CC BY
52
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 579.87
ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ АКТИНОБАКТЕРИЙ К СОЛЯМ ВАНАДИЯ
Л. В. Костина3, М. С. Куюкинаь, И. Б. ИвшинааЬ
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Изучена устойчивость 64 чистых культур актинобактерий, хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики мик-рооганизмов (ИЭГМ), к солям ванадия в зависимости от pH среды культивирования бактериальных клеток. Определены минимальные ингибирующие концентрации для данных штаммов актинобактерий. Выявлено отсутствие корреляции между видовой принадлежностью исследуемых штаммов актинобактерий и их устойчивостью к солям ванадия. Установлено, что устойчивость актинобактерий к воздействию исследуемых солей ванадия увеличивается в 2-4 раза в условиях нейтральной реакции среды по сравнению с таковой при кислой и щелочной среде. Отобраны коллекционные штаммы актинобактерий, устойчивые к высоким концентрациям солей ванадия.
Среди химических веществ, загрязняющих окружающую среду, особое место занимают тяжелые металлы. Это обусловлено тем, что металлы, в отличие от органических загрязнителей, не подвергаются процессам разложения и способны лишь к перераспределению между отдельными компонентами среды. К тяжелым металлам относят группу химических элементов, имеющих плотность более 5 г/см3 и относительную атомную массу более 40 а.е.м. (Фрумин, 2002). Ванадий - тяжелый металл, входящий в побочную подгруппу пятой группы периодической системы. Он образует преимущественно пятивалентные соединения, но характеризуется переменной валентностью от (И) до (V). В природе ванадий находится преимущественно в рассеянном состоянии и обнаруживается в железных рудах, нефти, асфальтах, битумах, горючих сланцах. Одним из главных источников загрязнения окружающей среды ванадием является нефть и продукты ее переработки (Вагсе1оих, 1999). Данный металл активно аккумулируется клетками микроорганизмов, органами и тканями человека, теплокровных животных и гидробионтов. Ванадий содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, однако не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных организмов (Ван Ни и др., 1990). Как микроэлемент ванадий участвует в регуляции углеводного обмена и сердечно-сосудистой деятельности высших позвоночных животных (Вагсе1оих, 1999). Избыточное накопление ванадия оказывает токсическое воздействие на живые организмы. Токсический эффект ванадия обусловлен, главным образом, стимуляцией образования свободнорадикальных состояний ки-
слорода и изменением pH среды (Барский и др., 1999). Ванадий является ингибитором клеточных ферментов, в частности Ка+/К+-АТФ-азы (\УШзку ег а1., 1985). Катионы ванадия легко образуют комплексы с гидроксильными, карбоксильными, фосфатными группами и ковалентные связи с сульф-гидрильными группами. Они способны соединяться с белками, нуклеотидами, коферментами, фосфолипидами, практически со всеми типами веществ, участвующими в метаболизме клеток (Сенцова, 1985). Некоторые сахара и аминокислоты, водород, лактат, глицерол и диоксид углерода являются донорами электронов для пятивалентного ванадия (Ьоу1еу, 1993). Следует отметить, что токсический эффект тяжелых металлов в отношении микроорганизмов во многом зависит от pH среды. Так, токсичность ионов Сс12+ в бактериальных клетках увеличивается при значениях pH, характерных для щелочной среды (Иванов и др., 1997).
В настоящее время одним из перспективных с точки зрения эффективности, безопасности и экономичности методов очистки окружающей среды от загрязнений считается микробиологический. Клетки микроорганизмов способны концентрировать значительные количества металлов из среды независимо от того, имеют ли эти металлы физиологическое значение или их участие в метаболических процессах не установлено (Пименов и др., 1996; ОасИ, ЛеИт, 1988). При эффективных биотехнологических методах очистки экосистем, загрязненных тяжелыми металлами и нефтепродуктами, предполагается использование микроорганизмов с высокой активностью оксигеназ и устойчивые к воздействию токсичных металлов (СИпбйА, ЫИта, 2002).
О Л.В. Костина, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина, 2004
Цель настоящей работы - изучение устойчивости коллекционных культур актинобактерий к солям ванадия в зависимости от pH среды культивирования бактериальных клеток.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования служили 64 штамма актинобактерий, хрянящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов..., 1994; www.ecologv.psu.ru/iegmcol/) и принадлежащих к 2 видам рода Gordonia (G. rubropertincta, G. terrae), виду Dietzia maris и 6 видам рода Rhodococcus (R. erythropolis, R.fascians, R. “longus”, R. opa-cus, R. rhodochrous и R. ruber) (табл. 1). Данные культуры актинобактерий выделены из различных природных источников резко контрастных экологогеографических регионов, они характеризуются высокой активностью оксигеназного ферментного комплекса и проявляют высокую (от 20 до 85%) эмульгирующую активность (Ившина, 1997).
Таблица 1
Источники выделения коллекционных штаммов актинобактерий
Вид, номер штамма Источники и география проб
Dietzia maris
ИЭГМ 45 Пластовая вода, нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 55т Почва, загрязненная нефтью, Черниговская обл., Украина
ИЭГМ 166 Вода, загрязненная нефтью, Камское водохранилище, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 291 Донные отложения, Тюменская обл., Россия
ИЭГМ 317 Кишечный тракт карпа
Gordonia rubropertincta
ИЭГМ 95 Почва
ИЭГМ 96 Почва, пропитанная нефтью, Украина
ИЭГМ 105 Вода, р. Днепр, Днепропетровская обл., Украина
ИЭГМ 106 Воздушное заражение культуральной среды
ИЭГМ 128 Почва, загрязненная нефтью, нефтяное месторождение, Ивано-Франковская обл., Украина
Gordonia terrae
ИЭГМ 143т Почва
ИЭГМ 144, ИЭГМ 146 Почва, пропитанная нефтью, Украина
ИЭГМ 147, ИЭГМ 151 Вода, р. Днепр, Днепропетровская обл., Украина
ИЭГМ 157 Вода, р. Днепр, Полтавская обл., Украина
Rhodococcus erythropolis
ИЭГМ 185, ИЭГМ 186 Вода, Камское водохранилище, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 201 Вода, родник, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 256 Почва, загрязненная нефтью, Украина
ИЭГМ 266, ИЭГМ 267, ИЭГМ 268, ИЭГМ 269, ИЭГМ 270 Почва, загрязненная нефтью, район нефтепромысла, Пермская обл., Россия
Окончание табл. 1
Вид, номер штамма Источники и география проб
ИЭГМ 708 Шламохранилище, г. Полазна, Пермская обл., Россия
Rhodococcus fascians
ИЭГМ 34 Кожа карпа, Днепровское водохранилище, Украина
ИЭГМ 38, ИЭГМ 39 Пластовая вода, нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 170 Снег, район нефтепромысла, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 278 Речная вода, Тюменская обл., Россия
Rhodococcus “lont (И4”
ИЭГМ 27, ИЭГМ 28, ИЭГМ 29 Почва, загрязненная нефтью, Полтавская обл., Украина
ИЭГМ 31 Почва, загрязненная нефтью, Полтавская обл., Украина
ИЭГМ 32 Почва, поле, Полтавская обл., Украина
ИЭГМ 33 Почва, загрязненная нефтью, Ивано-Франковская обл., Украина
ИЭГМ 68, ИЭГМ 69 Почва, район нефтепромысла, Пермская обл., Россия
Rhodococcus opacus
ИЭГМ 56 Почв^ Украина
ИЭГМ 57 Почва, загрязненная нефтью, Украина
ИЭГМ 59 Почва, Украина
ИЭГМ 61 Почва, загрязненная нефтью, Украина
ИЭГМ 246 Почва, полиэфирные волокна лавсана, Беларусь
ИЭГМ 716т Район утечки газового трубопровода, Великобритания
ИЭГМ 717 Почва, Великобритания
Rhodococcus rhodochrous
ИЭГМ 62' Почва
ИЭГМ 63, ИЭГМ 64, ИЭГМ 65 Почва, Украина •
ИЭГМ 646 Вода, г. Березники, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 647 Нефтепромысловая вода, Межевское нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия
Rhodococcus ruber
ИЭГМ 73 Грунтовая вода нефтяного месторождения, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 77 Вода, родник, контурная зона нефтяного месторождения, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 84 Песчаная лорода, Гомельская обл., Беларусь
ИЭГМ 93 Песчаная порода, Восточная Сибирь, Ичерская площадь, Иркутская обл., Россия
ИЭГМ 172 Пластовая вода, нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 223, ИЭГМ 224, ИЭГМ 225, ИЭГМ 226 Почва, р-н Полазненского нефтепромысла, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 231 Вода, родник, р-н Ольховского нефтепромысла, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 235 Снежный покров, р-н Полазненского нефтепромысла, Пермская обл., Россия
ИЭГМ 327 Дерново-подзолистая почва, нефтегазовое месторождение, Пермская обл., Россия
Примечание. т- типовой штамм, R. "longus ” - невалидный вид.
116
Л. В. Костина, М. С. Куюкина, И. Б. Ившина
В экспериментах применяли водные растворы (от 1,6 до 250,0 мМ) солей ванадия У0Б04 (рН=2,2), №УОч (рН=7,5) и №3У04 (рН=12,0). В качестве количественной характеристики резистентности исследуемых бактерий к солям ванадия приняли показатель минимальной ингибирующей концентрации (МИК), который определяли с помощью модифицированного нами микролуночного метода с использованием мясопептонного бульона. В качестве кон-тролей применяли бактериальную культуру, выращенную в питательной среде без металла, а также неинокулированную питательную среду. Планшеты инкубировали в течение трех суток при температуре 28°С. Учет результатов проводили с использованием красителя йодонитротетразолия фиолетового. Данный краситель действует в качестве конкурентного кислороду акцептора электронов в электрон-транспортной цепи аэробных микроорганизмов. При внесении красителя в среду происходит его восстанавление до нерастворимого в воде формаза-на. Формазан проявляется через несколько минут в виде красно-фиолетового окрашивания только в присутствии активно респирирующих микроорганизмов. Все эксперименты проводились в четырехкратной повторности.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерной программы Бгай^са (версия 6.0 для \Утскж8).
Результаты и их обсуждение
В табл. 2 приведены результаты определения МИК солей ванадия в зависимости от pH среды культивирования исследуемых актинобактерий. Необходимо отметить, что 52 из 64 исследованных штаммов сохраняют жизнеспособность при концентрации ва-надата натрия (рН=7,5) свыше 250,0 мМ (МИК для этих бактериальных культур находится выше предела растворимости данной соли). Данная величина превышает предельно допустимую концентрацию (ПДК = 150 мг/кг) ванадия в почве в 85 раз. По нашим данным, представителей актинобактерий разных родов по степени устойчивости к солям ванадия можно расположить в ряд: Согс1ота>Шюс1ососси$>01еЫа при рН=2,2; 01е1г\а>Шю(1ососсш>Сог(1ота при рН=7,5 и
12,0 (табл. 2).
В экспериментах по изучению влияния кислотности среды культивирования на устойчивость бактериальных штаммов к ванадию использовали водные растворы солей металла с нейтральным значением pH.
Раствор УОБСи (рН=7,7) готовили с использованием буфера, содержащего лимонную кислоту, а раствор №3У04 (рН=6,8) - с использованием трис(гидроксиметил)аминометан-малеатного буфера. Как видно из табл. 3, при применении забуфе-ренных растворов солей ванадия показатели МИК увеличиваются в 2-4 раза по сравнению с таковыми, полученными при использовании растворов данных
солей, имеющих значения pH, свойственные кислым и щелочным средам.
Таблица 2
Резистентность актинобактерий к солям ванадия
МИК, мМ
Вид (количество V02+ r*V О > V043'
штаммов) pH
2,2 7,5 12,0
Dietzia maris (5) 12,5 ±6,83 > 250,0 90,0 ± 20,0
Gordonia rubropertincta (5) 22,5 ± 5,00 > 250,0 80,0 ± 24,49
G. terrae (6) 18,8 ±6,25 > 250,0 58,3 + 31,18
Rhodococcus eryth-ropolis (10) 11,9 ±1,88 > 250,0 47,5 + 7,50
R. fascians (5) 10,0 ±3,04 > 250,0 40,0+12,25
R. "longus" (8) 20,3 ± 6,05 > 250,0 62,5 ±21,65
R. opacus (7) 5,8 ± 4,23 > 250,0 33,9 ±14,51
R- rhodochrous (3) 13,3 ±5,89 > 250,0 66,7 ± 23,57
Я ruber (12) 16,7 ± 5,89 > 250,0 83,3 ± 23,57
Таблица 3
Резистентность актинобактерий к солям ванадия при нейтральных значениях pH
Вид (количество штаммов) МИК, мМ
V02+ r^> О >
pH
7,68 6,78
Dietzia maris (5) 40,0 ± 12,25 > 250,0
Gordonia rubropertincta (5) 90,0 ±22,36 > 250,0
G. terrae (6) 75,0 ±27,38 175,0 ±82,16
Rhodococcus erythropolis (10) 52,5 ± 18,45 160,0 ±73,48
R. fascians (5) 40,0 ±13,69 100,0 ±61,24
R. “longus " (8) 75,0 ±26,73 137,5 ±51,75
R. opacus (7) 23,2 ±18,3 85,71 ±24,40
R rhodochrous (3) 66,67 ± 25,82 > 250,0
R. ruber (12) 70,83 + 25,75 > 250,0
Следует отметить, что строгой корреляции между видовой принадлежностью штаммов актинобактерий и их устойчивостью к исследуемым солям ванадия в зависимости от pH среды нами не выявлено. Оказалось, что коллекционные культуры обладают индивидуальной устойчивостью к металлу, которую можно, по-видимому, объяснить приуроченностью исследуемых культур к различным экологическим нишам (см. табл. 1).
В результате проведенных исследований нами отобраны наиболее устойчивые к солям ванадия штаммы D. maris ИЭГМ 45, G. rubropertincta ИЭГМ 95, G. terrae ИЭГМ 147, R ruber ИЭГМ 93, ИЭГМ 231, для которых характерны следующие значения МИК: V0S04 - 25,0; NaV03 - более 250,0; Na3V04 -
100,0 мМ.
Выводы
1. Выявлено отсутствие корреляции между видовой принадлежностью исследуемых штаммов актинобактерий и их устойчивостью к солям ванадия.
2. Обнаружено, что значения МИК ванадита натрия в отношении исследуемых коллекционных культур актинобактерий находятся выше предела растворимости данной соли.
3. Установлено, что устойчивость актинобактерий к действию исследуемых солей ванадия увеличивается в 2-4 раза в условиях нейтральной реакции питательной среды по сравнению с таковой при кислых и щелочных средах.
Библиографический список
Барский Е.Л., Саванина Я.В., Лебедева А. Ф. Изменение окислительно-восстановительного потенциала среды культивирования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta: взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеиетюдобных белков // Вестник МГУ. 1999. Сер. Биология. № 2. С. 11-15.
Ван Ни Ч., Якунин А.Ф., Гоготов И.Н. Влияние молибдена, ванадия и вольфрама на рост и синтез нитрогеназы свободноживущей цианобактерии Anabaena azollae И Микробиология. 1990. Т. 59, №4. С. 583-586.
Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова Л.А., Гаврюшкин А. В- Токсическое действие гидро-
ксилированных ионов тяжелых металлов на ЦПМ бактериальных клеток // Микробиология. 1997. Т. 66, № 5. С. 588-594.
Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus: биораз-
. нообразие, детекция, иммунодиагностика: Дис... д-ра биол. наук. Пермь, 1997.
Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.
Пименов Е.В., Дармов И.В., Погорельский И.П., Янов С.Н., Куликов О.А., Калинченко В.Б. Выделение и характеристика штаммов бактерий, резистентных к соединениям мышьяка // Микробиология. 1996. Т. 65, № 2. С. 214-218.
Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы // Успехи микробиологии. 1985. Т. 20, № 4, С. 227-252.
Фрумин П.Т. Экологическая химия и экологическая токсикология. СПб., 2002.
Barceloux D. G. Vanadium // J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1999. Vol. 37 (2). P. 265-278.
Christofi N., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation // J. Appl. Microbiol. 2002. Vol. 93. P. 915-929.
Gadd G.M., Rehm H.J. Accumulation of metals by microorganisms and algae // Biotechnology. 1988. Vol. 60. P. 401-405.
Willsky G.R., Leung J.O., Offermann P.V., Plotnic E.K., Dosch S.F. Isolation and characterization of vanadate-resistant mutants of Saccharomyces cere-visiae II J. Bacteriol. 1985. Vol. 164. P. 611-617.
Studying the actinobacteria resistance to vanadium salts
L.V. Kostina, M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina
Vanadium salts-resistance of 64 pure actinobacterial cultures from the Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms IEGM was studied depending on nutrient medium pH. Minimal inhibition concentrations were determined for these strains. No correlation was detected between the species position of the actinobacterial strains studied and their resistance to vanadium salts. 2-4 fold increase in actinobacterial resistance was found in neutral pH medium compared to acidic and alkaline media. Actinobacterial strains resistant to high concentrations of vanadium salts were selected.
