промывали 40 мл буфера D (ОД М NaCl, 0,02 М CitNa3, 0,02 М Tris), затем 120 мл буфера Е (0,14 М NaCl, 0,02 М CitNa3), десорбцию концентрата активированного протромбинового комплекса проводили 40 мл буфера С, сорбент подвергали регенерации.
Изучение стадии очистки 4-компонентного КПК методом колоночной хроматографии
100 мл КПК, полученного с помощью QAE-Sephadex А50, подвергали вирусной инактивации в течение 6 ч (все стадии описаны ранее), полученный таким образом вирусбезопасный протромбиновый комплекс разделяли на аликвоты по 20 мл, которые замораживали при температуре -40°С. Хроматографическую очистку образцов 4-ком-понентного КПК объемом 20 мл проводили, так же как и в предыдущем примере.
Таблица 1
Состав 4-компонентного КПК, полученного с помощью QAE-Sephadex А50
Параметр FII FVII FIX FX FEIBA
Активность, МЕ/мл 37 31 38 40 0,02
Выход, % 91 78 92 94 -
Удельная активность, ME в 1 мг белка 0,97 0,8 1 1,03 -
Результаты и обсуждение
Для изучения способа и условий вирусной инактивации аКПК и КПК нами был получен 4-компо-нентный КПК методом анионообменной хроматографии в объеме (batch-метод) на QAE-Sephadex А50. Состав протромбинового комплекса приведен в табл. 1. В выбранных условиях удается получить КПК, содержащий практически равные количества FII, FIX, FX (по 37-40 МЕ/мл) и несколько меньшее количество FVII (22 МЕ/мл).
Часть полученного КПК была подвергнута активации под действием сверхнизких концентраций ионов кальция. Такой подход позволяет сгенерировать значительное количество шунтирующей FVII активности (58,1 МЕ/мл), однако данный метод сопряжен с образованием нежелательного продукта тромбина (101,3 МЕ/мл), содержание которого в конечном препарате аКПК допускается только в незначительном количестве (менее 0,05 МЕ/мл).
Изучение стадии вирусной инактивации аКПК
Вирусную инактивацию было решено проводить S/D-методом, поскольку он является наиболее надежным из всех существующих на сегодняшний день способов. Кроме того, процедура вирусной инактивации S/D-методом очень проста и хорошо отработана в рамках пилотного производства ГНЦ Минздрава России (Москва).
В качестве детергента к образцам добавляли 11% Tween 80 (полисорбат 80) до конечной концентрации 1%, в качестве гидрофобного растворителя (сольвента) - три-п-бутилфосфат (ТпВР) до конечной концентрации 0,3%. Процесс проводили при непрерывном перемешивании при комнатной температуре, алик-воты отбирали через 6 и 16 ч. В соответствии с данными литературы в качестве защитных агентов был выбран лизин в концентрации 0,01 М в сочетании с различными количествами (0,1, 0,2 и 0,3 М) глицина,
такой способ «защиты» хорошо зарекомендовал себя и, в частности, используется при производстве FVIII на пилотном производстве ГНЦ (Москва).
В ходе экспериментов (п = 4) оценивали падение шунтирующей FVII активности аКПК в зависимости от наличия и концентрации добавок, а также от времени проведения процесса (табл. 2).
Установили, что добавление 0,01 М Lis в сочетании с 0,1 М Gly позволяет сохранить 88,1 ± 3,2% шунтирующую FVII активность аКПК при проведении процесса в течение 6 ч и 83,6 ± 4% при проведении процесса в течение 16 ч. При этом увеличение концентрации глицина не приводит к снижению падения активности. Вирусная инактивация аКПК в отсутствие добавок приводит к уменьшению шунтирующей активности аКПК до 81,3 ± 4,3% от первоначального количества при проведении процесса в течение 6 ч и до 68,7 ± 6,7% при проведении процесса в течение 16 ч.
Разработка стадии вирусной инактивации неактивированного КПК
Вирусную инактивацию 4-компонентного КПК проводили по методике, описанной выше для активированного протромбинового комплекса. В ходе опытов (п = 4) оценивали уменьшение активности FII, FVII, FIX и FX.
Наилучшие результаты были достигнуты, благодаря применению в качестве защитных агентов 0,01 М Lis в сочетании с 0,2 М Gly. Данные стабилизаторы позволяют сохранить 88,9 ± 5,1% активности FII, 90,1 ± 3,5% активности FVII, 88,7 ± 5,7% активности FIX и 89,3 ± 5,7% активности FX при проведении процесса в течение 6 ч, при этом за 16 ч активность факторов протромбинового комплекса снижается до 80-85% от первоначального количества. Увеличение концентрации глицина не приводит к снижению падения активности. Вирусная инактивация в отсутствие добавок приводит к потере
Таблица 2
Влияние наличия и концентрации добавок, а также времени проведения процесса вирусной инактивации на уменьшение
шунтирующей активности
Шунтирующая активность исходного образца аКПК 58,1 МЕ/мл
Стабилизатор - 0,1 М Gly + 0,01М Lys 0,2 М Gly + 0,01 М Lys 0,3 М Gly + 0,01 М Lys
Перемешивание: Выход, %
6ч 81,3 ±4,3 88,1 ±3,2 82,6 ±3,8 85 ±3
16ч 68,7 ± 6,7 83,6 ±4,0 78,7 ±4,1 80,4 ± 2,4
активности по всем четырем факторам до 70-80% при проведении процесса в течение 6 ч и до 45-60% при проведении процесса в течение 16 ч.
Изучение стадии очистки аКПК методом колоночной хроматографии
Протромбиновый комплекс, полученный на QAE-Sephadex А50 batch-методом (см. табл. 1), активировали, после чего проводили его вирусную инактивацию в течение 6 ч, все стадии описаны выше. Таким образом, был получен вирусбезопасный образец аКПК, шунтирующая активность которого составляла 51,1 ME/мл, а содержание тромбина равнялось 86,8 МЕ/мл.
Для изучения стадии очистки аКПК методом колоночной хроматографии были выбраны сорбенты Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q. Типичная хро-матограмма процесса очистки аКПК представлена на рис. 1, результаты хроматографии с использованием обоих сорбентов приведены в табл. 3.
Таким образом, серия экспериментов показывает, что оба сорбента имеют примерно равную емкость по шунтирующей активности (32-35 ME/мл геля). Концентраты аКПК, очищенные с помощью обоих сорбентов, также имеют практически одинаковую удельную шунтирующую активность (примерно 1,78 МЕ/мг белка), при этом тромбин в целевой фракции не обнаруживается. На рис. 2 представлена электрофореграмма, на который сравниваются молекулярные составы КПК, после активации (аКПК), образцы аКПК, очищенные с помощью Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q (треки 1 и 2 соответственно), и коммерческого препарата аКПК (FEIBA). Как видно, молекулярные составы аКПК, полученных с помощью обоих сорбентов, и коммерческого препарата FEIBA идентичны. Основные пики всех нанесенных образцов находятся в области 50-80 кД, что, как отмечено выше, соответствует факторам протромбинового комплекса и ряду минорных белков. Также во всех образцах присутствуют примесные белки с молекулярной массой 20, 40 и 220 кД.
V, мл
Рис. 1. Хроматограмма очистки аКПК с помощью сорбентов Toyopearl GigaCap
Q-650M и Capto Q. 1 - фракция, не связанная с гелем (проскок); 2 - промывка стартовым буфером (0,08 М NaCl); 3 - промывка 0,14 М NaCl; 4 - целевая фракция (0,5 М NaCl); 5 - регенерация (1,0 М NaCl).
Следует отметить наличие пика в области 100 кД на треках FEIBA, аКПК, 1 и 2, который отсутствует на треке концентрата неактивированного КПК. Вероятно, наличием данного компонента смеси и обусловливается шунтирующая активность.
Изучение стадии очистки неактивированного КПК методом колоночной хроматографии
Концентрат вирусбезопасного 4-компонентно-го протромбинового комплекса (FII 33,1 МЕ/мл, FVII 28,6 МЕ/мл, FIX 34,2 МЕ/мл, FX 35,9 МЕ/мл), полученный по вышеописанным методикам, очищали колоночной хроматографией с помощью сорбентов Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q. Результаты серии экспериментов (табл. 4) показывают, что емкость обоих сорбентов составляет примерно 25 МЕ FVII/мл геля, при этом достигаются высокие выходы по всем факторам протромбинового комплекса, их удельная активность более 1 МЕ/мг белка, а соотношение близко к 1:1:1:1. Результаты электрофореза (рис. 3) подтверждают сходство молекулярного состава 4-компонентно-го КПК, полученного с использованием данных сорбентов (трек 1-Toyopearl GigaCap Q-650M, трек 2-Capto Q), и коммерческого препарата протромбинового комплекса (трек 0). На электрофо-реграмме наблюдаются пики целевых белков в области 50—80 кД, а также пики примесных белков в областях 20, 40 и 220 кД.
Таблица 3
Составы концентратов аКПК, очищенного с помощью Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q (л = 4)
Сорбент
Измеряемый Toyopearl GigaCap Q-650 Capto Q
FEIBA Fila FII FVII/ FVIIa FIX FX FEIBA Fila FII FVII/ FVIIa FIX FX
Активность, МЕ/мл 16.8 ± 0.8 0 12.4 ± 0.8 10.3 ± 0.5 12.4 ± 0.6 13.1 ± 0.4 17.2 ± 0.7 0 12.6 ± 0.7 10.3 ± 0.7 12.8 ± 0.5 13.2 ± 0.9
Удельная активность, МЕ/мг белка 1.79 ± 0.11 - 1.32 ± 0.12 1.21 ±0.1 1.32 ± 0.14 1.4 ± 0.1 1.77 ± 0.14 - 1.31 ± 0.15 1.25 ± 0.14 1.28 ± 0.14 1.37 ± 0.15
Выход, % 87.7 ± 4.1 - 87.6 ± 5.5 87.9 ± 4.4 85.5 ± 4.4 87.1 ± 2.5 87.7 ± 4.7 - 89.1 ± 5.0 89.9 ± 4.1 88.3 ± 2.4 87.4 ± 5.8
Ст. FEIBA PPSB аРСС 1 2
Рис. 2. Элекгрофореграмма хроматографической очистки аКПК с помощью сорбентов Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q.
кДа 220 —
170 — 116 —
76 — 53 —
31 —
em
iE
м
Ст.
PPSB 1
Рис. 3. Элекгрофореграмма хроматографической очистки КПК с помощью сорбентов Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q.
Таблица 4
Составы концентратов 4-компонентного КПК, очищенного с помощью сорбентов Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q (и = 4)
Сорбент
Измеряемый параметр Toyopearl GigaCap Q-650M Capto Q
FII FVII FIX FX FII FVII FIX FX
Активность, МЕ/мл 14.7 ± 0.6 12.6 ± 0.5 15 ±0.6 15.9 ± 0.8 14.6 ± 0.7 12.8 ±0.6 15.1 ±0.9 15.8 ±0.8
Удельная активность, МЕ/мг белка 1.3 ±0.14 1.23 ± 0.11 1.32 ± 0.12 1.38 ± 0.12 1.29 ± 0.14 1.24 ±0.12 1.3 ±0.14 1.37 ±0.12
Выход, % 88.9 ± 3.5 88.2 ± 3.6 87.9 ± 3.3 88.4 ± 4.3 88.3 ±4.1 89.7 ± 4.4 88.5 ±5.1 87.8 ± 4.2
Выводы
• Разработана стадия вирусной инактивации аКПК S/D-методом, подобраны стабилизаторы (0,01 M Lys + 0,1 M Gly), позволяющие сохранить 88,1 ± 3,2% шунтирующей активности при проведении процесса в течение 6 ч и 83,6 ± 4% при проведении процесса в течение 16 ч.
•Разработана стадия вирусной инактивации 4-компонентного КПК S/D-методом, подобраны стабилизаторы (0,01 M Lys + 0,2 M Gly), позволяющие сохранить порядка 90% активности FII, FVII, FIX и FX при проведении процесса в течение 6 ч и порядка 80% при проведении процесса в течение 16 ч.
• Для удаления сольвент/детергента и дополнительной очистки от минорных белков была разработана дополнительная стадия очистки аКПК и неактивированного 4-компонентного КПК колоночной хроматографии с использованием сорбентов Toyopearl GigaCap Q-650M и Capto Q. Данная
стадия в случае производства активированного протромбинового комплекса позволяет полностью избавиться от тромбина. Динамическая емкость этих сорбентов по шунтирующей активности составляет 30-35 МЕ/мл геля, по FVII системы гемо-коагуляции порядка 25 МЕ/мл геля.
Результаты получены е решках Государственного задания Мннобрнаукн Российской Федерации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bertolini .Т., Goss N., Curling J. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. Hoboken. New Jersey: Mm Wiley & Sons, Inc.; 2012.
2. Русанов B.M., Левин И. Лечебные препараты крови. М.: Медпрактика; 2004.
3. Gumulec .Т., Kessler P., Prochazka V., Brejcha М., Penka М., Zanger М., et al. Bleeding complications of anticoagulant therapy. Vnitr. Lek. 2009; 55(3): 277-89.
4. Буланов А.Ю., Прасолов Н.В. Средства фармацевтического гемостаза в современной клинической практике. Тольят-тинский медицинский консилиум. 2013; 3^1: 25-30.
5. Vang M.L., Hvas A.M., Ravn Н.В. Urgent reversal of vitamin К antagonist therapy. Acta. Anaesthesiol. Scand. 2011; 55(5): 507-16.
6. СухановаГ.А.,ВдовинВ.В., СвиринП.В. Применение препарата протромплекс (протромбиновый комплекс) для лечения и профилактики кровотечений. Тольяттинский медицинский консилиум. 2011; 3^1: 16-8.
7. Eerenberg E.S., Kamphuisen P.W., Sijpkens М.К., Meijers J.C., Buller H.R., Levi M. Reversal of rivaroxaban and dabigatran by prothrombin complex concentrate: a randomized, placebo-con-trolled, crossover study in healthy subjects. Circulation. 2011; 124(14): 1573-9.
8. Ананьева H.M., Лакруа-Демаж С., Ованесов М.В., ШимаМ., Атауллаханов Ф.И., Саенко E.JL Ингибиторы при гемофилии А. Часть 2. Современные клинические подходы для нейтрализации их действия. Гематология и трансфузиология. 2005; 6: 21-9.
9. Webert К.Е. Acquired hemophilia A. Semin. Thromb. Hemost. 2012; 38(7): 735^1.
10. Franchini M., Mannucci RM. Hemophilia A in the third millennium. Blood. Rev. 2013; 27(4): 179-84.
11. Kalina U., Bickhard H., Schulte S. Biochemical comparison of seven commercially available prothrombin complex concentrates. Int. J. Clin. Pract. 2008; 62(10): 1614-22.
12. Зоренко В.Ю., Полянская Т.Ю., Галстян Г.М., Сампи-ев М.С., Северова Т.В., Коняшина Н.И. и др. Опыт применения препарата Коагил-VII при ортопедических операциях у больных с ингибиторной гемофилией А. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011; 3: 35-40.
13. Вдовин В.В. Вирусная безопасность концентратов факторов свертывания крови для лечения гемофилии на современном этапе. Ремедиум. 2009; 3: 16-20.
14. Cai К., Gierman Т.М., Hotta J., Stenland C.J., Lee D.C., Pi-fat D.Y., Petteway S.R. Jr. Ensuring the biologic safety of plas-ma-derived therapeutic proteins: detection, inactivation, and removal of pathogens. BioDrugs. 2005; 19(2): 79-96.
15. Schneider T. Therapeutic plasmas. Transfus. Clin. Biol. 2012; 19(4-5): 148-9.
16. Burnouf Т., Radosevich M. Nanofiltration of plasma-derived bio-pharmaceutical products. Haemophilia. 2003; 9(1): 24-37.
17. Козлов A.A., Берковский A.JI., Качалова H.Д., Сергеева Е.В., Простакова Т.М., Фунт В.А. Диагностические наборы и реагенты для гемоглобинометрии и исследования системы гемостаза: сборник инструкций. М.: НПО «РЕНАМ»; 2010.
18. Козлов А.А., Натрус Л.В., Черновол П.А., Мелкумян А.Л., Простакова Т.М., Коноплянко В.А. и др. Лабораторная диагностика системы гемостаза. М.: Литера; 2011.
Поступила 30.05.14
REFERENCES
1. Bertolini J., Goss N., Curling J. Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use. Hoboken. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.; 2012.
2. Русанов B.M., Левин И. Лечебные препараты крови. М.: Медпракгика; 2004.
3. Gumulec J., Kessler P., Prochazka V., Brejcha M., Penka M., Zanger M., et al. Bleeding complications of anticoagulant therapy. Vnitr. Let 2009; 55(3): 277-89.
4. Bulanov A.Yu., Prasolov N.V. Means pharmaceutical hemostasis in modern clinical practice. Tol'yattinskiy meditsinskiy konsili-um. 2013; 3^1: 25-30. (in Russian)
5. Vang M.L., Hvas A.M., Ravn H.B. Urgent reversal of vitamin К antagonist therapy. Acta. Anaesthesiol. Scand. 2011; 55(5): 507-16.
6. Sukhanova G.A., Vdovin V.V., Svirin P.V. Use of the medicine prothromplex (prothrombin complex) for the treatment and prevention of bleeding. Tol'yattinskiy meditsinskiy konsilium. 2011; 3^1: 162-8. (in Russian)
7. Eerenberg E.S., Kamphuisen P.W., Sijpkens M.K., Meijers J.C., Buller H.R., Levi M. Reversal of rivaroxaban and dabigatran by prothrombin complex concentrate: a randomized, placebo-con-trolled, crossover study in healthy subjects. Circulation. 2011; 124(14): 1573-9.
8. Ananieva N.M., Lakrua-Demazh S., Ovanesov M.V., Shima M., Ataullakhanov F.I., Saenko E.L. Inhibitors in the hemophilia A. Part 2. Current clinical approaches to neutralize their action. Gematologiya i transfuziologiya. 2005; 6: 21-9. (in Russian)
9. Webert K.E. Acquired hemophilia A. Semin. Thromb. Hemost. 2012; 38(7): 735^1.
10. Franchini M., Mannucci P.M. Hemophilia A in the third millennium. Blood. Rev. 2013; 27(4): 179-84.
11. Kalina U., Bickhard H., Schulte S. Biochemical comparison of seven commercially available prothrombin complex concentrates. Int. J. Clin. Pract. 2008; 62(10): 1614-22.
12. Zorenko V.Yu., Polyanskaya T.Yu., Galstyan G.M., Sampiev M.S., Severova T.V., KonyashinaN.I., et al. Experience with the drug COAGIL-VII in orthopedic surgeries in patients with the inhibitory hemophilia A. Voprosy gematologii/onkologii i immunopatologii vpediatrii. 2011; 3: 35^10. (in Russian)
13. Vdovin V.V. Viral safety of clotting factor concentrates for the treatment of hemophilia at the present stage. Remedium. 2009; 3: 16-20. (in Russian)
14. Cai K., Gierman T.M., Hotta J., Stenland C.J., Lee D.C., Pifat D.Y., Petteway S.R. Jr. Ensuring the biologic safety of plasma-derived therapeutic proteins: detection, inactivation, and removal of pathogens. BioDrugs. 2005; 19(2): 79-96.
15. Schneider T. Therapeutic plasmas. Transfus. Clin. Biol. 2012; 19(4-5): 148-9.
16. Burnouf T., Radosevich M. Nanofiltration of plasma-derived bio-pharmaceutical products. Haemophilia. 2003; 9(1): 24-37.
17. Kozlov A.A., Berkovskiy A.L., Kachalova N.D., Serge-eva E.V., Prostakova T.M., Funt V.A. Diagnostic kits and reagents for hemoglobinometry and research hemostatic system: sbornik instruktsiy. Moscow: NPO RENAM; 2010. (in Russian)
18. Kozlov A.A., Natrus L.V., Chernovol PA., Melkumyan A.L., Prostakova T.M., Konoplyanko V.A., et al. Laboratory diagnosis of the hemostatic system. Moscow: Litera; 2011. (in Russian)
Received 30.05.14
