CC BY
171
УДК 634.986: 615.7
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ГЕКСАНОВОГО ЭКСТРАКТА БЕРЕСТЫ И ЕГО ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
© С.А. Кузнецова1, Б.Н. Кузнецов1, О.Ф. Веселова2, Т.П. Кукина3, Г.С. Калачева4, Г.П. Скворцова1,
Е.С. Редькина1
1 Институт химии и химической технологии CO РАН, Красноярск,
Академгородок, 660036 (Россия) E-mail: [email protected]
2Красноярская государственная медицинская академия, Красноярск (Россия)
3Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, ул. Лаврентьева, 9, Новосибирск (Россия)
4Институт биофизики СО РАН, Красноярск (Россия)
Изучены состав и биологическая активность гексанового экстракта бересты. Используя хромато-масс-спектрометрию, показано, что основными компонентами экстракта бересты являются бетулин и лупеол, в небольших количествах содержатся альдегиды бетулина и лупеола и другие вещества лупанового ряда. Установлено, что экстракт бересты относится к 4му классу малотоксичных веществ и обладает выраженными капилляроукрепляющими свойствами.
Введение
Кора березы содержит разнообразные экстрактивные вещества, обладающие биологической активностью и представляющие потенциальный интерес для получения новых продуктов и фармакологических препаратов [1-3]. В экстрактах внешней коры различных видов берез преобладают пентациклические тритерпенои-ды ряда лупана, основным компонентом которых является бетулин, обусловливающий белый цвет коры березы. Содержание бетулина во внешней коре варьируется от 10 до 40% в зависимости от вида березы, места и условий ее произрастания, возраста дерева, сезона [4-6].
В последнее время проводятся интенсивные исследования биологических свойств бетулина и его производных. Известна противовирусная, противоопухолевая активность и противовоспалительные свойства производных бетулина и лупеола [7-10], однако недостаточно изучены состав и биологические свойства экстрактов бересты.
Цель работы - изучение состава гексанового экстракта бересты и его токсико-фармакологических свойств.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали бересту березы Betula pendula Roth., заготовленную в районе Красноярска.
Для получения гексанового экстракта бересты (ГЭБ) измельченную до фракции 1-2 мм и высушенную при температуре 105 °С бересту подвергали экстракции гексаном в аппарате Сокслета в течение 36-40 ч. После удаления гексана на роторном испарителе получили порошок белого цвета.
Был проведен анализ гексанового экстракта бересты (ГЭБ) методами тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии (ХМС). Тонкослойная хроматография была проведена по стандартной методике [11].
Для ХМС в первом варианте была подготовлена проба путем очистки экстракта от свободных и связанных кислот, упаривания и растворения сухого остатка в этилацетате. Во втором варианте был проведен анализ гексанового экстракта методом ХМС без пробоподготовки растворением в смеси хлороформа и метано-
* Автор, с которым следует вести переписку.
ла (1 : 1 по объёму). Качественный и количественный состав продуктов исследовался на хромато-масс-спектрометре GCD Plus (Hewlett Packard, USA) с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора, с газовым хроматографом. Была использована капиллярная колонка длиной 30 м, внутренним диаметром
0,25 мм HP-5MS (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан). Условия хроматографирования были следующими: в качестве газа-носителя использовали гелий; скорость потока составляла 1 мл/мин; температура ввода образца 250 °C; начальная температура 220 °C, программа подъема температуры до 280 °С со скоростью 2 °С/мин, изотермальный режим - 2 мин, подъем температуры до 300 °С со скоростью 10 °С /мин, изотер-мальный режим - 20 мин; температура трансферной линии 280 °C, источника ионов - 175 °C, режим электронного удара при 70 eV, детекция масс от 45 до 450 m/z.
Идентификация компонентов осуществлена сопоставлением времён удерживания пиков на хроматограмме и полных масс-спектров отдельных компонентов с соответствующими данными чистых соединений библиотеки масс-спектров. Относительное количественное содержание химических компонентов экстракта рассчитано методом внутренней нормализации площадей пиков без корректирующих коэффициентов чувствительности.
Обсуждение результатов
Основной фракцией гексанового экстракта являются два тритерпеноида: бетулин и лупеол. Структурные формулы бетулина и лупеола представлены на рисунке 1.
Хроматограмма нейтральных компонентов гексанового экстракта бересты (ГЭБ) после предварительной пробоподготовки представлена на рисунке 2. Установлено, что нейтральные компоненты гексанового экстракта бересты содержат 88,3% бетулина, 9,6% лупеола и 2 неидентифицированных компонента, общим содержанием 1,9%, хроматограмма на рисунке 2. Свободные кислоты, составляющие 1,3% от массы исходного образца, содержат до 5% олеаноловой кислоты.
Хроматограмма гексанового экстракта бересты без пробоподготовки представлена на рисунке 3. Относительное содержание бетулина в данном случае составляет 59,4%. Идентификация бетулина при сравнении с базой данных библиотеки масс-спектрометра была проведена с хорошей вероятностью. Основным ионом, совпадающим с его молекулярной массой, является m/z 442. Идентифицирующим фрагментом, который получается при отщеплении спиртовой группы в положении 28, является фрагмент с m/z 411. Характер фрагментации исследуемого вещества (m/z 69, 81, 95, 107, 189, 207) явно свидетельствует о принадлежности данного соединения к лупановому ряду. Другим идентифицированным соединением является лупеол, с молекулярной массой 426, относительное содержание которого в ГЭБ составляет 32%. При отщеплении ме-тильной группы в положении 28 образуется фрагмент с m/z 411, кроме него идентифицированы фрагменты лупеола с m/z 69, 81, 95, 107, 189, 207.
В таблице 1 приведены идентифицированные соединения гексанового экстракта бересты без предварительной пробоподготовки. Кроме бетулина и лупеола, в экстракте присутствуют другие соединения лупано-вого ряда и фитостерины, относительное содержание которых составляет от 0,6 до 2,5%. Среди минорных примесей были идентифицированы по масс-спектрам альдегиды бетулина и лупеола с молекулярной массой 440 и 424 соответственно (пики 4 и 5 на рис. 3), p-ситостерол с молекулярной массой 414. Компоненты с молекулярной массой 426, вероятно, являются изомерами лупеола (пики 3, 6 и 7 на рис.3). Фрагментация этих соединений характерна для тритерпенов лупанового ряда, в их спектрах обнаруживаются фрагменты с m/z 95, 81, 69, 107, 189, 207 и 411.
CH2
II
CH2
II
h3c—С
H3C—С,
CH2OH
'СН3
HO'
HO'
Н3С^ XH3
H3^ XH3
(А)
Рис. 1. Структурные формулы бетулина (А) и лупеола (Б)
(Б)
50.00 55.00 60.00 <5.00 10.00 75.00 80.00 «5.00 90.00
Время, МИН
5
Ер ЄМЯ, МИН
Рис. 2. Хроматограмма гексанового экстракта Рис. 3. Хроматограмма гексанового экстракта
бересты после предварительной пробоподготовки бересты без пробоподготовки
1 - неидентифицирован; 2 - р-ситостерол;
3, 6, 7 - изомеры лупеола, 4 - альдегид лупеола, 5 - лупеол; 8 - альдегид бетулина; 9 - бетулин
Таблица 1. Относительное содержание основных компонентов гексанового экстракта бересты
Компонент М+ Процент от суммы
Бетулин 442 59,4
Лупеол 426 31,7
Р-ситостерол 412 0,6
Изомер лупеола 426 1,4
Альдегид лупеола 424 2,4
Изомер лупеола 426 0,7
Изомер лупеола 426 0,8
Альдегид бетулина 440 2,5
Фитостерин 426 0,7
Изучение токсико-фармакологических свойств экстракта бересты
По данным Ю.К. Василенко с соавторами, бетулин является малотоксичным веществом, однако в работе не приводятся точные цифры ЛД50 [12]. Нами была изучена острая токсичность гексанового экстракта бересты по методике Ю.И. Иванова и О.Н. Погорелюка [13] на группах линейных белых мышей обоего пола. ГЭБ вводили внутрижелудочно в виде 10% крахмальной взвеси в дозах от 1000 до 7000 мг/кг. Токсичность оценивали по клиническим симптомам отравления и выживаемости животных в течение 2-х недель. Показатели острой токсичности ГЭБ и бетулина приведены в таблице 2. При внутрижелудочном введении ГЭБ в дозах от 1000 до 6000 мг/кг гибели животных не отмечено, у животных наблюдалось только незначительное угнетение центральной нервной системы (ЦНС). При введении ГЭБ в дозе 7000 мг/кг отмечена гибель части животных, в картине острого отравления наблюдалось нарушение дыхания и снижение двигательной активности.
Проведенное токсикологическое исследование показало, что гексановый экстракт бересты не является ядовитыми и согласно международной токсикологической классификации относится к 4-му классу малотоксичных веществ.
Повышение проницаемости сосудистой стенки, в том числе и капилляров, является одним из патогенетических этапов вирусных, бактериальных, аллергических, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний. Следовательно, изыскание веществ растительного происхождения, обладающих высокой капилляро-протекцией и при этом практически не токсичных для организма, позволит улучшить патогенетическое лечение очень многих заболеваний.
Таблица 2. Основные показатели острой
токсичности гексанового экстракта бересты
Вещество Показатели токсичности, мг/кг
ЛД16 ЛД50
ГЭБ 5750 >7000
Изучение влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи проводили по методу Ойвина и Монаковой на группах линейных белых мышей массой 15-17 г. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода 1% водного метиленового синего в очаг воспаления, вызываемого нанесением на депили-рованную поверхность кожи 0,05 мл ксилола [14].
Опытным группам мышей (по 15 животных в каждой) за 1 ч до внутрибрюшинного введения 0,25 мл 1% раствора метиленового синего внутрижелудочно вводили исследуемые вещества в дозе 200 и 400 мг/кг в виде 1% спиртового раствора. Контрольной группе мышей за час до введения раствора метиленового синего вводили этиловый спирт. Регистрировали время выделения метиленового синего в очаге воспаления. Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с применением программы Excel. Для оценки статистической достоверности различий сравниваемых средних величин использовали критерий Стъюдента [15].
Результаты изучения влияния ГЭБ и бетулина на проницаемость сосудов кожи мышей представлены в таблице 3. Эталоном сравнения служил дигидрокверцетин (ДКВ), капилляроукрепляющий эффект которого известен [16].
В контрольной группе животных время выхода метиленового синего составило 14,7±1,5 сек, тогда как в опытных группах мышей, получающих ГЭБ, время выхода метиленового синего оказалось достоверно большим и составило 23,7±3,4 сек, что свидетельствует о проявлении данным экстрактом капилляроукрепляющего эффекта. При этом у ГЭБ обнаружено дозозависимое влияние на проницаемость сосудов, так как при введении мышам дозы 400 мг/кг капилляроукрепляющий эффект существенно выше, чем при введении дозы 200 мг/кг. На основании проведенных исследований выявлено, что ГЭБ проявляет выраженный капилляроукрепляющий эффект, сопоставимый с дигидрокверцетином.
Таблица 3. Влияние ГЭБ на проницаемость сосудов кожи мышей
Вещество Доза, мг/кг Время выхода метиленовой сини, сек* Капилляроукрепляющий эффект, разница в % от контроля
Контроль - 14,7±1,5 -
200 23,7±3,4 60,5
ГЭБ 400 29,8±4,2 102,7
ДКВ 100 21,5±2,6 33,9
300 25,4±2,8 77,7
*р<0,05 по отношению к контролю Выводы
Изучен химический состав гексанового экстракта бересты березы с использованием хромато-масс-спектрометрии: идентифицированы бетулин, лупеол, альдегиды бетулина и лупола и ситостерол.
Установлено, что гексановый экстракт бересты не является ядовитым и, согласно международной токсикологической классификации, относится к 4 классу малотоксичных веществ. Среднесмертельная доза (ЛД50) гексанового экстракта бересты составляет более 7000 мг/кг.
Показано, что ГЭБ проявляет выраженную дозозависимую капилляроукрепляющую активность, сопоставимую с дигидрокверцетином.
Список литературы
1. Кузнецов Б.Н., Рязанова Т.В., Щипко М. Л., Кузнецова С.А. и др. Оптимизация термических и биохимических методов утилизации отходов экстракционной переработки березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 441-449.
2. Кузнецова С.А., Левданский В.А., Кузнецов Б.Н., Щипко М.Л. и др. Получение дубильных веществ, красителей и энтеросорбентов из луба березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 401409.
3. Кузнецов Б.Н., Кузнецова С.А., Левданский В.А., Судакова И.Г., Веселова О.Ф. Совершенствование методов выделения, изучение состава и свойств экстрактов березовой коры // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 391-400.
4. Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение // Химия древесины. 1994. № 3. С. 3-28.
5. Ukkonen F.K., Era V.P. Birch bark extractives // Kemia-Kemi. 1979. №5. С. 217-220.
6. Похило Н.Д., Уварова Н.И. Изопреноиды различных видов betula // Химия природных соединений. 1988. №3.
С. 325-341.
7. Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. Т. 13. С. 1-30.
8. Флехтер О.Б., Медведева Н.И., Карачурина Л.Т., Балтина Л.А. и др. Синтез и фармакологическая активность эфиров бетулина, бетулиновой кислоты и аллобетулина // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т. 39. №8. С. 9-13.
9. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р., Павлова Н.И. и др. Синтез и противовирусные свойства производных лупановых тритерпеноидов // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. №8. С. 10-13.
10. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А., Толстиков А.Г., Флехтер О.Б. Терпеноиды ряда Лупана -
биологическая активность и фармакологические перспективы // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. №1.
С. 42-55.
11. Кейтц М. Техника липидологии. М., 1975. 322 с.
12. Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы // Экспериментальная и клиническая фармаколология. 1993. Т. 56. №4. С. 53-55.
13. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Вычисление эффективных и летальных доз методом наименьших квадратов на микрокалькуляторах по программам // Фармакология и токсикология. М., 1986. 9 с.
14. Патент РФ № 2014841 Антиоксидантное, капилляропротекторное, противовоспалительное и антигистаминное средство / Соколов С.Я., Тюкавкина Н.А., Колхир В.К. // БИ. 1994. №12.
15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1980. 296 с.
16. Патент Р.Ф. № 2045957. Способ получения средства, обладающего противоязвенным действием / Пашинский В.Г., Чучалин В.С., Рапп О. А. // БИ. 1995. №29
Поступило в редакцию 15 марта 2007 г.
После переработки15 января 2008 г.
