CC BY
51
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616. 37-089. 87. 843-032:611.41-081-013.7.8-092.9
© В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, СВ. Сибиряк, М.М. Саяпов, М.Н. Саубанов, А.С. Кулушев, 2007
В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, СВ. Сибиряк,
М.М. Саяпов, М.Н. Саубанов, А.С. Кулушев ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНСУЛИНОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПУТЕМ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР СЕЛЕЗЕНОЧНОЙ ТКАНИ ГОУВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Исследования в эксперименте на 200половозрелых крысах с моделированием панкреатэктомической и аллоксановой инсулиновой недостаточности и проведение у них аутотрансплантации селезеночной ткани и аллогенной имплантации клеточных культур селезенки эмбриона и взрослой крысы позволили авторам предположить о существовании возможности коррекции инсулиновой недостаточности клеточными культурами селезеночной ткани. С позиции современных исследований в области клеточных технологий в медицине аутотрансплантацию селезеночной ткани авторы рассматривают как вариант восстановительной терапии стромальныйи стволовыми клетками селезенки и предполагают о существовании причинно-следственной связи между аутотрансплантацией селезеночной ткани и возможностью дифферен-цировки стволовых клеток имплантата в необходимые организму клеточные структуры, то есть, в данном исследовании в инсулинопродуцирующие клетки в условиях in vivo. Аллогенная трансплантация клеточных культур эмбриональной и соматической селезеночной ткани в большинстве случаев позволила добиться коррекции инсулиновой недостаточности при экспериментальной аллоксановой инсулиновой недостаточности. Выполненное исследование позволило авторам предположить о возможности наличия в селезенке значительного запаса полипотентных стволовых клеток.
Ключевые слова: селезеночная ткань, клеточная культура, инсулиновая недостаточность, трансплантация, стволовая клетка, лабораторные крысы, эксперимент, аллоксан, панкреатэктомия.
V.M. Timerbulatov, R.R. Fayazov, S.V. Timerbulatov, S.V. Sibiryak,
M.M. Sayapov, M.N. Saubanov, A.S. Kulushev POSSIBILITIES OF CORRECTION EXPERIMENTAL INSULIN INSUFFICIENCY WITH TRANSPLANTATION OF CELL CULTURE FROM SPLEEN TISSUE
An author has experience of correction experimental insulin insufficiency with somatic or embryonic cells transplantation from spleen tissue on 200 rats with pancreaectomic or alloxane insulin insufficiency. Authors conclude about relation between autotransplantation with culture of spleen cells and differentiation of embryonic stem cells to islet cells in vivo and it can be helpful as a variant of recovery therapy. Allogenic transplantation with culture of embryonic or somatic cellsfrom spleen tissue can correct insulin insufficiency under experimental alloxane insulin insufficiency. This research can help authors to suppose about important reserves of polypothentic stem cells in spleen.
Key words: spleen, insulin insufficiency, transplantation, stem cells, rats, alloxane, pancreaectomy.
В хирургической практике аутотрансплантацию селезеночной ткани (ACT) можно рассматривать как вариант восстановительной терапии стромальными стволовыми клетками селезенки [1, 5, 8, 9, 14, 19, 20]. Для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах и тканях различного фенотипа возможно использование селезеночной ткани, которой присущи не только иммуногенетиче-ская, но и морфогенетическая функции [1, 5,
6, 8, 9, 14]. Проведенное нами экспериментальное исследование на лабораторных животных с моделированной панкреатэктомиче-ской и аллоксановой инсулиновой недостаточностью (ИН) показало, что ACT в ряде случаев позволяет достичь стойкой стабилизации показателей сахара крови [5, 9, 14]. В ходе последующих этапов исследования нами был рассмотрен вопрос относительно возможности и эффективности использования клеток селезеночной ткани в целях коррекции ИН.
Материалы и методы
Исследование в эксперименте на животных выполнено на 200 белых половозрелых крысах линии Wistar с моделированием панкреатэктомической и аллоксановой ИН. Уровень сахара в крови определяли 2 раза в сутки глюкометром «One touch ultra» (США), в моче - в лабораторных условиях. Пол животных не учитывался. В хроническом опыте коррекция ИН проводилась однократным введением в сутки препарата «Хумулин» подкожно, в расчете 0,5 ЕД/кг массы тела животного (препарат предварительно разбавляли 100 мл физиологического раствора). В ходе эксперимента по мере необходимости производилась подсадка самок к самцам с целью оплодотворения. На 12-14-е сутки беременности под эфирным наркозом крысам производились лапаротомия и извлечение плодов из матки, далее плодам выполнялась лапарото-мия, и производился забор селезенки. С соблюдением правил асептики селезенка эмбриона направлялась в лабораторию для куль-
тивирования.
Панкреатэктомическую ИН у 50 крыс (1-я группа) вызывали путем тотального удаления поджелудочной железы и селезенки под эфирным наркозом. При этом в целях изучения возможности профилактики ИН выполняли аутотрансплантацию Уг части селезенки в виде фрагментов размерами 0,3 х 0,3 х 0,3 см, с имплантацией их в большой сальник. Оставшаяся часть селезеночной ткани обрабатывалась в среде 199 с добавлением антибиотиков и с соблюдением правил асептики направлялась в проблемную научноисследовательскую лабораторию трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» для выделения и последующего культивирования жизнеспособных клеток селезенки по общепринятой методике [3, 11, 16]. С целью извлечения аутотрансплантатов для исследования их клеточной структуры на 7-ые сутки 5 крыс подверглись острому опыту.
Культивирование клеток селезеночной ткани производилось в проблемной научноисследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» по следующей схеме: после механического диспергирования селезеночную ткань помещали в колбу с раствором трипсина с последующей трип-синизацией в магнитной мешалке при нагревании до 37°С, в течение 3-х минут. Затем проводили отмывание селезеночных клеток с помощью центрифугирования (10 минут при 1500 оборотов/мин.). Отмытые клетки селезенки культивировали в течение 7 суток в среде ДММ с добавлением 5% раствора эмбриональной сыворотки («Биолот» (Санкт-Петербург)) в термальной комнате. Ежедневный мониторинг за культурой клеток осуществлялся при помощи инвертированного микроскопа с программным обеспечением фирмы DMIL «Leica» (Германия).
Экспериментальную аллоксановую ИН у 150 крыс (2-я группа) вызывали путем однократного подкожного введения 5% водного раствора аллоксана из расчета 125 мг/ кг массы тела животного на фоне 24-48-часового голодания [2, 9]. Данной группе животных на 7-е сутки после начала эксперимента вводили аллогенный клеточный материал в двух вариантах. Группу 2А составили 60 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из селезеночной ткани 14-суточного эмбриона. Группу 2В составили 90 крыс, которым вводился аллогенный клеточный материал, культивированный из части
удаленной селезеночной ткани. Клеточный материал в количестве 1 мл, что соответствует 1 млн. клеток, вводился с помощью инъекции в хвостовую часть лабораторного животного. Проведенное исследование в данной группе предполагало получить ответ на возможность коррекции экспериментальной ИН путем использования клеточных культур селезеночной ткани. Необходимо отметить, что во 2-й группе заместительная коррекция ИН проводилась до введения клеточной культуры, а в 1-й группе - в послеоперационном периоде (в первые 2-3 недели), после,чего она отменялась.
Для выяснения возможности выживания и фенотипических особенностей аутогенных спленоцитов, реимплантированных в брюшную полость у 5 крыс 1-ой группы, на 7ые сутки проводили релапаротомию, извлекали фрагменты, измельчали их в стеклянном гомогенизациторе в растворе СеИ^а^ВБ) и осуществляли окрашивание и цитометрию. Для выяснения фенотипических особенностей спленоцитов после их культивирования осуществляли стандартное иммунофлюоресцент-ное окрашивание клеток с использованием меченных флюорохромами моноклональных антител против антигенов СБ45 и СЦр крыс (использованы антитела фирмы СаИа§ Labs, США). Затем проводили проточную цитоф-люорометрию на цитометре ЕЛСБСаИЬиг (исследования выполнены на базе лаборатории иммунофармакологии УрО РАН).
Результаты и обсуждение
У экспериментальных крыс 1-й группы через несколько часов после полного удаления поджелудочной железы наступали гипергликемия и глюкозурия, максимальные величины которых отмечались с 3-4-го дня после операции. Содержание сахара в крови колебалось от 33 до 40 ммоль/л. К концу третьей недели коррекция сахара у 28 крыс препаратом «Хумулин» была отменена, и по показателям уровня сахара крови отпала ее необходимость. Остальные 22 крысы погибли в разные сроки после операции, в том числе 5 крыс - после острого опыта. Данное исследование позволяет сделать вывод, что тотальная панкреатэктомия у крыс вызывает выраженное гипергликемическое состояние, что приводит к гибели в первые сутки и недели после операции в результате развития кетоацидоза. Введение соответствующей дозы инсулина позволяет острый эксперимент перевести в хронический, то есть более половины экспериментальных животных можно использовать для изучения течения заболевания. В нашем
опыте на ранних этапах послеоперационного периода ИН корригировалась введением пролонгированного инсулина, после его отмены гипергликемия не приобретала крайнего характера, что позволяет сделать вывод о наличии компенсаторного механизма, и данным механизмом могут выступать имплантированные ткани собственной селезенки.
Во 2-й группе аллоксановая ИН получена у всех животных. Первые 3 дня являются критическими, и 23 крысы погибли в эти сроки. Причина смерти - гипергликемическая кома. Коррекцию ИН проводили введением пролонгированного инсулина, что позволило перевести остальных лабораторных животных в хронический эксперимент. В первую неделю показатели сахара в крови колебались от 35,5 до 43,5 ммоль/л, заместительная коррекция продолжалась в течение недели. К концу недели всем животным проводилась инъекция аллогенных клеточных культур в 2 вариантах
- эмбриональной и «взрослой» селезенки. Крысам продолжалась заместительная коррекция ИН еще в течение недели, после чего она была отменена. Если в первую неделю после клеточной терапии показатели сахара крови колебались от 14,5 до 22,0 ммоль/л, то в последующем отмечалось снижение в среднем до 8,5 ед. Если во 2А группе крыс отмечалось более ускоренное, значительное и стойкое снижение уровня сахара в крови, то во 2В группе снижение показателей носило длительный и волнообразный характер. Лабораторные животные стали более активными, появился аппетит. Данное исследование позволяет убедиться, что аллогенная импланта-
ция селезеночной ткани с течением времени (более 3 недель) в большинстве случаев приводит к коррекции ИН до нормальных показателей.
Известно, что стволовые клетки гемато-поэтического происхождения экспрессируют на мембране как общелейкоцитарный антиген
- гликопротеин СБ45, так и, в отличие от зрелых клеток, антиген-белок СБ90 (ТЬу-1). На представленном рисунке (рисЛ) видно, что в культурах спленоцитов взрослых крыс количественно преобладали зрелые, С045+С090 -клетки (78%), доля стволовых гематопоэтиче-ских клеток (СБ45+СБ90+) составила 11%. В культурах эмбриональных спленоцитов зрелых гематопоэтических клеток было 20%, стволовых - 21%. Причем, несмотря на небольшое число наблюдений, в рамках однофакторного дисперсионного анализа, были выявлены статистически значимые различия (Б - критерий Фишера - 23,4, Р= 0,0084). Интересно, что в культурах эмбриональных спленоцитов идентифицировались те клетки, которые экспрессировали антиген СБ90, но не экспрессировали лейкоцитарный антиген СБ45. Такой фенотип характерен для мезенхимальных ствол овых клеток [17]. Клеточная структура извлеченных из брюшной полости аутологичных фрагментов селезенки также характеризовалась как наличием зрелых форм гемапоэтических клеток, так и стволовых ге-мапоэтических и стромальных клеток. Учитывая способность к самой разнообразной дифференцировке этих клеток, этот факт весьма существенен.
Ш 0045+0090-СЭ45+СЭ90-
0045+0090+ Н СЭ45+СЭ90+
0045-0090+
СЭ45-СЭ90+
Рис. 1. Результаты проточной цитофлюорометрии.
При динамическом микроскопическом наблюдении за культурой клеток селезеночной ткани крыс выявлено образование монослоя на 4-е сутки. В монослое образуются шаровидные скопления клеток с выраженной пролиферацией. В центре «шара»-единичные крупные клетки с крупными ядрами и выраженной цитоплазмой (мезенхимальные стволовые клетки). Начиная с 10-х суток, из «шаров» отделяются скопления клеток, которые также приобретают шаровидную форму, в них также идет интенсивная пролиферация. Такое сосуществование «клонов» с микроокружением, выраженная пролиферация клеточной культуры, еще раз подтверждает, что в ткани селезенки сосредоточены запасы стволовых клеток (рис. 2).
Рис 2 Мезенхимальная стоволовая клетка.
По предварительным результатам нашего исследования мы можем предположить, что замещение постспленэктомического иммунодефицита и постпанкреатэктомической ИН происходит за счет участия в регенерации стволовых клеток селезеночной ткани под воздействием биохимических сигнальных веществ, то есть белковых молекул, способствующих хоумину - способности клеток к миграции в "нужное место" - "родной" орган и ткань (в свою стволовую нишу) или в область повреждения. Данное исследование подтверждает возможность имплантации фетальных и стромальных стволовых клеток вне зависимости от зоны пораженного органа. Безусловно, миграционная способность клеток обусловлена биохимическими сигналами, исходящими из "нужной" области, системой рецепции клетки и способностью к хемотаксису [3, 11, 16, 21, 24]. Поскольку стволовые клетки изначально обладают «свободной специализацией», то есть они являются исходными при об-
разовании специализированных дифференциальных клеток, но до тех пор, пока они не получат генетический сигнал, их деятельность в организме ограничивается только многократным дуплицированием (удвоением) какого-либо участка хромосомы [10, 13]. Отсутствие инсулина в обменных процессах в нашем исследовании является исходным для посылки генетического сигнала для всех остальных тканей, в том числе для имплантируемой селезеночной ткани. Под воздействием генетического сигнала происходит нужная дифференциация стволовых клеток селезеночной ткани в В-клетки, которые вырабатывают инсулин. Способность стволовых клеток длительное время воспроизводить себе подобных также уникальна: в отличие от нормальных, «стволовые» клетки могут быть практически неограниченным источником первичного клеточного «сырья» [7, 13]. При их делении часть из дочерних клеток остается стволовыми, а другая - начинает процесс дифференцировки. Особой разницы в степени универсализма между обычными и эмбриональными (стволовыми) клетками нет. Экспериментальное доказательство этого факта впервые представили широкой общественности американские ученые из Института стволовых клеток университета Миннесоты (США).
Следовательно, с большой вероятностью можно утверждать о существовании причинно-следственной связи между ACT и возможностью дифференцировки стволовых клеток имплантата в необходимые организму клеточные структуры, то есть в нашем исследовании, в инсулинопродуцирующие клетки в условиях in vivo. Существует же эффективная методика имплантации костного мозга в лечении сахарного диабета [18], а селезенка, являясь также одним из органов кроветворения, скорее всего, богата стволовыми клетками. Не исключается, что в селезенке находится неизвестный ранее источник стволовых клеток, играющий важную роль в лечении некоторых типов повреждений и травм.
Особого внимания заслуживает недавнее сообщение группы ученых из
Massachusetts General Hospital (Бостон, США), обнаруживших, что селезенка может быть источником взрослых стволовых клеток, которые способны восстанавливать инсулинпро-дуцирующие участки поджелудочной железы [19]. Вслед за этим неожиданным открытием исследователи сообщают, что эти взрослые стволовые клетки продуцируют протеин Hoxll, который, как предполагалось ранее, присутствует у млекопитающих лишь в пери-
од эмбрионального развития и играет огромную роль при дифференцировке клеток [20]. Исследователи также обнаружили, что селезенка развивается из эмбриональной ткани, которая формирует из стволовых клеток не только различные типы клеток крови, но, возможно, и такие разные органы, как тонкая кишка, поджелудочная железа, сосуды и легкие. Ученые полагают, что источник этих стволовых клеток может оставаться и в селезенке взрослого человека. Оба сообщения подтверждают наличие в селезенке стволовых клеток, которые, по предположениям ученых, способны развиваться в большее число разновидностей тканей, чем другие взрослые клетки.
Основанием полагать, что селезенка является источником стволовых клеток, нам позволяют результаты собственных экспериментальных исследований, выполненных по обоснованию возможности использования эмбриональной селезеночной ткани в коррекции постспленэктомического синдрома [8, 14]. После аллогенной трансплантации зародышевой селезеночной ткани под кожу уха взрослым кроликам гистологические исследования показали, что на различном расстоянии от белой и красной пульпы формирующейся селезенки располагаются довольно большого размера скопления лимфоидной ткани, состоящие из лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток. Такого рода скопления лимфоидных клеток возникают в результате деления стволовых клеток имплантата, так как соединительная ткань дермы не проявляет признаков воспалительной реакции. Определяется функциональная активность макрофагов красной пульпы, выполняющих фильтрационную функцию (поглощение поврежденных эритроцитов). Данный факт может служить подтверждением того, что трансплантированная селезеночная ткань может выполнять обезвреживающую функцию. Однако нельзя исключить возможность миграции макрофагов из прилегающих тканей донора и поступления продуктов распада гемоглобина из сети сосудов, расположенных вокруг трансплантата.
В нашем исследовании возник вопрос в отношении возможности дифференцировки клеток селезенки в р-клетки поджелудочной железы в условиях отсутствия последней, то есть после тотальной панкреатэктомии. В настоящее время в научной литературе бурно обсуждается возможный механизм действия стромальных клеток - их прямая трансдиффе-ренцировка в Р-клетки. Итак, возможно ли
это?
Первая глобальная работа была опубликована группой Andrea lanus, в которой была показана возможная дифференцировка клеток костного мозга мыши в Р-клетки in vivo (при их введении) без признаков слияния клеток. Клетки костного мозга модифицировали генетически так, что при начале синтеза инсулина они начинали продуцировать и зелёный флюоресцентный белок (то есть светиться зелёным при флюоресцентной микроскопии). Через 4-6 недель после трансплантации около 2-3% клеток донорского костного мозга "светились" при 70-90% эффективности интеграции (engraftment). Эти клетки были отсортированы, они экспрессировали типичные для Р-клеток маркёры, синтезировали инсулин и отвечали на стимуляцию глюкозой [18]. В комментарии к этой статье приведены возможные причины и объяснения такого "поведения" клеток костного мозга. В частности, указываются некие онтогенетические пути, объединяющие эти ткани, и экспрессию общих поверхностных рецепторов (например Kit(CD„7))[21].
Появились работы, указывающие на возможность синтеза инсулина стромальными клетками in vitro. Австралийская группа "заставила" человеческие стволовые клетки костного мозга вырабатывать инсулин путём трансфекции ретровирусной ген-
конструкцией, содержащей проинсулиновую к-ДНК человека. Причём как гемопоэтические клетки (2 линии, полученные из АССС), так и первичные мезенхимальные [26].
Работа отечественных учёных, опубликованная в журнале «Онтогенез», показывает возможность получения инсулинпродуци-рующих клеток из стромальных стволовых клеток костного мозга in vitro [24].
Анализируя имеющиеся данные, мы можем объяснить факт дифференцировки стволовых клеток трансплантированной селезеночной ткани в инсулинопродуцирующие клетки (учитывая то обстоятельство, что взрослые стволовые клетки костного мозга и селезенки, возможно, имеют общее начало) под влиянием определенных сигналов (пусковым механизмом в нашем исследовании является отсутствие инсулина в крови + гипергликемия + мобилизация стволовых клеток селезеночной ткани) и, как объясняют некоторые исследователи, наличием общих путей развития в эмбриональном периоде селезенки, печени и поджелудочной железы [19].
Выводы
1. Экспериментальная аллоксановая и пан-креатэктомическая инсулиновая недостаточности в настоящее время являются наиболее адекватными моделями сахарного диабета в клинике.
2. Использование способа аутотрансплантации селезеночной ткани при выполнении пан-креатэктомии позволяет провести профилактику инсулиновой недостаточности более чем у половины экспериментальных животных, что дает основание предположить о возможности получения подобного эффекта при применении в клинической практике.
3. Использование трансплантации аллоген-ных клеточных культур фетальной и «взрослой» селезеночной ткани при аллоксановой
инсулиновой недостаточности позволяет достичь ее коррекции у большинства экспериментальных животных.
4. Цитофлюорометрическое исследование трансплантируемых аллогенных спленоцитов после длительного культивирования, а также аутологичных фрагментов * селезенки, реим-плантированных в брюшную полость показало, что в их составе идентифицируются гемо-поэтические и стромальные стволовые клетки, которые, возможно, способны участвовать в восстановлении инсулинпродуцирующих клеток в организме экспериментальных животных.
Получено 02.11.06.
ЛИТЕРАТУРА
1. Апарцин К.А. Хирургическая профилактика и способы коррекции послеоперационного ги-поспленизма: Дис. ... д-ра мед. наук. - Иркутск, 2001. - 293 с.
2. Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии / В.Г. Баранов, И.М. Соколоверова, Э.Г. Гаспарян. - Л.: Наука. - 1983. - 240 с.
3. Берсенев А.В. Клеточная трансплантология - история, современное состояние и перспективы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005. - № 1. - С.49-56.
4. Бордуновский В.Н. Пластическая хирургия селезенки и печени (экспериментальноклиническое исследование): Автореф. дис... д-ра мед. наук. - Пермь, 1992. - 50 с.
5. Возможна ли коррекция инсулиновой недостаточности путем аутотрансплантации селезеночной ткани? / В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, А.Г. Хасанов, СИ. Рахматуллин, Ш.В. Ти-мербулатов, М.М. Саяпов // Хирургия. - 2006. - № 3. - С. 22-28.
6. К механизму восстановления функций пораженной печени с помощью устройств биоискус -ственной поддержки печени / Н.А. Онищенко, Ф.Х. Базиева, Т.Р. Мамхегова, Э.И. Первакова // Трансплантология и искусственные органы. - 1997. - № 4. - С. 86-91.
7. Оганесян Т. Клетки свободной специализации // Эксперт - наука и технология. - 2002. - № 26.-С. 45-48.
8. Органосохраняющая и миниинвазивная хирургия селезенки / М.В. Тимербулатов, А.Г. Хасанов, P.P. Фаязов, Ф.А. Каюмов. - М.: «МЕДпресс - информ», 2004. - 218 с.
9. Перспективы использования трансплантации селезеночной ткани при экспериментальной инсулиновой недостаточности / В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, Ш.В. Тимербулатов, М.М. Саяпов, М.Н. Саубанов // Вестник Уральской медицинской академической науки. - Екатеринбург, 2006.-№ 1.-С. 113-116.
10. Репин B.C. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина / B.C. Репин, А.А. Ржанинова, Д.А. Шаменков. - М.: «Реметэкс», 2002. - 175 с.
11. Сергеев B.C. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005. - №2. - С.39.
12. Скалецкий Н.Н. // Проблемы трансплантологии и искусственных органов / Н.Н. Скалецкий, Л.А. Кирсанова, В.Н. Блюмкин. - М., 1994. - С. 73-80.
13. Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения / А.Я. Фриден-штейн, Е.А Лурия. - М.: Медицина. - 1980. - 216 с.
14. Хирургия абдоминальных повреждений / В.М. Тимербулатов, P.P. Фаязов, А.Г. Хасанов, М.В. Тимербулатов, И.М. Уразбахтин. -М.: «МЕДпресс-информ», 2005. -255 с.
15. Шевченко Ю.Л. Медико-биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии. - СПб.: «Наука», 2006. - 287 с.
16. Шумаков В.И. Трансплантация островковых и других эндокринных клеток / В.И. Шумаков, Н.Н. Скалецкий // Трансплантология: руководство. - Тула: «Репроникс Лтд.», 1995. - С. 317331.
17. Bieback K. Critical Parameters for the Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Blood / K. Bieback, S. Susanne Kern, H. Kluter // Stem Cells. - 2004. -V. 22. - P.625-634.
18. Ianus A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion // J. Clin. Invest. 2003. - V.l 11. - P. 843-850.
19. Kodama S. Routes to regenerating islet cells: stem cells and other biological therapies for type 1 diabetes / S. Kodama, D.L. Faustman // Pediatr. Diabetes. - 2004. - V.5. - Suppl. 2. - P. 38-44.
20. Kodama S. Diabetes and Stem Cell Researchers Turn to the Lowly Spleen / S. Kodama, M. Davis, D.L. Faustman // Sci. Aging. Knowl. Environ. - 2005. -V.3.— P. 2-3.
21. Lee V.M. Bone marrow: An extra-pancreatic hideout for the elusive pancreatic stem cell? / V.M. Lee, M. Stoffel // J. Clin. Invest. - 2003. - V.6. -P. 799-801.
22. Musaro A. Stem cell-mediated muscle regeneration is enhanced by local isoform of insulin-like growth factor 1 // PNAS. - 2004. - V. 5. - P. 1206-1210.
23. Ryan E.A., Lakey J, Paty B.W. // Diabetes. - 2002. - V.51. - P. 2148-2157.
24. Shchegel'skaia E.A. Pluripotency of bone marrow stromal cells and perspectives of their use in
cell therapy // Ontogenez. - 2003. -V. 34. -P. 228-235.
25. Torella E. Cardiac stem cell and myocyte aging, heart failure, and insulin-like growth factor-1
overexpression // Circ. Res. - 2004. -V. 94. - P. 514-524.
26. Wong R.Y.L. Synthesis and release of human (pro)insulin in human BM progenitor cells // Cytotherapy.-2003.-V. 3.-P. 273-275.
УДК 575:576.8.095.52:616.37-002-036.11-06:616.94-07 © И.И. Лутфарахманов, Т.В. Викторова, В.В. Викторов, П.И. Миронов, 2007
И.И. Лутфарахманов, Т.В. Викторова, В.В. Викторов, П.И. Миронов ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА РАЗВИТИЯ АБДОМИНАЛЬНОГО СЕПСИСА У ПАЦИЕНТОВ С ТЯЖЕЛЫМ ОСТРЫМ ПАНКРЕАТИТОМ
TOY BUO «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Генетические факторы могут играть роль в вариабельности течения тяжелого острого панкреатита (ТОП). Целью исследования явилось изучение частоты полиморфизма -308G- *A гена фактора некроза опухолей альфа (TNFa)у пациентов с ТОП и выявление ассоциации AG генотипа с развитием абдоминального сепсиса (АС). Было обследовано 100 пациентов с ТОП, из них 49 пациентов с АС и 51 пациент без АС в качестве контроля. Генотипирование было проведено путем анализа длин рестрикционных фрагментов ДНК-продуктов полимеразной цепной реакции. Логистическая регрессионная модель была сконструирована с включением AG/GG генотипов для прогнозирования случаев АС.
Обнаружено умеренное увеличение числа пациентов с септическими осложнениями и экстра-абдоминальными очагами инфекции среди носителей AGгенотипа по сравнению с носителями GGгенотипа (р=0,047ир~0,043\соответственно). При чувствительности в 61% прогностическая модель показала специфичность в 71%, что значимо лучше, чем для критериев синдрома системного воспалительного ответа (р=0,043). Можно заключить, что полиморфизм -308 G-*A TNFa ассоциирован с септическими осложнениями ТОП и может быть полезным маркером для прогнозирования случаев АС у пациентов с ТОП.
Ключевые слова: тяжелый острый панкреатит, абдоминальный сепсис, генный полиморфизм, прогнозирование исходов, логистический регрессионный анализ.
11. Lutfarakhmanov, T.V. Viktorova, V.V. Viktorov, P.I. Mironov EVALUATION OF THE RELATIONSHIP BETWEEN TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA GENE POLYMORPHISM AND ABDOMINAL SEPSIS IN PATDENTS WITH SEVERE ACUTE PANCREATITIS
Geneticfactors are likely to contribute to the variable presentation ofsevere acute pancreatitis (SAP). AIMS: To investigate the frequency ofthe tumor necrosisfactor alpha (TNFa) gene polymorphism -308G- *A in patients with SAP and to determine whether the AG genotype is associated with the occurrence of abdominal sepsis (AS). One hundred patients with SAP,' in whom 49 patients with AS and 51 patients without AS served as controls. Genotypes frequencies were determined using restriction fragment length polymorphism analysis ofpolymerase chain reaction products. A logistic regression model was constructed with AG/GGgenotypes to predict the AS incidence.
There werefound a moderate increase in thefrequencies ofthe AG genotype amongpatients with septic complications in general andpatients with extra-abdominal sites ofinfection, as compared with those with GG genotype (p=0,047and p=0,043; respectively). At 61% sensitivity level the prediction model showed the specificity level of 71%c, it was significantly better than that of systemic inflammatory response syndrome criteria (p-0,043). The polymorphism -308 G— *A TNFa is associated with septic complicationsfrom SAP and may be useful as a marker for predicting AS in patients with SAP.
Key words: Severe acute pancreatitis, abdominal sepsis, gene polymorphism, outcome prediction, logistic regression analysis.
