Изучение влияния различных цитокининов на эффективность образования регенерантов при микроклональном размножении тополя берлинского (populusberolinensis Dipp. ) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ / BRIEF COMMUNICATIONS Оригинальная статья / Original article УДК 581.143.5

DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-4-164-168

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ЦИТОКИНИНОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ПРИ МИКРОКЛОНАЛЬНОМ РАЗМНОЖЕНИИ ТОПОЛЯ БЕРЛИНСКОГО (Populus berolinensis Dipp.)

© В.В. Павличенко*, М.В. Протопопова®, Е.Д. Золотовская**, Э.М. Байрамова**, А.Д. Коновалов**, В.К. Войников*

* Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН ** Иркутский государственный университет

В работе исследовали возможность использования цитокининов в питательной среде без добавления других гормонов для получения регенерантов тополя берлинского из различных типов растительных эксплантов. Исследованы три вида цитокининов (бензиладенин, кинетин и тиди-азурон) и четыре типа растительных эксплантов (отрезки стеблей, листьев, корней и черешки листьев). Показано, что при использовании бензиладенина можно получить регенеранты из всех изученных типов растительных эксплантов, а при использовании кинетина можно получить максимальное количество регенерантов. Использование тидиазурона в изученных концентрац и-ях малоэффективно для микроклонального размножения тополя берлинского. Ключевые слова: микроклональное размножение растений, тополь, цитокинины, фитогормоны, бензиладенин, кинетин, тидиазурон, Populus berolinensis.

Формат цитирования: Павличенко В.В., Протопопова М.В., Золотовская Е.Д., Байрамова Э.М., Коновалов А.Д., Войников В.К. Изучение влияния различных цитокининов на эффективность образования регенерантов при микроклональном размножении тополя берлинского (Populus berolinensis Dipp.) // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, N 4. С. 164-168. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-4-164-168

THE DIFFERENT CYTOKINES INFLUENCE

ON THE BERLIN POPLAR (Populus berolinensis Dipp.)

REGENERATION EFFICIENCY DURING ITS MICROPROPAGATION

V.V. Pavlichenko*, M.V. Protopopova*, E.D. Zolotovskaya**, E. M. Bairamova**, A.D. Konovalov**, V.K. Voinikov*

* Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS ** Irkutsk State University

The possibility of the cytokinins use in the growth medium without addition of other hormones for the berlin poplar regeneration was studied on the different explants types. Three types of cytokinins (benzyladenine, kinetin and thidiazuro) and four types of plant explants (the pieces of stems, leaves, roots and butts) were investigated. It was shown, that benzyladenin induced regeneration from all studied plant explants but kinetin induced the maximum numbers of regenerants overall. Thidiazuron in studied concentrations showed very low efficiency for use in the berlin poplar micropropagation.

Keywords: micro propagation of plants, poplar, cytokines, phytohormones, Populus berolinensis

For citation: Pavlichenko V.V., Protopopova M.V., Zolotovskaya E.D., Bairamova E.M., Konovalov A.D., Voinikov V.K. The different cytokines influence оп the berlin poplar (Populus berolinensis Dipp.) regeneration efficiency during its micropropagation. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 3, pp. 164-168. DOI: 10.21285/2227-29252016-6-4-164-168 (in Russian)

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее быстрых и эффективных способов увеличения количества и качества посадочного материала древесных растений является их микроклональное размножение [1]. Данный подход позволяет не только получать растения, свободные от бактериального заражения, но и размножать виды, у которых черенкование или прорастание из семян малоэффективно. Кроме того, при использовании этой технологии можно осуществлять круглогодичное размножение материала, что является затруднительным в случае использования классических подходов. В основе микроклонального размножения лежит тотипотентность растительной клетки - способность соматической клетки давать начало всем другим клеткам целого организма. В процессе микроклонального размножения растений используются различные типы растительных эксплантов, тканей и органов, в том числе листья и их черешки, стебли, корни, семена, меристемы и др.

Однако одной из проблем, с которой сталкиваются исследователи при постановке данной методики, является невозможность получения регенерантов из всех типов эксплантов при использовании универсальной питательной среды, поскольку различные типы эксплантов показывают неодинаковую эффективность в получении регенерантов, либо вообще не переходят к органогенезу. Таким образом, на этапе подготовки эксперимента важен подбор оптимальных концентраций фитогормонов, в частности цитокининов, для повышения продуктивности микроклонального размножения и получения максимального количества растений-регенерантов из всех типов эксплантов.

Цитокинины - фитогормоны, способствующие активному метаболизму и росту растений. Они регулируют многие физиологические процессы в растениях, в том числе стимулируют деление клеток и их дифференцировку. В настоящее время широко применяются синтетические цитокинины в виду их низкой активной концентрации и более высокой скорости действия по сравнению с природными регуляторами роста, что позволяет повысить эффективность метода микроклонального размножения [2].

Целью настоящего исследования являлся подбор типа и концентрации цитокинина для получения максимального количества растений-регенерантов на примере тополя берлинского (Рори1ив ЬегоИпепвв).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования был выбран тополь берлинский (Рори1ив ЬегоИпепв'в Dippel), который относится к семейству Ивовые (БаНоаоеае) и является гибридом тополя лав-ролистного и тополя черного (Р. ¡аигЮНа Ledeb.

х P. nigra L.). Представители рода Populus обладают высокой способностью к регенерации, благодаря чему являются удобным объектом для постановки методики микроклонального размножения древесных растений.

Для образования регенерантов питательную среду готовили на основе 1/2 MS 5524 [3] производства Sigma-Aldrich с добавлением хе-лата железа и микроэлементов до полной нормы от среды MS, тиамина (1мг/л), пиридоксина (0,5 мг/л), никотиновой кислоты (0,5 мг/л), аде-нин сульфата (40 мг/л) и мезо-инозита (50 мг/л). В качестве источника углеводов использовали сахарозу (2%). Для получения твердой среды применялся агар (Биотехновация, Россия) в концентрации 7 г/л. Кислотность среды доводили до значения pH 5,7. В качестве цитокининов использовали кинетин [4], бензиладенин [5] и тидиазурон [6] производства Sigma-Aldrich с финальными концентрациями в питательной среде 0,1 мг/л, 0,25 мг/л, 0,5 мг/л и 1 мг/л. Эксперименты проводили в сосудах для культивирования растений объемом 100 мл с крышками Magenta B-Cap (Sigma-Aldrich), в которые вносили по 25 мл автоклавированной питательной среды. Контрольную группу растений выращивали на аналогичной питательной среде без добавления цитокининов.

На поверхность затвердевшей и остывшей до комнатной температуры питательной среды помещали экспланты растений: черешки листьев, отрезки стеблей без пазушных почек, кусочки листьев с раневой паренхимой и отрезки корней. Сосуды с эксплантами экспонировали в световой комнате, в условиях фотопериода: 16/8 ч (день/ночь) при 24 °C.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Начало образования первых регенерантов отмечали на отрезках корней после 9 сут их экспонирования на среде с кинетином. На 14 сут экспозиции регенеранты образовывались на отрезках корней в случае использования бензи-ладенина в финальных концентрациях в питательной среде 0,1 и 0,25 мг/л. В этот же период отмечали появление регенерантов на отрезках стеблей, экспонированных на среде с кинетином. На 22 сут образовывались регенеранты на черешках листьев, экспонированных на среде с концентрацией бензиаденина 0,25 мг/л. Также образование регенерантов детектировали на отрезках стеблей, листьев и черешках листьев на средах с концентрацией бензиладенина 0,1 мг/л на 28 сут эксперимента. Однако образование регенерантов не было зафиксировано при всех использованных концентрациях кинетина на черешках и отрезках листьев. На питательных средах с добавление тидиазурона отмечали образование регенерантов лишь на черешках листьев при использовании финальной

Общее количество регенерантов, полученных из разных типов эксплантов тополя берлинского за 30 суток эксперимента

Тип растительного экспланта

Тип цитокинина в питательной среде и его концентрация (мг/л)

Бензиладенин

0,1 0,25

5 -

17 6

1 -

25 12

0,5

1

Кинетин

0,1 0,25 0,5 1

0,1

Тидиазурон

0,25

0,5

Отрезки листа Черешки листьев Отрезки стеблей Отрезки корней

2 18

40 29

12 30

концентрации 0,1 мг/л.

В общей сложности за 30 сут эксперимента на питательной среде с кинетином было получено 59 регенерантов на отрезках стеблей и 89 -на отрезках корней (таблица). На питательной среде с добавлением бензиладенина было получено 37 регенерантов на отрезках корней, 23 -на черешках листьев, 5 - на отрезках листьев и 7 - на отрезках стеблей. На питательной среде с тидиазуроном было получено всего 7 регенерантов и только из черешков листьев (0,1 мг/л тиди-азурона). На контрольной среде появление рас-тений-регенерантов не наблюдали.

Таким образом, наши результаты показали, что использование бензиладенина в питательных средах приводит к получению регенерантов из всех изученных типов растительных эксплантов, а при использовании кинетина можно получить максимальное количество регенерантов. Использование тидиазурона в изученных концентрациях малоэффективно для микрокло-нального размножения тополя берлинского.

Однако стоит отметить, что полученные результаты отражают влияние лишь цитокининов на эффективность регенерации тополя берлинского. В дальнейшем будут исследованы

Благодарность: Работа выполнена при частичной финансовой поддержке, стипендии Президента РФ (СП-3823.2015.1), Комплексной программы фундаментальных исследований СО РАН (проект № 0343-2015-0005) и Гранта РФФИ 14-04-31681 мол_а. Авторы благодарят Байкальский аналитический центр (ЦКП) СО РАН при Президиуме ИНЦ СО РАН за предоставленную возможность использования необходимого для исследования оборудования.

другие составы питательных сред, в том числе комбинации цитокининов и ауксинов.

Полученные результаты можно использовать при работе по улучшению состава питательной среды для размножения тополя берлинского. Ранее уже проводились работы по микроклональному размножению тополя берлинского [7] и его гибридов [8, 9], но в них использовались более сложные по составу питательные среды. Результаты данного исследования показывают, что для микроклонального размножения тополя берлинского могут быть использованы более простые питательные среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все использованные виды цитокинов приводят к образованию регенерантов у тополя берлинского, однако, с различной эффективностью. При использовании бензиладенина в питательной среде можно получить регенеранты из всех типов эксплантов. Наибольшее количество регенерантов можно получать при использовании питательной среды с добавлением кинетина. Тидиазурон может быть использован для микроклонального размножения тополя берлинского, но только из черешков листьев.

Acknowledgement: The study was financially supported by Russian Foundation for Basic Research (RFBR) grant № 14-04-31681 mol_a, by scholarship of President of Russia (SP-3823.2015.1), and by Integrated Program for Basic Research of SB RAS (project № № 0343-20150005). The authors thank the Center of Collective use at Presidium of SB RAS for the opportunity to use the necessary equipment.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК

1. Jain S.M., Haggman H. Protocols for micropropagation of woody trees and fruits. Dordrecht: Springer, 2007. 559 p.

2. Mok D.W.S., Mok M.C. Cytokinin metabolism and action // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001. V. 52. P. 89-118.

3. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

4. Barciszewski J., Rattan S.I.S., Siboska G., Clark B.F.C. Kinetin - 45 years on // Plant Sciense. 1999. V. 148. P. 37-45.

5. Jaime A. Teixeira da Silva. Is BA = BAP? // The Asian and Australian Journal of Plant Science and Biotechnology. 2012. V. 6, N 1. P. 121-124.

6. Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993. V. 33. P. 105-119.

7. Gamburg K.Z., Voinikov V.K. Somaclonal

1

7

variations as a mean for obtaining regenerants with different growth rates in poplar (Populus berolinensis) // Natural Science. 2013. V. 5. P. 599-607.

8. Wang H.M., Liu H.M., Wang W.J., Zu Y.G. Effects of TDZ, basal medium, light quality on adventitious shoot regeneration from in vitro cultured stem of Populus alba x p. berolinensis // Journal of Forestry

Research. 2008. V. 19, N 3. P. 257-259.

9. Wang H., Wang C., Liu H., Tang R., Zhang H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation and regeneration system for leaf explants of two alite aspen hybrid clones Populus alba x P. berolinensis and Populus davidiana x p. bolleana // Plant cell Reports. 2011. V. 30. P. 2037-2044.

REFERENCES

1. Jain S.M., Haggman H. Protocols for micropropagation of woody trees and fruits. Dordrecht, Springer, 2007, 559 p.

2. Mok D.W.S., Mok M.C. Cytokinin metabolism and action // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 2001, vol. 52. P. 89-118.

3. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962, vol. 15. pp. 473-497.

4. Barciszewski J., Rattan S.I.S., Siboska G., Clark B.F.C. Kinetin - 45 years on // Plant Sciense. 1999, vol. 148, pp. 37-45.

5. Jaime A. Teixeira da Silva. Is BA = BAP? // The Asian and Australian Journal of Plant Science and Biotechnology. 2012, vol. 6, № 1, pp. 121-124.

6. Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a

Критерии авторства

Павличенко В.В., Протопопова М.В., Золотовская Е.Д., Байрамова Э.М., Коновалов А.Д., Войников В.К. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Павличенко В.В., Протопопова М.В., Золотовская Е.Д., Байрамова Э.М., Коновалов А.Д., Войников В.К. имеют на статью авторские права и несут равную ответственность за плагиат.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации

Василий В. Павличенко

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 К.б.н., с.н.с.

vpavlichenko@gmail.com

Марина В. Протопопова

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132 К.б.н., с.н.с.

marina.v.protopopova@gmail.com

potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993, vol. 33. pp. 105-119.

7. Gamburg K.Z., Voinikov V.K. Somaclonal variations as a mean for obtaining regenerants with different growth rates in poplar (Populus berolinensis) // Natural Science. 2013, vol. 5. pp. 599-607.

8. Wang H.M., Liu H.M., Wang W.J., Zu Y.G. Effects of TDZ, basal medium, light quality on adventitious shoot regeneration from in vitro cultured stem of Populus alba x p. berolinensis // Journal of Forestry Research. 2008, vol. 19, № 3. pp. 257-259.

9. Wang H., Wang C., Liu H., Tang R., Zhang H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation and regeneration system for leaf explants of two alite aspen hybrid clones Populus alba x p. berolinensis and Populus davidiana x p. bolleana // Plant cell Reports. 2011, vol. 30. pp. 2037-2044.

Contribution

Pavlichenko V.V., Protopopova M.V., Zolotovskaya E.D., Bairamova E.M., Konovalov A.D., Voinikov V.K. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Pavlichenko V.V., Protopopova M.V., Zolotovskaya E.D., Bairamova E.M., Konovalov A.D., Voinikov V.K. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.

AUTHORS' INDEX Affiliations

Vasiliy V. Pavlichenko

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS

664033, Russia, Irkutsk, Lermontov Str., 132 PhD of Biology, Senior researcher vpavlichenko@gmail.com

Marina V. Protopopova

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS

664033, Russia, Irkutsk, Lermontov Str., 132 PhD of Biology, Senior researcher marina.v.protopopova@gmail.com

Елена Д. Золотовская

Иркутский государственный университет 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1 Студент

zolotovskayaelenad@gmail.com

Эльвира М. Байрамова

Иркутский государственный университет 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1 Студент

bairamovaelvira@gmail.com

Алексей Д. Коновалов

Иркутский государственный университет 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1 Студент

konovalov.alexey.d@gmail.com Виктор К. Войников

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132

Д.б.н., профессор, гл.н.с.

vvk@sifibr.irk.ru

Поступила 11.11.16

Elena D. Zolotovskaya

Irkutsk State University

664003, Russia, Irkutsk, Karl Marx Str., 1

Student

zolotovskayaelenad@gmail.com

Elvira M. Bairamova

Irkutsk State University

664003, Russia, Irkutsk, Karl Marx Str., 1

Student

bairamovaelvira@gmail.com

Alexey D. Konovalov

Irkutsk State University

664003, Russia, Irkutsk, Karl Marx Str., 1

Student

konovalov.alexey.d@gmail.com Victor K. Voinikov

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS

664033, Russia, Irkutsk, Lermontov Str., 132 Doctor of Biology, Professor, Chief researcher vvk@sifibr.irk.ru

Received 11.11.16