CC BY
73
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2005 Биология Вып. 6
Микробиология
УДК 579.262:57.083.1д
ИЗУЧЕНИЕ СООБЩЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РАЙОНА СОЛЕРАЗРАБОТОК
Л. Н. Ананьина3, О. В. Алтынцева3, Е. Г. Плотникова3,1*
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Из района солеразработок выделено сообщество микроорганизмов, способное к эффективному росту на нафталине в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии до 9% хлорида натрия. Микробная ассоциация состоит из 7 штаммов бактерий, которые предварительно определены до родов: Шо<1ососсж, Ое1еуа, АциаяртИит, АнИгоЬааег и М1сгоЬас1егшт. Два штамма рода ЛкоЛососст способны осуществлять разложение нафталина. Исследовано влияние минерализации среды на качественный состав микробного сообще-
ства.
Введение
В настоящее время остро стоит проблема очистки окружающей среды от полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Соединения этого класса обладают канцерогенным, мутагенным, токсичным эффектами и способны к аккумуляции природными объектами (Kanaly, Harayama, 2000). Существенный вклад в загрязнение почв и водоемов ПАУ вносят предприятия химической промышленности. В литературе описаны микроорганизмы и микробные сообщества, способные к эффективной деструкции нафталина, фенантрена и ряда других ПАУ (Пунтус и др., 1997; Суровцева и др., 1997; Плотникова и др., 2001; Бабошин и др., 2003; Boldrin et al., 1993). Такие штаммы-деструкторы и их ассоциации используются в биотехнологиях восстановления загрязненных территорий (Boonchan et al., 2000; Kanaly et al., 2000).
В ряде случаев почвенные и водные экосистемы, загрязненные ПАУ, подвергаются воздействию других неблагоприятных факторов, в частности, влиянию повышенной концентрации солей. Повышенное содержание солей в почвах ограничивает применение для их очистки биопрепаратов, содержащих штаммы микроорганизмов, неадаптированных к экстремальным условиям существования (Ward, Brock, 1978; Kastner et al., 1998; Hamme et al., 2003). Следовательно, особый интерес вызывает изучение микроорганизмов и их сообществ, способных к деструкции ПАУ, выделенных из экониш с высоким уровнем загрязнения и повышенным содержанием солей (Geiselbrecht et al., 1996; Hedlund et al., 1999; Chung, King, 2001).
Цель настоящего исследования - выделение и изучение сообщества микроорганизмов, перспек-
тивного для использования в биоремедиации высокоминерализованных почв, загрязненных ПАУ.
Методы исследования
Выделение микробного сообщества и штаммов бактерий. Образец почвы был отобран с глубины 5-10 см на расстоянии 10 м от солеот-вала (г. Березники, Пермский край). Для получения накопительной культуры 1 г почвы вносили в колбу (объем 250 мл), содержащую 100 мл минеральной среды Раймонда (Розанова, Назина, 1982), нафталин (0.1%), №С1 (6%) и инкубировали на термостатируемой качалке. УВМТ-12-250 при 100 об ./мин. и 28°С до появления микробного роста. Сообщество микроорганизмов выделяли путем многократных пересевов накопительной культуры и культивирования при вышеперечисленных условиях. Чистые культуры микроорганизмов выделяли на полноценной агаризованной среде Раймонда в присутствии 3% №С1 (Плотникова и др., 2001).
Динамика роста сообщества микроорганизмов и штаммов бактерий. Сообщество микроорганизмов и штаммы-деструкторы выращивали в колбах (объем 250 мл) в 100 мл минеральной среды Раймонда в присутствии разных (3%, 6%, 7.5%) концентраций ЫаС1 и без соли, с нафталином (0.1%) в качестве единственного источника углерода и энергии на качалке УВМТ-12-250 (100 об./мин.) при 28°С. Измерение оптической плотности (СЮ) проводили на ФЭК-5 6М с длиной волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 0.5 см.
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний микроорганизмов на чашках с полноценной средой Раймонда в присутствии 3% №01.
© JI. Н. Ананьина, О. В. Алтынцева, Е. Г. Плотникова, 2005
109
Идентификация чистых культур бактерий.
Морфологию и подвижность клеток исследовали с помощью световой микроскопии (микроскоп Ьеюа БМ ЬБ, укомплектованный фазово-контрастным устройством).
Изучение физиолого-биохимических и хемо-таксономических признаков проводили согласно ранее описанным рутинным методам (Методы общей бактериологии, 1983; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Способность к росту микроорганизмов в присутствии разных концентраций хлорида натрия определяли при культивировании на полноценной модифицированной среде Раймонда (см. выше). Идентификацию выделенных штаммов проводили на основе морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических характеристик с использованием “Определителя бактерий Берджи” (1997).
Результаты исследований и обсуждение
Выделение микробного сообщества и идентификация штаммов бактерий
Из высокоминерализованной и загрязненной отходами химических предприятий почвы методом накопительных культур изолировано микробное сообщество, обозначенное СМБ-3. Установлено, что состав сообщества сохраняется в течение 15-20 последовательных пересевов на селективные среды.
Эксперименты по выращиванию микробного сообщества на агаризованных и в жидких мине-
ральных средах показали, что СМБ-3 способно к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии при высоких концентрациях соли (до 9 % №С1 в среде культивирования).
Путем высева на агаризованную полноценную среду, содержащую 3% №С1, обнаружено семь различающихся по морфологии колоний штаммов бактерий, которые были отобраны для дальнейших исследований.
Грамположительные штаммы, обозначенные БЗ-7 и БЗ-8, представлены бледно-розовыми матовыми колониями, в молодых культурах преобладают неправильные удлиненные палочки или гифы, распадающиеся с возрастом на короткие палочковидные фрагменты и кокки (рис. 1, В). Штамм БЗ-7 на агаризованной среде образует субстратный мицелий. В гидролизатах целых клеток обоих штаммов присутствует л»езо-диаминопиме-линовая кислота. У штаммов выявлены миколовые кислоты, идентичные таковым у представителей рода Шойососст. По перечисленным выше признакам штаммы отнесены к данному роду.
Из микробного сообщества выделены штаммы, способные к эффективному росту на полноценной среде Раймонда в присутствии до 29% хлорида натрия. Штаммы обозначены как БЗ-1 и БЗ-5 (таблица). Исследуемые индивидуальные культуры на полноценной среде образуют округлые, выпуклые, с ровным краем колонии палевого (штамм БЗ-1) и желтого (штамм БЗ-5) цвета. Клетки штаммов представляют собой грамотрицатель-ные, оксидазоотрицательные, каталазоположи-тельные подвижные палочки (рис. 1, А, Б).
Рост бактериальных культур из микробного сообщества БЗ в присутствии различных концентраций хлорида натрия
Штамм Полноценная среда Раймонда, % концентрации КаС1 Минеральная среда Раймонда с нафталином, % концентрации №С1
0 3 8 10 17 29 0 7.5 8 9
БЗ-1 — +++ +++ Г~-н-+ +++ + — — — —
БЗ-2 +++ +++ +++ + - - - - - -
БЗ-З +++ +++ +++ +++ - - — — — -
БЗ-4 +++ +++ -Н-+ - - - — — — —
БЗ-5 ++ +++ +++ +++ +++ + - — - —
БЗ-6 "Н"~Ь +++ +++ - - - - — — -
БЗ-7 +++ +++ +++ + - - +++ + - -
БЗ-8 +++ +++ +++ + - - +++ +++ +++ +
- нет роста, “+ - +++” - степень выраженности роста
Рис. 1. Морфология клеток: А - штамм БЗ-1, Б - штамм БЗ-5, В - штамм БЗ-8. Фазово-контрастный микроскоп. А, Б- увеличение х 1500, В - увеличение х 1 ООО
Установлено, что бактерии не образуют сероводород, не гидролизуют желатину, не восстанавливают нитрат до нитрита, не осуществляют процесс денитрификации. Для них характерен метаболизм дыхательного типа. Штамм БЗ-1 образует кислоту из сахарозы, глюкозы, инозита, маннита, сорбита, глицерина, образует фенилаланиндезаминазу. Штамм БЗ-5 гидролизует мочевину, образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, глицерина. На основе физиологических и биохимических признаков исследуемые микроорганизмы могут быть отнесены к роду Ое1еуа (Определитель бактерий Берджи, 1997).
Грамотрицательный штамм БЗ-4 растет при концентрации 8% №С! в культуральной среде (таблица). Штамм образует округлые, блестящие, гладкие, с ровным краем колонии бежевого цвета. Клетки представляют собой каталазо-, фосфатазо-и оксидазоположительные, изогнутые, подвижные
палочки. Штамм утилизирует ограниченное количество углеводов. На основе вышеперечисленных признаков штамм предварительно отнесен к роду АциазртИит. Изолированный нами штамм представляет интерес, так как для рода АдиаьртПит не описаны представители, способные расти при концентрации выше 3% НаС1 в среде культивирования (Определитель бактерий Берджи, 1997).
Грамположительная культура БЗ-2 образует округлые, выпуклые, с ровным краем, белые, желтеющие на свету колонии. Клетки каталазополо-жительные, оксидазоотрицательные, неспорули-рующие палочки неправильной формы, на стационарной фазе преобладают кокки. Метаболизм дыхательного типа. Денитрификацию, восстановление нитрата до нитрита не осуществляет. Гидроли-зует желатину и крахмал. В клеточной стенке ми-коловые кислоты не обнаружены. Штамм определен как АпЪгоЬаМег эр.
Грамположительная культура БЗ-З образует округлые, выпуклые, светло-зеленые колонии. Клетки каталазоположительные, оксидазоотрица-тельные, не образующие споры подвижные палочки. Метаболизм дыхательного типа. Денитрификацию, восстановление нитратов до нитритов, гидролиз желатины и крахмала не осуществляет. В клеточной стенке нет миколовых кислот. Штамм предварительно идентифицирован как М1сгоЬас1г-гтт ер.
Характеристика роста микробного сообщества и индивидуальных штаммов в присутствии различных концентраций №С1
Нами установлено, что лишь два штамма {Югойососсиз Бр. БЗ-7 и БЗ-8) из микробного сообщества способны к росту на нафталине как единственном источнике углерода и энергии. Штаммы используют нафталин в качестве субстрата в отсутствии и в присутствии хлорида натрия: штамм БЗ-7 - до 7.5 %, штамм БЗ-8 - до 9 % (таблица). Сопутствующие бактериальные штаммы (БЗ-1, БЗ-2, БЗ-З, БЗ-4, БЗ-5) способны утилизировать ацетат.
Изучено влияние разных концентраций (от 3 до 7.5%) №С1 на характер роста микробного сообщества БЗ и штамма-деструктора Я1юс1осос-сий Бр. БЗ-7 (рис. 2, 3).
При росте СМБ-3 в среде с нафталином в качестве ростового субстрата максимальные значения оптической плотности наблюдались при культивировании в присутствии 3% №С1 и при отсутствии в среде соли (0.489 и 0.495, соответственно). Повышение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 6% и 7.5% приводило к увеличению продолжительности ^-периода и снижению оптической плотности (рис. 2).
ОД 540
Время, ч
Рис. 2. Динамика роста микробного сообщества БЗ в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях №С1: 1 - без соли, 2-3%, 3 -6%, 4-1.5%
При культивировании бактериального штамма Яко^соссиз ер. БЗ-7 в среде с нафталином в при-
сутствии разных концентраций соли наиболее высокое значение оптической плотности было зафиксировано при 3% ЫаС1, при этом отмечено отсутствие /а£-фазы. Этот факт можно объяснить тем, что инокулятом служила культура штамма БЗ-7, выращенная в минеральной среде Раймонда с содержанием МаС1 3%. В то же время описаны штаммы рода Шю<1ососси$, для которых концентрация 1-2% хлорида натрия оказывала стимулирующий эффект на рост (Плакунов и др., 1999). При увеличении концентрации хлористого натрия в среде до 6%, а также в отсутствии соли наблюдалось снижение оптической плотности культуры и увеличение продолжительности ^-периода. Изменение оптической плотности штамма-деструктора при культивировании в присутствии 7.5% ИаС1 было незначительным (рис. 3).
ОД 540
Время, ч
Рис. 3. Динамика роста М1о<1ососст эр. БЗ-7 в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях №С1: 1 - без соли, 2 - 3%, 3-6%, 4-1.5%
В опытах по подсчету колониеобразующих единиц исследован характер роста штамма-деструктора при культивировании в микробном сообществе и индивидуальной культуре. Наиболее высокое значение количества клеток штамма-деструктора зафиксировано в присутствии 3% ИаС1 (рис. 4). В отсутствии соли отмечено снижение значения КОЕ/мл. При культивировании сообщества и индивидуальной культуры штамма-деструктора БЗ-7 при 7.5% хлорида натрия наблюдалось значительное различие в значении КОЕ/мл: при культивировании штамма БЗ-7 в сообществе КОЕ/мл было на два порядка выше, чем при росте в индивидуальной культуре (рис. 4).
Нами было исследовано влияние минерализации среды на качественный состав сообщества микроорганизмов БЗ. Установлено, что в присутствии 3% и 6% соли в среде культивирования сохраняется состав СМБ-3 (7 штаммов). В отсутствии соли элиминируется штамм БЗ-1, а другой штамм БЗ-5 лишь незначительно увеличивает значение КОЕ/мл. В присутствии 7.5% ЫаС1 из сообщества элиминируется штамм БЗ-4 (рис. 5).
КОЕ/мл
,00Е+10
без соли
3%NaCl 7.5 % NaCl
Рис. 4. Максимальное количество клеток штамма Шюс1ососсш Бр. БЗ-7 при культивировании в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях №С1: А - индивидуальная культура, Б - клетки штамма в составе микробного сообщества
КОБУмл
1,00Е+11 -1,00Е+10 \
1.00Е+09 -I 1,00Е+08 1,00Е+07 1,00Е+06 1,00Е+05
БЗ-1 БЗ-2 Б3-3 БЗ-4 БЗ-5 БЗ-7 БЗ-8
Рис. 5. Максимальное количество клеток штаммов при росте в составе микробного сообщества в минеральной среде Раймонда на нафталине при разных концентрациях ЫаС1: А - без соли, Б -3%, В - 7.5%.
Заключение
Микробная ассоциация БЗ, выделенная из района солеразработок, включает в свой состав два штамма-деструктора рода Rhodococcus^. умеренно галофильный (Кашнер, 1981) штамм БЗ-1 и экстремально галотолерантный (Кашнер, 1981) штамм БЗ-5, предварительно отнесенные к роду Эе1еуа. Кроме того, из сообщества изолированы еще три галотолерантные бактериальные культуры, способные утилизировать ацетат. Установлено, что штамм-деструктор Шо<1ососсш эр. БЗ-7 растет менее эффективно на нафталине в присутствии 7.5% хлорида натрия, чем при культивировании в сообществе. Можно предположить, что бактерии-деструкторы в процессе разложения нафталина выделяют в культуральную среду метаболиты (например ацетат), которые используются в качестве субстратов сопутствующими бактериями. В свою очередь галофильные и галотолерантные микроорганизмы могут выделять в среду
культивирования осмопротекторные соединения, которые обеспечивают осмотический баланс клетки. К таким соединениям относятся аминокислоты и их производные, сахара и многоатомные спирты (Уе^оха, 1998). Упомянутые органические вещества могут поглощаться штаммами-деструкторами, что обусловливает их способность эффективно расти и осуществлять разложение нафталина в условиях высокой минерализации среды.
Работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 04-04-96042.
Библиографический список
Бабошин М.А., Финкелыитейн З.И., Головлева ЛА. Кометаболизм флуорена культурами Rhodococ-cus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens // Микробиология. 2003. Т. 72, № 2. С. 194-198.
Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, 1981. 365 с.
Методы общей бактериологии / Пер. с англ. Под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир, 1983. Т. 1-3.
Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб. пособие / Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: Изд-во МГУ, 1991.304 с.
Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ. Под ред. Дж. Хоулта и др. М.: Мир, 1997. Т. 1,2.
Плакунов В.К., Арзуманян ВТ., Воронина Н.А., Беляев С. С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. Т. 68, № 1.С. 40-44.
Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Кошелева И.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Гавриш Е Ю., Демаков В. А., Воронин А. М. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69.
Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А., Гаязов P.P., Карпов А.В., Воронин А.М. Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов // Микробиология. 1997. Т. 66, № 2. С. 269-272.
Розанова Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляю-щие бактерии и их активность в нефтяных пластах // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 324-348.
Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т 66, № 1. С. 78-83.
Boldrin В., Tiehm A., Fritzsche С. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoranthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59, № 6. P. 1927-1930.
Boonchan S., Britz M.L., Stanley G.A. Degradation and Mineralization of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by defined fun-
gal-bacterial cocultures // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66, № 3. P. 1007-1017.
Chung W.K., King G.M. Isolation, characterization, and polyaromatic hydrocarbon degradation potential of aerobic bacteria from marine macrofaunal burrow sediments and description of Lutibacterium anuloederans gen. nov., sp. nov., and Cycloclasti-cus spirillensus sp. nov. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67, № 12. P. 5585-5592.
Geiselbrecht A.D., Herwig R.P., Deming J. W., Staley J.T. Enumeration and phylogenetic analysis of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading marine bacteria from Puget Sound sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62, № 9. P. 3344-3349.
Hamme J.D., Singh A, Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67, № 4. P. 503-549.
Hedlund B.P., Geiselbrecht A. D., Bair T.J., Staley J.T. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a
new marine bacterium, Neptunomonas naphtho-vorans gen. nov., sp. nov. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65, № 1. P. 251-259.
Kanaly R. A., Harayama S. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria 11 J. Bacteriol. 2000. V. 182, № 8. P. 2059-2067.
Kastner М., Breuer-Jammali М., Mahro B. Impact of inoculation protocols, salinity, and pH on the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and survival of РАН-degrading bacteria introduced into soil // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, № 1. P. 359-362.
Ventosa A., Joaquhn J.N., Oren A. Biology of halo-philic aerobic bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62, № 2. P. 504.
Ward D. М., Brock T. D. Hydrocarbon biodegradation in hypersaline environments // Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 35, № 2. P. 353-359.
Поступила в редакцию 21.09.2005
The Study of Microbial Community Isolated From the Region of Salt Mining
L.N. Ananyina, O.V. Altynzeva, E.G. Plotnikova
The community of microorganisms capable of efficient growth on naphthalene as a sole carbon and energy source in the presence of up to 9% sodium chloride has been isolated from the region of salt mining. Microbial association consists of 7 bacterial strains that were preliminary referred to belong to genera Rhodococcus, Deleya, Aquaspirillum, Arthrobacter, and Microbacterium. Two strains of genus Rhodococcus are able to provide naphthalene degradation. The influence of medium mineralization on qualitative composition of microbial community has been studied.
