CC BY
174
ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ СУЛЬФАТА МЕДИ И НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ SCENEDESMUS QUADRICAUDA*
Д.А. Тодоренко1, Д.Н. Маторин1, А.А. Алексеев1, Д.И. Тунгатарова1, В.С. Орлова2
'Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Ленинские горы, д. 1, корп. 42, Москва, Россия, 119992 2Экологический факультет Российский университет дружбы народов Подольское шоссе, 8/5, Москва, Россия, 113093
В статье рассматриваются изменения параметров флуоресценции фотосинтетического аппарата водорослей Scenedesmus quadricauda при действии сульфата меди и наночастиц серебра. Показано, что световые зависимости фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции могут быть использованы как высокочувствительный тест для выявления изменений на ранних стадиях воздействия на водоросли солей тяжелых металлов.
Ключевые слова: Scenedesmus Quadricauda, сульфат меди, наночастица серебра, флуоресценция хлорофилла, фотосинтез, экология.
Большинство веществ, поступающих в водоемы с промышленными и бытовыми стоками, оказывают острое токсическое действие на микроводоросли. В связи с этим микроводоросли выбраны в качестве основных биотестов при нормировании качества вод [5]. В современной практике широко используются стандартизированные методы биотестирования на пресноводных зеленых микроводорослях рода Scenedesmus и Chlorella, культивируемых по общепринятой методике. Основными показателями токсического действия являются рост и выживаемость культуры. Между тем оценка токсичности вод и в особенности питьевой воды по реакции фотосинтетического биотеста с использованием флуоресценции является чрезвычайно актуальной. Флуориметры позволяют регистрировать различные параметры флуоресценции хлорофилла культур водорослей, поскольку флуоресценция отражает состояние фотосинтетического аппарата, являющегося наиболее чувствительным к действию многих веществ, поступающих в водные экосистемы. Основным преимуществами использования флуоресценции в биотестировании являются экспрессность анализа, низкая трудоемкость процесса измерения. Обзор по действию различных токсикантов на флуоресценцию водорослей приведен в [6]. В настоящее время флуоресцентные методы включены в методы биотестирования [3] и биомониторинга для контроля качества природных вод [4].
Флуоресценция водорослей в качестве биосенсоров, по-видимому, может с успехом использоваться для тестирования тяжелых металлов. Соли меди обладают высокой токсичностью, способны накапливаться в организмах и передаваться
* Статья поддержана Грантом РФФИ № 13-04-01853.
по трофической цепи. Кроме того, тяжелые металлы, попадая в водоемы, оказывают токсическое действие на фитопланктон, который является первичным звеном в системе пищевых связей водных организмов и определяет состояние водной экосистемы в целом. Наиболее чувствительным к действию солей меди среди всех метаболических процессов, происходящих внутри растительной клетки, является фотосинтез [6]. Ранее было показано, что соединения меди ингибируют световые и темновые реакции фотосинтеза [7—9]. Основным механизмом действия таких соединений является ингибирование мембранных процессов в результате взаимодействия с SH-содержащими соединениями и дисульфидными группами белков, а также замещение коферментов [10]. Ионы меди в более высоких концентрациях ингибируют восстановление фотосистемы 2 (ФС 2), а также электронный транспорт в ФС 2 на донорной и акцепторной стороне мембраны [7]. В последнее время все шире начинают использовать серебросодержащие материалы, в том числе и на-ночастицы серебра (нч Ag) при изготовлении различных товаров.
Целью данной работы явилось исследование токсического действия солей меди и наночастиц серебра на фотохимическое и нефотохимическое тушение флуоресценции микроводорослей и выявление наиболее информативных показателей оценки состояния клеток при токсическом воздействии.
Материалы и методы исследования. В качестве материала для исследований выбраны альгологически чистые культуры одноклеточных пресноводных водорослей Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb, выращенные на среде Успенско-го-1 в соответствии с методикой [5]. До начала экспериментов водоросли культивировали при температуре 24 ± 2 °С и периодическом освещении (12 час. свет 30 цЕ/м2с: 12 час. темнота).
В эксперименте использовали водный раствор сульфата меди [CuSO4 5H2O], для которого характерен сине-голубой цвет, свойственный гидратированным ионам [Cu(H2O)4]2+, и наночастицы серебра (80 нм). После добавления токсиканта (в разных концентрациях исследуемых металлов) водоросли экспонировали сутки при таких же условиях, что и при выращивании культуры с орбитальным перемешиванием с использованием шейкера.
Измерения флуоресцентных показателей водорослей проводили на импульсном флуорометре WaterPAM (Walz, Германия). В адаптированных к темноте образцах регистрировали постоянную (Fо) и максимальную флуоресценцию (Fm), а также максимальный выход переменной флуоресценции (Fv/Fm = Fm - Fо/Fm), который является мерой потенциальной квантовой эффективности (ФС 2).
Измерения световых зависимостей различных параметров флуоресценции на свету выполнялись при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 800 мкЕ/м2 с [11]. Время освещения составляло 50 сек. В конце каждого сеанса освещения при определенной интенсивности с использованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 цЕ/м2 с) регистрировались параметры Fm', а также выход флуоресценции на свету F(t). На основании всех параметров рассчитывали нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ = (Fm - Fm') / Fm\ квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в фотосистеме 2 (ФС 2) как отношение Y = (Fm' - Ft) / Fm' и относительную скорость нециклического электронного транспорта при данной интенсивности света ETR. Скорость
транспорта электронов рассчитывали по формуле ЕТЯ = У ■ Е^ ■ 0,5, где Е — освещенность, цЕ/м2 с). На основании полученных световых кривых ЕТЯ оценивали следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона кривой, а), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (ЕТЯтах) и насыщающую интенсивность света (Ен). а рассчитывали как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам, лежащим на светолимитированном участке Р/Е кривой, ЕТЯтах — как среднее по значениям ЕТЯ, находящимся на светонасыщающем участке. Ен рассчитывали по формуле Ен = ЕТЯтах / а. Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены в соответствие с общепринятой номенклатурой [9].
Результаты и обсуждение. Известно, что величина Еу/Ет является потенциальным квантовым выходом фотохимии ФС 2, которая связана с разложением воды и выделением кислорода [11]. Измерения величины Еу/Ет проводили в процессе инкубации водорослей в течение 24 ч при различных концентрациях сульфата меди и наночастиц серебра. Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что сульфат меди в концентрациях 2 ■ 10-5 и 5 ■ 10-5 М и наночастицы серебра (5 ■ 10-5 М ) вызывали инактивацию ФС 2 по параметру Еу/Ет, что согласуется с данными о токсическом действии этих веществ [7—9].
Наиболее контрастные различия у водорослей при действии сульфата меди были выявлены через сутки при измерении и анализе параметров флуоресценции на свету при разной интенсивности, т.е. в условиях увеличивающейся световой нагрузки (рис., табл.). Методика измерения световых кривых в настоящее время все шире используется в эколого-физиологических исследованиях фотосинтеза [1].
Квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС 2 на свету определяется как отношение У = (Ет' - Е()/Ет\ Значения этого параметра варьируют от 0,7 (адаптированный к темноте объект) до величин близких к 0 (при нарушении процесса фотосинтеза). На листьях показана линейная корреляция между параметром У и квантовым выходом фиксации углекислого газа [11]. В адаптированном к темноте объекте значение У равно Еу/Ет, которое является потенциальным квантовым выходом фотохимии ФС 2. Показано, что при возрастании освещенности растений или водорослей происходит снижение фотохимического тушения и квантового выхода в ФС 2 (У) из-за общего торможения электронного транспорта вследствие лимитирования последнего скоростью функционирования темновых процессов фотосинтеза и возрастание нефотохимического тушения [11]. В наших экспериментах увеличение интенсивности освещения контрольных клеток водорослей также приводило к снижению квантового выхода фотохимии ФС 2 -У (рис.). Уменьшение этого параметра от интенсивности света существенно ускорялось при инкубации с солями меди. Интенсивность света при которой значение У у контрольных клеток уменьшалось наполовину (Т1/2, цЕ/м2с) составляло 150 цЕ/м2с и оно составляло 30 цЕ/м2с для клеток с сульфатом меди (5 ■ 10-5 М).
Рис. Изменения параметров флуоресценции в зависимости от интенсивности действующего света в суспензии клеток водорослей Scenedesmus quadricauda под воздействием СиБ04. Время инкубации 1 сутки:
A — квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в фотосистеме 2 как отношение Y = (Fm' - Ft)/Fm'; B — относительная скорость нециклического электронного транспорта; C — нефотохимическое тушение NPQ = (Fm/F'm) - 1. (1) — контроль, (2), (3) — после добавления Сив04
-5 -5
в концентрациях 210 М и 510 М соответственно
Таблица
Изменение параметров световых зависимостей флуоресценции клеток Scenedesmus диаЫпоаиЫа в контроле и после добавления CuSO4 и наночастиц серебра (нч Ag) (суточная инкубация)
Параметры световых кривых Контроль 10-5 М СиБ04 210-5 М СиБ04 510-5 М СиБ04 10-5 М нч Ад 510-5 М нч Ад
Fv/Fm 0,66 0,67 0,48 0,31 0,61 0,37
NPQ 25 2 (при ц Е/м с) 0,13 0,13 0,12 0,17 0,23 0,17
ЫРО 2 (при 400 цЕ/м с) 0,74 0,63 0,56 0,44 0,65 0,49
'^тах (отн. ед.) 52,4 49,8 24,1 8,2 47 28,2
а, угол наклона 0,21 0,21 0,14 0,07 0,20 0,1
2 Ен, (цЕ/м с) 249 237 172 117 210 120
Fv/Fm — параметры проб в темноте; NPQ — нефотохимическое тушение; ФС 2. Параметры, описывающие зависимость электронного транспорта (rETR) от освещенности (световые кривые): максимальная относительная скорость нециклического транспорта электронов (rETRmax), коэффициент максимальной утилизации световой энергии, угол наклона световой кривой (а) и насыщающая интенсивность света (Ен).
На основании параметра У можно рассчитать относительную скорость нециклического электронного транспорта (ЕТК) при умножении интенсивности освещения на коэффициент У. На рисунке (см.) представлены световые зависимости относительного ЕТЯ водорослей в присутствии меди. В таблице (см.) приведены параметры, описывающие эти зависимости фотосинтетического электронного транспорта от освещенности: коэффициент максимальной утилизации световой энергии, угол наклона на линейном участке световой кривой (а), максимальная относительная скорость электронов по электрон транспортной цепи (ЕТЯтах) и насыщающая интенсивность света (Ен). После обработки сульфатом меди наблюдалось снижение параметра ЕТЯтах и коэффициента максимальной утилизации световой энергии (а). Насыщающая интенсивность света (Ен) для контрольных водорослей составляла 249 цЕ/м2с. Для клеток, обработанных сульфатом меди в концентрациях 2 • 10-5 М и 5 • 10-5 М, значения составляли 172 и 117 цЕ/м2с соответственно.
Снижение квантового выхода фотохимии ФС 2 -У при увеличении освещенности у водорослей связано с увеличением тепловой диссипации сброса избыточной световой энергии, когда энергия не способна утилизироваться в световых реакциях. Этот процесс отражается в развитии нефотохимического тушения флуоресценции на действующем свету и рассчитывается по формуле NPQ = (Ет/Е Ш) - 1 [11]. При низкой интенсивности освещения значение нефотохимического тушения ОТР незначительно увеличивалось у клеток в присутствии с сульфатом меди (рис.). Однако при высокой освещенности наблюдалось ингибирование параметра NPQ в присутствии меди, который влияет на электрохимический градиент протонов, связанный с синтезом АТФ. Нефотохимическое тушение флуоресценции в образце с сульфатом меди полностью подавлялось присутствием меди, что соответствует действию метиламина (10-3 М), который является разобщителем фосфори-лирования в тилакоидных мембранах.
Следует отметить, что при высоких интенсивностях света у обработанных токсикантами водорослей наблюдается процесс фотоингибирования электронного транспорта, что свидетельствует о повышении светочувствительности этих водорослей (см. рис.). Ранее нами отмечалось влияние светового фактора на развитие токсического эффекта для солей меди и ртути [2; 7].
Результаты исследования показывают, что токсикологический эффект действия солей меди и наночастиц серебра на водоросли выявляется по потенциальной активности ФС 2 (параметр Еу/Ет) и измерению быстрых световых зависимостей параметров флуоресценции. По характеристикам световых кривых возможно оценить коэффициент максимальной и минимальной утилизации световой энергии, относительную скорость электронов по фотосинтетической цепи электрон транспортной цепи (ЕТЯтах) и диапазон насыщающих фотосинтез интенсивностей света. При этом световые зависимости параметров флуоресценции позволяют выявить состояния водорослей раньше и в большей степени по таким параметрам как максимальная относительная скорость электронов и насыщающая интенсивность света электронного транспорта при повышенных интенсивностях света в отличие от показателя Еу/Ет.
Таким образом, измерение быстрых световых зависимостей параметров флуоресценции может быть весьма эффективно использовано для диагностики влияния солей тяжелых металлов на водоросли, а также для раннего диагностирования появления этих загрязнений в среде.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. — М.: Природа, 2002.
[2] Тунгатарова Д.И., Венедиктов П.С. Действие токсических загрязнений на характеристики флуоресценции хлорофилла водорослей // Обзор. ВИНИТИ. 2008.
[3] Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. ФР.1.39.2007.03223 / Н.С. Жмур, Т.Л. Орлова. — М.: Акварос, 2007.
[4] Методика измерений обилия и индикации изменения состояния фитопланктона в природных водах флуоресцентным методом / Маторин Д.Н., Осипов В.А., Рубин А.Б. и др. ФР.1.39.2011.11246, ПНДФ14.2.268-2012. — М.: Альтрекс, 2012.
[5] Vavilin D.V., Polynov V.A., Matorin D.N., Venediktov P.S. Sublethal concentrations of copper stimulate photosystem II photoinhibition in Chlorella pyrenoidosa // J Plant Physiol. 1995. V. 146. Р. 609—614.
[6] Juneau P., Berdey A.El., Popovic R. PAM Fluorometry in the determination of the sensitivity of Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum, and Chlamydomonas reinhardtii to copper // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002. V. 42. Р. 155—164.
[7] Brack W., FrankH. Chlorophyll a fluorescence: a tool for the investigation of toxic effects in the photosynthetic apparatus // Ecotoxicology and Environmental Safety. 1998. V. 40. № l—2. P. 34—41.
[8] Stohs S.J., Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions // Free Rad. Biol. Med. 1995. V. 18. Р. 321—336.
[9] Schreiber U. (2004) Pulse-Amplitude (PAM) fluorometry and saturation pulse method // In: Papageorgiou G and Govindjee (eds) Chlorophyll fluorescence: A signature of Photosynthesis, Springer, Dordrecht, The Netherlands. P. 279—319.
[10] Маторин Д.Н., Рубин А.Б. Флуоресценции хлорофилла высших растений и водорослей. — М.; Ижевск: ИКИ-РХД, 2012.
[11] Маторин Д.Н., Осипов В.А., Сейфуллина Н.Х., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Усиление токсического действия метилртути на микроводоросли Chlorella vulgaris в условиях светового и холодового стресса // Микробиология. 2009. Т. 78. № 3. С. 362—368.
LITERATURA
[1] Rukovodstvo po opredeleniyu metodom biotestirovaniya toksichnosti vod, donnyx otlozhenij, zagryaznyayushhix veshhestv i burovyx rastvorov // Ministerstvo prirodnyx resursov RF RE'FIA. NIA. — M.: Priroda, 2002.
[2] Tungatarova D.I., Venediktov P.S. Dejstvie toksicheskix zagryaznenij na xarakteristiki fluo-rescencii xlorofilla vodoroslej // Obzor. VINITI. 2008.
[3] Metodika opredeleniya toksichnosti vod, vodnyx vytyazhek iz pochv, osadkov stochnyx vod i otxodov po izmeneniyu urovnya fluorescencii xlorofilla i chislennosti kletok vodoroslej. FR. 1.39.2007.03223 / N.S. Zhmur, T.L. Orlova. — M.: Akvaros, 2007.
[4] Metodika izmerenij obiliya i indikacii izmeneniya sostoyaniya fitoplanktona v prirodnyx vodax fluorescentnym metodom / Matorin D.N., Osipov V.A., Rubin A.B. i dr. FR.1.39.2011.11246, PNDF14.2.268-2012. — M.: Al'treks, 2012.
[5] Vavilin D. V., Polynov V.A., Matorin D.N., Venediktov P.S. Sublethal concentrations of copper stimulate photosystem II photoinhibition in Chlorella pyrenoidosa // J Plant Physiol. 1995. V. 146. P. 609—614.
[6] Juneau P., Berdey A.El., Popovic R. PAM Fluorometry in the determination of the sensitivity of Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum, and Chlamydomonas reinhardtii to copper // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002. V. 42. P. 155—164.
[7] Brack W., Frank H. Chlorophyll a fluorescence: a tool for the investigation of toxic effects in the photosynthetic apparatus // Ecotoxicology and Environmental Safety. 1998. V. 40. № l—2. P. 34—41.
[8] Stohs S.J., Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions // Free Rad. Biol. Med. 1995. V. 18. P. 321—336.
[9] Schreiber U. (2004) Pulse-Amplitude (PAM) fluorometry and saturation pulse method // In: Papageorgiou G and Govindjee (eds) Chlorophyll fluorescence: A signature of Photosynthesis, Springer, Dordrecht, The Netherlands. P. 279—319.
[10] Matorin D.N., Rubin A.B. Fluorescencii xlorofilla vysshix rastenij i vodoroslej. — M.; Izhevsk: IKI-RXD, 2012.
[11] Matorin D.N., Osipov V.A., Sejfullina N.X., Venediktov P.S., Rubin A.B. Usilenie toksicheskogo dejstviya metilrtuti na mikrovodorosli Chlorella vulgaris v usloviyax svetovogo i xolodovogo stressa // Mikrobiologiya. 2009. T. 78. № 3. S. 362—368.
THE STUDY OF THE TOXICITY OF COPPER SULFATE AND SILVER NANOPARTICLES USING THE FLUORESCENCE OF ALGAE SCENEDESMUS QUADRICAUDA
D.A. Todorenko1, D.N. Matorin1, A.A. Alekseev1, D.I. Tungatarova1, V.S. Orlova2
'Department of Biophysics Faculty of Biology Lomonosov Moscow State University Lenin Hills, 1, korp. 42, Moscow, Russia, 119992
2Ecological Faculty Peoples' Friendship University of Russia
Podolskoye shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093
This paper discusses changes in fluorescence parameters of the photosynthetic apparatus of algae Sce-nedesmus quadricauda induced by copper sulfate and silver nanoparticles. It is shown that the light dependence curve of the photochemical and nonphotochemical fluorescence quenching can be used as a highly sensitive test to detect changes during the early stages of the impact of heavy metals on the algae.
Key words: Scenedesmus quadricauda, copper sulfate, silver nanoparticles, chlorophyll fluorescence, photosynthesis, ecology.
